Name: 크기 및 패턴 유연성을 갖춘 표준 six-well plates의 혈관 투과성을 모델링하기 위한 High-throughput Bioprinting 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 배우세요 다중재료 3D 바이오프린팅을 활용한 고효율 혈관 채널 제작 방법입니다. 표준 6웰 플레이트와 컴퓨터 제어 3D 프린팅을 통합하여 재현성 높은 인체 혈관 모델을 제작하고 실시간 분석이 가능한 혈관 투과성 연구 플랫폼을 구축합니다.

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1. 바이오프린터용 G-code 생성
<ol><li>인쇄 경로를 생성하고 시각화하려면 온라인 G 코드 시뮬레이션 도구(예: NCviewer)를 방문하십시오.</li>
	<li>인터페이스에서 새 파일 아이콘을 클릭하여 새 G 코드 파일을 만듭니다.</li>
	<li>희생 채널과 실리콘 챔버에 대한 G 코드 명령을 수동으로 작성하여 인쇄 경로를 생성합니다. 표준 6웰 플레이트의 치수를 형상을 생성하기 위한 참조로 사용합니다. 참고: 여기에 사용된 G 코드는 CNC(Computer Numerical Control) 코드를 기반으로 합니다. 각 명령의 기능은 보충 표 S1에 제공되어 있습니다. 6웰 플레이트 형식은 상용 마이크로플레이트 리더 및 현미경 설정과의 호환성과 내피 성숙을 지원하기 위해 적절한 양의 배지를 수용할 수 있는 능력 때문에 선택되었으며, 이를 통해 빈번한 배지 교체의 필요성을 최소화했습니다. 이 제작 프로토콜은 다른 표준 웰 플레이트와 함께 사용하도록 조정할 수도 있습니다.</li>
	<li>G 코드가 완료되면 파일 저장 인터페이스에서 아이콘을 클릭하여 확장자가 .nc인 파일을 다운로드합니다. 알림: 사용 가능한 다른 G 코드 생성 알고리즘을 사용하여 인쇄 경로를 생성할 수 있습니다. 혈관 채널의 기하학적 구조는 이 G 코드에서 조작할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 희생 및 실리콘 챔버 잉크의 준비
참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료의 출처는 재료 표에 나열되어 있습니다.
<ol><li>두 가지 유형의 실리콘 폴리머인 SE1700과 폴리디메틸실록산(PDMS)을 10:2 비율로 결합합니다. 각 폴리머의 경화제를 10:1의 비율로, 폴리머 대 경화제로 추가합니다.</li>
	<li>유성 믹서를 사용하여 2,000rpm에서 폴리머 혼합물을 철저히 혼합하고 가스를 제거합니다.</li>
	<li>주걱으로 혼합된 실리콘 폴리머를 10mL 일회용 주사기에 옮깁니다. 로드된 주사기를 400× g 에서 5°C에서 3분 동안 원심분리하여 균일한 일관성을 보장하고 인쇄 중 기포를 방지합니다. 알림: 챔버 잉크는 최적의 인쇄 품질을 보장하기 위해 경화제를 첨가한 후 2시간 이내에 사용해야 합니다. 인쇄를 준비하는 동안 주사기를 5 °C에서 보관하십시오. 이 프로세스는 잉크 경화 속도를 늦추는 데 도움이 되며, 그렇지 않으면 인쇄 매개변수가 변경될 수 있습니다.</li>
	<li>Pluronic F-127(PF127)의 칭량으로 증류수에 PF127의 40%(w/v) 원액을 준비합니다.</li>
	<li>PF127 용액을 유성 믹서에서 400× g 에서 3분 동안 혼합하여 균질성을 얻습니다. PF127의 완전한 용해를 위해 균질화된 혼합물을 4°C로 유지하십시오.</li>
	<li>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에 1,000단위/mL의 트롬빈 원액을 준비합니다. 참고: 반복적인 동결-해동 주기를 피하기 위해 트롬빈 원액을 100μL 부분 표본에 보관하십시오. 부분 표본은 -20 °C에서 6개월 이상 보관하지 않아야 합니다.</li>
	<li>인쇄하기 전에 PF127과 1:10 희석하여 트롬빈을 PF127의 경우 36%(w/v), 트롬빈의 경우 100단위/mL의 최종 작업 농도로 혼합하여 희생 잉크를 준비합니다. 희생 잉크 1mL를 준비하려면 100μL의 트롬빈 원액과 900μL의 PF127 원액을 혼합합니다. 참고: 단일 플레이트를 인쇄하기 위해 희생 잉크를 준비할 때 총 부피는 1mL로 충분합니다.</li>
</ol>3. 제작 과정
<ol><li>제조 공정을 시작하기 전에 6웰 플레이트를 100와트 강도의 산소(O2) 플라즈마로 1분 동안 처리합니다.</li>
	<li>섹션 2에 설명된 절차에 따라 희생 잉크와 실리콘 잉크를 모두 준비하여 잉크에 기포가 없고 일관된 인쇄를 위해 균일하게 혼합되도록 합니다. 바이오프린터의 프린트 헤드에 잉크를 조심스럽게 로드합니다. 바이오프린터 헤드의 온도를 희생 잉크의 경우 37°C, 실리콘 잉크의 경우 5°C로 설정합니다.</li>
