Name: Caerulein과 Lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 학습하세요 Caerulein과 LPS 복강 내 주사를 이용한 중증 급성 췌장염 마우스 모델 수립 방법을. 비침습적 기법으로 췌장 손상 및 장기 부전을 유도하여 치료 표적 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 Huainan City의 건강 및 의료 과학 연구 프로젝트(No. HNWJ2023005); Huainan City의 시립 지도 과학 기술 계획 프로그램(No.2023151); Anhui Provincial College 학생들의 혁신 및 기업가 정신 교육 프로그램 (No. S202310361254); "50· Stars of Science and Technology" 화이난시와 안후이성 핵심 임상 전문 건설 프로젝트의 혁신 팀. 관련 테스트 데이터를 제공해 주신 Anhui University of Science and Technology의 First Affiliated Hospital 실험실 부서에 감사를 표하고 싶습니다.

복강내 약물 주입을 통한 마우스의 췌장 손상 유도

<ol><li>Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+severe+acute+pancreatitis%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Management of severe acute pancreatitis: An update.</a> Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).</li>
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<li>Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hemorrhagic+pancreatitis+%28massive+necrosis%29+with+fat+necrosis+induced+in+mice+by+DL-ethionine+fed+with+a+choline-deficient+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet.</a> Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+XIAP+reduces+the+severity+of+acute+pancreatitis+via+regulation+of+cell+death+and+nuclear+factor-kappaB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity.</a> Cell Death Dis. 8 (3), e2685(2017).</li>
<li>Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caerulein-induced+acute+necrotizing+pancreatitis+in+mice%3A+Protective+effects+of+proglumide%2C+benzotript%2C+and+secretin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin.</a> Gastroenterology. 88, 5 Pt 1 1192-1204 (1985).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPP4+inhibitor+attenuates+severe+acute+pancreatitis-associated+intestinal+inflammation+via+Nrf2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling.</a> Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754(2019).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+protects+severe+acute+pancreatitis+by+inhibiting+HMGB-1+active+secretion+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages.</a> Polymers (Basel). 14 (12), 2470(2022).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sitagliptin+activates+the+p62-Keap1-Nrf2+signalling+pathway+to+alleviate+oxidative+stress+and+excessive+autophagy+in+severe+acute+pancreatitis-related+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury.</a> Cell Death Dis. 12 (10), 928(2021).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+aggravates+acinar+cell+apoptosis+and+injury+by+regulating+p53%2FAIFM2+transcription+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis.</a> Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).</li>