	<li>22G 이중 나사산 테이퍼 노즐을 실리콘 주사기에 부착합니다. 희생 잉크의 경우 원하는 채널 직경에 따라 노즐 크기를 선택하십시오. 참고: 여기에서는 18G, 20G 및 22G의 세 가지 크기의 노즐을 시연했습니다. 인쇄 압력 및 프린트 헤드 속도를 포함한 최적의 인쇄 매개변수는 표 1에 요약되어 있습니다.</li>
	<li>원하는 G 코드를 로드하고 바이오프린터의 소프트웨어 인터페이스에서 서보 준비 기능을 3초 동안 누릅니다. 스테이지에 플레이트를 놓습니다.tage G 코드의 시작점에서 시작 을 클릭하여 인쇄 프로세스를 시작합니다. 참고: 일반적으로 6개의 챔버가 포함된 플레이트 1개를 제작하는 데 약 1시간 10분이 소요되며, G 코드 로딩 및 실행과 관련된 3.4단계는 사용하는 특정 바이오프린터에 따라 달라질 수 있습니다. 오염을 방지하기 위해 바이오프린터를 사용하는 동안 멸균 상태가 유지되는지 확인하십시오.</li>
	<li>플레이트 위에 뚜껑을 덮고 플레이트를 37°C에서 72시간 동안 가습된 CO2 인큐베이터로 옮겨 실리콘 챔버를 경화합니다. 알림: 실리콘 경화는 인큐베이터 내부에서 더 느린 속도로 발생할 수 있지만 플레이트를 건조 오븐 내부에 두어서는 안 됩니다.</li>
</ol>4. 하이드로겔 준비 및 채널 임베딩
<ol><li>20mL의 1x PBS가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브를 준비합니다. 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP) 0.01g을 원추형 튜브에 넣어 0.05%(w/v) LAP 용액을 만듭니다. 분말이 완전히 녹을 때까지 소용돌이칩니다. 알림: 빛에 노출되지 않도록 원추형 튜브를 호일로 감쌉니다. LAP 원액을 4°C에서 보관합니다.</li>
	<li>젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 3g과 피브리노겐 0.2g을 LAP 용액 20mL에 첨가하여 15% GelMA와 1% 피브리노겐(GelFib이라고 함)의 최종 농도를 얻습니다. 혼합물을 37°C 수조에 넣고 용액이 완전히 용해될 때까지 주기적으로 와류 혼합물을 혼합합니다.</li>
	<li>섹션 3에 설명된 대로 제조 후 300μL의 예열된 GelFib를 각 하이드로겔 챔버에 추가하여 희생 패턴을 포함합니다. 120초 동안 85mW/cm2 의 강도로 405nm 파장의 자외선(UV)과 GelMA를 빠르게 교차 결합합니다. 다른 모든 웰에 대해 이 절차를 반복합니다. 참고: 피브리노겐은 트롬빈을 함유한 희생 패턴과 접촉하면 빠르게 교차결합합니다. 실온에서 원치 않는 GelMA 겔화를 방지하기 위해 하이드로겔을 추가하고 각 웰에 대해 개별적으로 UV 가교를 수행하는 것이 좋습니다. 또한 UV 경화 공정 중 오염을 방지하기 위해 멸균 조건을 유지해야 합니다.</li>
	<li>각 웰의 혈관 채널 양쪽에 1mL의 DPBS를 추가하고 플레이트를 4°C에서 15분 동안 유지하여 PF127을 액화시킵니다.</li>
	<li>15분 후 DPBS를 흡입하고 4.5단계를 3번 반복하여 PF127을 완전히 세척합니다.</li>
	<li>세포를 채널에 도입하기 전에 세포 부착을 강화하기 위해 채널을 통해 1% Matrigel을 함유한 DMEM F12를 30분 동안 관류합니다.</li>
</ol>5. HUVEC 문화
<ol><li>내피 세포 성장 배지(ECGM)를 37°C 수조에서 30분 동안 예열합니다.</li>
	<li>한편, 질소 탱크에서 동결 보존된 HUVEC 바이알을 꺼내 바이알의 캡을 부드럽게 풀었다가 다시 조여 나사산에서 질소를 방출합니다. 바이알을 37°C 수조에 2분 동안 담가 즉시 세포를 해동하고 바이알 내부에 소량의 얼음이 남아 있도록 합니다. 오염을 방지하기 위해 70% 에탄올로 바이알을 헹굽니다. 알림: 질소 탱크에서 세포를 회수할 때 보안경을 착용하십시오. 이 과정에서 바이알의 뚜껑은 수위보다 높아야 합니다.</li>
	<li>5mL의 예열된 ECGM이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브를 준비합니다. 마이크로피펫을 사용하여 바이알에서 해동된 세포를 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 세포가 남지 않도록 cryovial에 미리 데워진 신선한 배지 1mL를 추가하고 내부를 헹구고 나머지 세포를 원추형 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>원추형 튜브를 200× g 에서 3분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다. 상층액을 버리고, 10mL의 신선한 배지에 세포를 재현탁시키고, 세포를 T75 플라스크로 옮기고, 플라스크를 37°C 가습 CO2 인큐베이터 안에 넣습니다. 알림: 이 단계는 원심분리를 통해 극저온의 동결 매체에 존재하는 디메틸 설폭사이드를 제거하는 데 중요합니다.</li>
	<li>세포가 80-90% 밀도에 도달할 때까지 이틀에 한 번씩 배지를 새로 고칩니다.</li>
</ol>6. 채널의 내피화
<ol><li>ECGM, DPBS, 트립신 중화 용액 및 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산(TE)을 37°C 수조에서 30분 동안 예열합니다.</li>
	<li>90% 밀도에서 T75 플라스크의 세포를 10mL의 DPBS로 헹구고 플라스크에 0.25% TE 1mL를 첨가하고 3분 동안 배양합니다.</li>
	<li>플라스크의 측면을 가볍게 두드리고 트립신 중화 용액 5mL를 추가하여 TE를 중화합니다. 세포를 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 5mL의 새 ECGM을 사용하여 나머지 세포를 수집하고 원추형 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>원추형 튜브를 250× g 에서 3분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 새 ECGM에 재현탁시킵니다. 혈구계로 세포를 세고 6.4단계를 반복하여 세포 펠릿을 얻습니다. 90μL의 새로운 ECGM에 300만 개의 세포를 재현탁시킵니다.</li>
	<li>셀 현탁액을 채널에 도입하기 전에 채널을 잠시 진공 흡입하여 루멘을 청소합니다. 알림: 무결성이 손상되지 않도록 채널을 장기간 흡입하지 마십시오.</li>
	<li>웰당 0.5백만 개의 세포의 파종 밀도로 cell suspension로 채널을 부드럽게 로드합니다. 마이크로피펫을 사용하여 이 현탁액의 ~15μL를 추가하여 채널을 채웁니다. 참고: 시딩 밀도는 채널의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 이 밀도는 20G 노즐과 약 900μm의 내경으로 인쇄된 채널에 최적화되어 있습니다.</li>
	<li>플레이트를 인큐베이터 내부에 2시간 동안 평평하게 놓습니다. 그런 다음 플레이트를 180°로 뒤집어 다음 2시간 동안 평평한 위치에 유지합니다.</li>
	<li>4시간 후 DPBS로 채널을 세척하여 부착되지 않은 세포와 죽은 세포를 제거합니다. 각 웰에 2mL의 새 ECGM을 추가합니다(채널의 각 측면에 1mL). 채널이 로킹 방향과 평행하도록 로커에 플레이트를 배치하여 10° 기울기 각도와 5rpm으로 로커에서 다이내믹 배양을 시작합니다. 이틀에 한 번씩 성장 매체를 새로 고칩니다. 참고: 동적 배양은 저장소와 채널 사이의 매체 교환을 향상시키고 세포가 밤새 증식하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol>7. 내피화 성숙도 평가
<ol><li>ECGM과 DPBS를 37°C 수조에서 30분 동안 예열하고 CCK8(Cell Counting Kit-8) 시약을 실온에서 예열합니다.</li>
	<li>각 웰에 대해 8μL의 CCK8 시약 100mL와 1mL의 새 ECGM을 혼합하여 CCK1의 작업 용액을 만듭니다. 플레이트/6 채널에서 작업하는 동안 600mL의 새 ECGM과 결합하여 8μL의 CCK8 시약을 준비합니다.</li>
	<li>흡입으로 성장 매체를 제거하고 DPBS로 채널을 헹굽니다. 각 웰에 1mL의 CCK8 작업 용액을 추가하고 플레이트가 인큐베이터 내부에서 30분 동안 평평하게 유지되도록 합니다. 그런 다음 6.9단계에 설명된 대로 로커에서 동적 문화를 시작하고 다음 3시간 동안 이 과정을 계속합니다.</li>
	<li>3시간 후 플레이트를 한쪽으로 기울여 각 웰의 내용물을 제거하고 새 6웰 플레이트로 옮깁니다. DPBS로 채널을 헹구고 새 매체를 추가합니다. 알림: 흡광도가 측정될 때까지 플레이트를 알루미늄 호일로 덮습니다. 균일한 판독을 보장하기 위해 모든 웰에서 일관된 시약 부피를 유지합니다. 피펫팅하는 동안에는 optical density 판독의 정확도를 방해할 수 있는 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>색상이 균일하게 혼합되도록 플레이트를 15초 동안 부드럽게 흔든 후 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정합니다.</li>
	<li>미리 정의된 시간 간격으로 이 절차를 반복합니다. 각 시점에 대한 평균 광학 밀도를 계산하고 그래프 소프트웨어에서 성장 곡선을 플로팅합니다. 이 곡선은 시간 경과에 따른 내피의 상대적 성숙도를 나타냅니다.</li>
</ol>8. 투과성 분석