<li>Schmidt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+better+model+of+acute+pancreatitis+for+evaluating+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.</a> Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+paracentesis+drainage+attenuates+severe+acute+pancreatitis+by+enhancing+cell+apoptosis+via+PI3K%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway.</a> Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).</li>
<li>Fontaine, D. A., Davis, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attention+to+background+strain+is+essential+for+metabolic+research%3A+C57BL%2F6+and+the+international+knockout+mouse+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium.</a> Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+CHRM3+activation+causes+pancreatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice.</a> JCI Insight. 6 (17), e132585(2021).</li>
<li>Sah, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerulein-induced+chronic+pancreatitis+does+not+require+intra-acinar+activation+of+trypsinogen+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice.</a> Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+AMPK+ameliorates+acute+severe+pancreatitis+by+suppressing+pancreatic+acinar+cell+necroptosis+in+obese+mice+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models.</a> Cell Death Discov. 9 (1), 363(2023).</li>
<li>Jin, C., Li, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+severe+acute+pancreatitis+model+in+mice+induced+by+combined+Rain+Frog+Peptide+and+lipopolysaccharide+and+exploration+of+its+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Exp+Bio+Sinica%22%5BJournal%5D)">Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism.</a> Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+aggravates+acinar+cell+apoptosis+and+injury+by+regulating+p53%2FAIFM2+transcription+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis.</a> Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).</li>
<li>Roy, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Ubap2+deletion+regulates+glucose+tolerance%2C+inflammation%2C+and+protection+from+Caerulein-induced+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis.</a> Cancer Lett. 578, 216455(2023).</li>
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<li>Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+mechanisms+of+major+DAMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Release mechanisms of major DAMPs.</a> Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+circulating+histones+in+predicting+persistent+organ+failure+and+mortality+in+patients+with+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis.</a> Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).</li>
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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

현재 중증 급성 췌장염 환자의 높은 사망률을 개선할 수 있는 효과적인 수단이 부족합니다. 면역 안정성 기전을 향상시키는 약물의 효능을 조사하는 것이 중요합니다. 중증 급성 췌장염에 대한 이상적인 동물 모델이 시급히 필요합니다. C57BL/6J 유전적 배경을 가진 마우스는 SAP 병태생리학 연구를 포함한 생물의학 연구에 널리 사용됩니다. B6J 마우스에서 70년 이상 진행된 유전적 분화로 인해 여러 엑손이 자발적으로 결실되었고15 이로 인해 Caerulein에 의한 췌장 손상에 대한 민감도가 감소했다16. 또한 급성 췌장염의 기존 동물 모델은 외과적 외상이나 대형 동물에만 적용할 수 있는 등의 한계가 있어 이러한 모델을 사용한 과학적 연구에 어려움을 겪습니다. 따라서 이 특정 유전자 균주를 사용하여 안정적이고 효율적이며 편리한 동물 모델을 구축하는 것이 매우 중요합니다.