<ol><li>관심 웰 하나에서 배지를 제거합니다. 참고: 투과성 분석의 경우 다른 채널이 건조되어 혈관 투과성이 변경될 수 있는 것을 방지하기 위해 각 웰을 개별적으로 처리하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>DPBS에 70kDa FITC 덱스트란을 용해시켜 FITC 복합 덱스트란 0.1mg/mL 용액 6mL를 준비합니다. 참고: 20mg의 FITC 덱스트란을 DPBS 5mL에 100mg을 용해시켜 FITC 덱스트란 원액을 준비합니다. 용액을 부드럽게 소용돌이치게 한 후 반복적인 동결-해동 주기를 피하기 위해 500μL를 1.5mL 튜브에 분주합니다. 이 부분 표본은 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 분석을 수행하기 전에 원액을 0.1mg/mL의 작업 농도로 희석합니다.</li>
	<li>플레이트를 현미경 스테이지에 단단히 배치하고 위상차 모드에서 대물렌즈의 배율을 조정하여 시야 내에서 근처에 위치한 겔과 함께 관심 영역의 채널 벽을 명확하게 볼 수 있도록 합니다. 알림: 효과적인 투과성 평가를 위해 시야에서 관심 영역을 둘러싼 겔의 면적을 최대화하십시오. 이 측면은 Dextran 운송의 정확한 모니터링의 핵심입니다.</li>
	<li>원하는 영역에 초점을 맞춘 후 위상차에서 형광 모드로 변경합니다. 이미지 획득 탭에서 FITC 를 광시야 채널에 추가하고 dextran 솔루션을 추가하기 전에 이미지를 획득하여 배경 형광 강도를 계산합니다. 그런 다음 채널의 한쪽에 1mL의 FITC dextran 작업 용액을 추가하고 정수압 차이에 의해 용액이 웰의 다른 쪽으로 흐르도록 합니다.</li>
	<li>미리 결정된 시간 간격으로 이미지를 획득합니다(투과성이 높은 채널의 경우 더 자주, 투과성이 낮은 채널의 경우 덜 자주).</li>
</ol>9. ImageJ에서 형광 강도 측정
<ol><li>ImageJ 이미지 분석 소프트웨어에서 아래에 설명된 대로 초기 시점(It1)에서의 강도, 이후 시점(It2)에서 관찰된 평균 강도 및 배경 노이즈로 인한 강도(Ib)를 측정합니다. 방정식 (1)을 사용하여 투과성 계수 (Pd)를 계산합니다. t1 및t2 는 이미지 획득의 초기 및 이후 시점을 나타냅니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66676/66676eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)<ol><li>ImageJ를 시작하고 초기 시점에서 획득한 이미지를 엽니다.</li>
		<li>ImageJ에서 배율을 설정합니다. Analyze(분석) | 배율을 설정합니다. 알려진 눈금과 측정 단위를 입력합니다.</li>
		<li>사각형 도구를 선택하고 형광 강도 측정이 필요한 겔 영역 위에 사각형을 그립니다.</li>
		<li>Analyze(분석) | Measurements(측정)를 설정하고 Mean gray value(평균 회색 값)가 선택되어 있는지 확인합니다. 참고: 이 옵션은 선택한 영역 내의 평균 강도를 측정합니다. 주어진 분석에 필요에 따라 다른 매개 변수를 선택할 수 있습니다.</li>
		<li>영역을 선택한 상태에서 Analyze(분석) | 측정 하거나 M을 누르기만 하면 됩니다. 결과 창이 열리고 평균 형광 강도 및 선택한 다른 매개변수가 표시될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>세 번의 측정을 수행하고 스프레드시트에서 평균 형광 강도 값을 계산합니다.</li>
		<li>후속 시점 t2에서 캡처된 이미지뿐만 아니라 이후 시점에서의 형광 강도를 계산하기 위해 덱스트란 용액을 첨가하기 전에 촬영한 이미지에 대해 이 절차를 반복하여 배경 형광을 결정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Vessels-on-a-Plate를 사용한 신속한 혈관 네트워크 제작을 위한 3D 바이오프린팅

<table><tbody><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫</td><td>SPL SPL</td><td>91010</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기&nbsp;</td><td>신창 메디컬</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>3D 바이오프린터&nbsp;</td><td>티& R Biofab</td><td>3DX-프린터</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트&nbsp;</td><td>SPL</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>생물학적 안전 캐비닛</td><td>CHC LAB</td><td>PCHC-777A2-04,&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>명시야 도립 현미경</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Kit (CCK8)</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Kit (CCK8)</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 75T</td><td>SPL</td><td>70075</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 세포 배양 등급</td><td>Sigma aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a 키트</td><td>DOW</td><td>DC-184</td><td></td></tr><tr><td>DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG 키트&nbsp;</td><td>DOW</td><td>2924404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS - 1x</td><td>Welgene</td><td>LB001-01</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2 (즉시 사용 가능)</td><td>Promocell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Micro pipette(1000,200,100,20,10)</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol 99.9%</td><td>Duksan</td><td>D5</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소의 혈장에서 추출한 피브리노겐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-1G</td><td></td></tr><tr><td>FITC Dextran 70 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>형광 비드 (1.0 &mu; m, 녹색)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1030-1ML</td><td></td></tr><tr><td>GelMA-powder (Gelatin methacrylate) 50 g</td><td>3D Materials&nbsp;</td><td>20JT29</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, 회수 세포 배양 동결 매체, 50mL</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVEC(인간 배당 정맥 내피 세포)</td><td>Promocell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td>, <td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>, Thermo SCIENTIFIC</td><td>Forma STERI-CYCLE i160 CO2 인큐베이터</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (for mammalian cells)</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphate powder&nbsp;</td><td>도코요 화학공업(주)</td><td>85073-19-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, 계수 챔버 커버</td><td>Marienfeld Superior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, 혈구계, 세포 계수 챔버</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-0650030</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>에펜도르프</td><td>원심분리기 5920 R</td><td></td></tr><tr><td>NCViewer.com</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>질소 탱크</td><td>WORTHINGTON INDUSTRIES</td><td>LS750</td><td></td></tr><tr><td>Omnicure UV 레이저</td><td>EXCELITAS</td><td>SERIES 1500</td><td></td></tr><tr><td>파라필름 M</td><td>amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액 (100x)</td><td>GenDEPOT</td><td>CA005-010</td><td></td></tr><tr><td>유성 믹서</td><td>THINKY CORPORATION, japan</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 처리기</td><td>FEMTO SCIENCE</td><td>CUTE-1MPR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>사전 제작 버퍼, (P2007-1) 10x PBS</td><td>Biosesang</td><td>PR4007-100-00</td><td></td></tr><tr><td>시약 보관 캐비닛</td><td>ZIO FILTER TECH</td><td>SC2-30F-1306D1-BC</td><td></td></tr><tr><td>실시간 라이브 셀 이미징 현미경</td><td>Carl ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장고</td><td>SAMSUNG</td><td>RT50K6035SL</td><td></td></tr><tr><td>ROCKER 2D 디지털</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>스쿱 - 주걱</td><td>캐시</td><td>SL-SCO7001-EA</td><td></td></tr><tr><td>시그마, 트립신 -EDTA 솔리션, 0.25 %</td> <td>시그마 알드리치</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>도데 실황산 나트륨 (SDS)</td> <td>Thermo Fisher scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>주사기 배럴 팁 캡</td><td>FISNAR</td><td>3051806</td><td></td></tr><tr><td>Tally counter</td><td>Control Company</td><td>&nbsp; C23-147-050</td><td></td></tr><tr><td>테이퍼 노즐 (18g)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-18G-U</td><td></td></tr><tr><td>테이퍼 노즐 (22g)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-22G-U</td><td></td></tr><tr><td>테이퍼 노즐 20G</td><td>무사시</td><td>TPND-20G-U</td><td></td></tr><tr><td>소 플라즈마의 트롬빈</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T7326-1KU</td><td></td></tr><tr><td>타이머, 4 채널</td><td>ETL</td><td>SL. Tim3005</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 용액 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 중화 용액</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td></td></tr><tr><td>UG 24mL UG 연고 항아리</td><td>Yamayu</td><td>No. 3-53</td><td></td></tr><tr><td>UG 58mL UG 연고 항아리</td><td>Yamayu</td><td>No. 3-55</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WB-11</td><td></td></tr><tr><td>중량 기계</td><td>싸토리우스</td><td>bce2241-1skr</td><td></td></tr></tbody></table>

크기 및 패턴 유연성을 갖춘 표준 six-well plates의 혈관 투과성을 모델링하기 위한 high-throughput bioprinting 방법

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

크기와 패턴의 유연성을 특징으로 하는 VOP 플랫폼은 다중 헤드 바이오프린팅 시스템으로 제작되었습니다. 속이 비어 있고 관류가 가능한 채널은 내피화를 용이하게 하기 위해 HUVEC로 파종된 후 투과성 분석으로 평가되었습니다(그림 1A). 이 방법의 멀티스케일 제조 능력을 입증하기 위해 우리는 직선, 분기, 나선의 세 가지 뚜렷한 구성을 인쇄했습니다(그림 1B). 간단한 제조 접근 방식을 통해 하이드로겔 매트릭스 내에 내장된 6개의 속이 빈 관류 가능한 혈관 채널을 표준 6웰 플레이트 내부에서 생산할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 채널을 HUVEC로 내피화할 수 있습니다(그림 2A). 세포는 빠르게 부착되고 증식하여 혈관 채널의 내강 표면을 덮습니다(그림 2B). 하부 및 상부 루미날 표면 모두에 부착된 셀은 루멘 내부에 균일한 분포를 나타냅니다(보충 그림 S1).
플레이트를 가습 인큐베이터에 3일 동안 넣어 실리콘 잉크가 경화되도록 하면서 희생 패턴이 건조되지 않도록 했습니다(그림 3A). 이러한 채널을 통과하는 흐름을 평가하기 위해 녹색 마이크로비즈를 도입하여 채널이 효과적으로 관류될 수 있음을 입증했습니다(보충 비디오 S1). 채널의 직경은 희생 패턴 인쇄 중에 노즐 크기를 22G에서 18G로 변경하여 558 ± 38 μm에서 1094 ± 45 μm까지 다양했습니다. 또한 채널의 기하학적 구성은 바이오프린터의 G 코드 (보충 파일 1) 를 수정하여 조작하여 나선형 및 분기형 패턴을 인쇄할 수 있도록 했습니다(그림 3B).
UV와의 교차결합 지속 시간은 120초로 최적화되었으며, 이는 효과적인 세포 증식을 지원합니다(보충 그림 S2). 이러한 가교 지속 시간은 하이드로겔의 균형 잡힌 기계적 특성과 다공성으로 인해 내피 세포 증식을 촉진하는 생리학적으로 더 관련성 있는 환경을 초래하여 더 나은 세포 부착 및 후속 증식을 촉진합니다. HUVEC은 발광 표면에서 효과적으로 증식했으며 파종 후 5일째까지 조약돌과 같은 형태를 보였습니다. 내피의 성숙은 1일, 3일, 5일에 수행된 CCK8 분석으로 평가되었습니다(그림 4A,B). 내피의 성숙은 세포 파종 후 5일 후 CD31에 대한 면역염색을 통해 확인되었으며, 이는 긴밀한 접합부에서 CD31의 국소화를 입증했습니다(그림 4D).
내피의 장벽 기능을 평가하기 위해 성숙 5일째에 채널을 통해 70kDa 덱스트란 용액을 관류했습니다. 비교를 위해 내피(베어)가 없는 대조군 채널을 선택했습니다. 내피화된 채널은 시간이 지남에 따라 혈관 주위 겔 영역 내에서 형광의 변화를 최소화했으며, 이는 내피가 장벽 기능을 효과적으로 유지했음을 시사합니다. 그러나, 노출된 채널은 혈관 주위 겔 영역에서 형광의 증가를 나타냈으며, 이는 내피의 부재로 인해 더 높은 투과성을 나타냅니다(그림 4C 및 그림 4E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig01.jpg"> 그림 1: 인쇄된 혈관 채널의 준비 및 그 구성. (A) 인쇄된 혈관 채널의 제작, 내피화 및 투과성 분석의 개략도. (B) 이 방법에서 보여진 세 가지 구성의 개략도: 직선, 분기, 나선. 약어: VOPs = 접시 위의 용기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig02.jpg"> 그림 2: 희생 패턴과 실리콘 챔버, 혈관 채널 내피화를 프린팅하기 위한 제작 일정. (A) 그림은 웰 플레이트의 단일 웰을 나타내고 AA'는 단면 평면을 따른 뷰를 나타냅니다. (B) 제조 공정과 관련된 단계의 대표 이미지. 스케일 바 = 5mm(B1), 200μm(B2-4). 약어: GelFib = 15% 젤라틴 메타크릴레이트 및 1% 피브리노겐 0.05% w/v 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 용액; HUVECs = 인간 제대 정맥 내피 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig03.jpg"> 그림 3: 접시 위의 용기. (A) 희생 패턴과 실리콘 챔버를 인쇄한 후 플레이트에 있는 용기의 총 이미지. (B) 녹색 마이크로비드로 관류된 다양한 구성과 크기의 혈관 채널의 다중 스케일 제작 시연. 스케일 바 = 200 μm(직선 채널), 1,000 μm(나선형 및 분기형 채널). 약어: ID = 내경. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig04.jpg"> 그림 4: 혈관 채널과 혈관 내피 성숙 및 투과성. (A) 녹색 형광 단백질 태그가 지정된 HUVEC로 파종한 후 1일, 3일, 5일째에 혈관 채널의 형광 현미경 이미지로, 5일째에 HUVEC의 증식 및 조약돌 형태를 보여줍니다. (B) 내피 성숙은 세포 파종 후 1일, 3일, 5일에 CCK-8 분석으로 평가했습니다. (C) 내피화(내피 +) 및 베어(내피 -) 혈관 채널의 투과성 분석. (D) CD31 염색의 대표 이미지는 5일째에 단단한 접합부에서 CD31의 국소화를 보여줍니다. (E) 확산 투과성의 정량화. 스케일 바 = 200 μm (A, C, D). 약어: HUVECs = 인간 제대 정맥 내피 세포; GFP = 녹색 형광 단백질; GFP HUVECs = GFP 태그가 붙은 HUVECs; CCK-8 = 세포 계수 키트 8; DAPI = 4'6-디아미디노-2-페닐린돌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>인쇄 잉크</td>
			<td colspan="2">인쇄 매개 변수</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>노즐 게이지</td>
			<td>온도 (°C)</td>
			<td>기압 (kPa)</td>
			<td>헤드 속도(mm/min)</td>
		</tr><tr><td>희생 잉크</td>
			<td>18</td>
			<td>37</td>
			<td>40-48</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>실리콘 잉크</td>
			<td>22</td>
			<td>5</td>
			<td>100</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>표 1: 희생 및 실리콘 잉크에 대한 인쇄 매개변수.
추가 파일 1: 6웰 플레이트 내부의 희생 패턴과 실리콘 챔버를 3D 프린팅하기 위한 명령이 포함된 G-Code 스크립트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_GCode%20File_Jove.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 그림 S1: 하부 및 상부 초점면 모두에서 GFP-HUVEC 부착을 보여주는 세포 파종 후 하부 및 상부 루날 표면의 대표 이미지. 스케일 바 = 200 μm. 약어: UU' = 상부 초점면; LL' = 하부 초점면. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S1%20rev.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 그림 S2: UV(405nm)와의 다양한 가교 지속 시간에서의 GFP-HUVEC 증식. 스케일 바 = 200 μm. 약어: HUVECs = 인간 제대 정맥 내피 세포; GFP = 녹색 형광 단백질; GFP HUVECs = GFP 태그가 붙은 HUVECs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S2%20rev.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 비디오 S1: 직선, 나선형 및 분기된 채널을 통한 효과적인 관류를 보여주는 녹색 마이크로비즈를 사용한 관류. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/Channels%20Perfusion.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 S1 : G 코드 및 M 코드 명령의 기능. 참고: G 코드에서 X, Y 및 Z는 각각 X축, Y축 및 Z축을 따라 이동하기 위한 좌표를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

크기 및 패턴 유연성을 갖춘 표준 six-well plates의 혈관 투과성을 모델링하기 위한 High-throughput Bioprinting 방법

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in ...

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

침투성 막에의 결심을 위한 방법은 다 잘 번호판에 대 한 시스템 삽입 하 고 매개 변수 최적화 시뮬레이션을 사용 하 여 확산 계수 계산에 대 한 실리콘에서 제공 됩니다.

다 잘 판에 대 한 시스템을 삽입 하는 결단 력과 침투성 막에 3 차원 조직 모델에서 보급의 시뮬레이션 하는 방법

이 방법은 표준화된 미세 유체 플랫폼에서 40개의 교류 3D 마이크로혈관으로서 iPSC 유래 내피 세포의 배양을 기술한다. 이 플랫폼은 확장 가능하고 처리량이 높은 방식으로 혈관 신생 콩나물의 해부학 및 안정화를 포함하여 3D로 그라데이션 구동 혈관 신생 발아를 연구 할 수 있습니다.

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

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