카에룰레인(Caerulein)은 콜레시스토키닌(cholecystokinin)의 유사체로서, 생쥐가 공복 상태에 있고 충분한 양의 소화액을 저장한 짧은 시간 내에 고주파 주사를 통해 췌장 소화액과 효소 분비를 상대적으로 방해함으로써 췌장 조직 손상을 유도한다17. LPS는 박테리아 세포벽에서 발견되는 주성분이며 마우스에서 MODS 및 SIRS를 유발할 수 있습니다18. 이전 연구에서는 복강 내 주사를 통해 투여되는 다양한 용량의 LPS와 다른 빈도의 Caerulein 주사를 결합하면 인간 SAP에서 관찰된 유사한 병리학적 변화가 유발됨을 보여주었습니다19,20. 이 연구는 비침습적 접근 방식을 사용하여 Caerulein 주사의 다양한 빈도와 마우스에 복강 내로 투여되는 다양한 용량의 LPS를 결합하여 다양한 정도의 췌장 손상을 유도했습니다. 복막에 의한 균일한 흡수를 보장하는 것은 프로토콜 개발 중에 매우 중요했습니다. 이 요구 사항을 충족하려면 각 약물 투여에 대한 정확한 제어를 보장하기 위해 복강 내 주사 단계를 엄격하게 준수하는 것이 중요합니다. 또한, 각 약물 주사 후 멸균 면봉으로 주사 부위를 부드럽게 문지르고 적절한 압력을 가하는 것은 복막강 전체에 약물을 균일하게 분배하는 데 필수적입니다. 또한 바늘이 상복부의 중앙 영역을 향하도록 핀헤드를 복막강에 정확하고 정밀하게 배치하는 것이 가장 중요합니다. 작업자가 바늘을 복강에 삽입할 때 저항이 없는지 정확하게 감지할 수 있도록 사전 교육을 실시해야 합니다. 수동 작동 대신 마이크로 정량 주입 펌프를 사용하면 잠재적으로 약물 주입 품질을 향상시킬 수 있습니다. 불행히도 이 연구에서는 구현되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고, 다른 주입 방법을 사용함으로써, 우리는 다양한 정도의 췌장 손상을 유도하고, Caerulein과 LPS 주사를 결합하여 유도된 동일한 기술적 조건 하에서 서로 다른 빈도와 용량으로 인한 췌장 손상의 차이를 효과적으로 관찰했습니다. 이는 중증 급성 췌장염 유도를 위한 비침습적 동물 모델에서 Caerulein의 향후 사용에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
Caerulein과 LPS의 조합은 혈청 아밀라아제 및 리파아제 수치를 현저히 증가시키고, 췌장 무게를 증가시켰으며, 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색으로 입증된 바와 같이 염증 세포의 광범위한 침윤, 췌장 침식 세포 부종, 괴사 및 출혈을 포함한 조직학적 변화를 초래했습니다. 더욱이, LPS의 복용량이 증가함에 따라 췌장의 병리학적 변화가 더욱 뚜렷해졌습니다. 그러나 PI IV군과 PI V군 간에 췌장 병리학 점수에서 뚜렷한 차이가 없었던 반면, 췌장 조직 세포 괴사의 정도는 PI IV 그룹에 비해 PI III 그룹에서 더 두드러졌다는 점은 주목할 만하다. 이 관찰은 Caerulein의 투여 빈도가 췌장 손상에 기여하는 주요 요인으로 작용할 수 있음을 시사하는 반면, LPS는 진행을 악화시켜 전신 염증성 손상을 유발합니다18,21. HMGB-1은 위치에 따라 기능하는 단백질이다22. 세포외 HMGB-1은 염증의 경고 신호에 관여하는 단백질로 작용하며 급성 췌장염의 중증도와 밀접한 관련이 있습니다 23,24,25. 이 연구에서 모든 실험군의 마우스의 혈청 HMGB-1 수치는 대조군에 비해 유의하게 높았으며, PI V 그룹이 가장 유의미한 증가를 보였습니다. 면역조직화학 및 단백질 전기영동 실험에서도 췌장 조직에서 HMGB-1의 높은 발현을 확인했습니다. 이 중요한 단백질은 중증 급성 췌장염에서 염증성 폭풍을 억제하기 위한 치료 표적이 될 수 있습니다.
요약하면, 마우스에서 비침습적이고 간단하며 수행하기 쉬운 SAP 모델을 개발하는 것이 중요합니다. 이 실험 프로토콜에서 Caerulein과 LPS를 결합하여 췌장 손상 유도는 신뢰할 수 있고 효과적입니다. 50μg/kg의 용량으로 Caerulein을 10일 연속 복강내 투여한 후 LPS 15mg/kg을 1회 복강내 주사함으로써 안정적이고 신뢰할 수 있으며 비용 효율적이고 효율적인 SAP 동물 모델을 구축할 수 있습니다.

중증 급성 췌장염은 소화기 계통 질환 영역 내에서 빠른 발병, 빠른 진행, 높은 사망률을 특징으로 한다1. 높은 치사율은 항상 임상 연구의 주요 초점이었습니다. 임상 조건의 예측할 수 없는 변화, 질병 증상의 이질성, 인간 표본의 제한된 가용성으로 인해 동물 모델을 확립하는 것이 질병 연구에서 점점 더 중요해지고 있습니다.
소듐 타우로콜레이트를 총담관에 역행성 주입하는 것은 일반적으로 SAP2의 랫트 모델을 만드는 데 사용됩니다. 이 모델링 기법은 췌장 담도 폐쇄를 시뮬레이션하고 담즙 및 췌장액의 역류를 유도함으로써 SAP 동물 모델 복제에서 높은 성공률을 보여줍니다. 그러나 침습적 수술은 동물 모델 자체에 영향을 미친다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 이 방법은 주로 실험 대상으로 사용되는 쥐 및 개와 같은 대형 동물에 국한됩니다. 십이지장 삽관(duodenal intubation)3, 직접 십이지장 천자(direct duodenal puncture)4 및 담관-췌관관(bile duct-pancreatic duct)5의 직접 천자를 포함한 대체 기법이 모델링 목적으로 자주 활용된다.
복강 내 주사 및 식이 모델링 방법은 모든 크기의 동물에 적용할 수 있는 비침습적 이점을 제공합니다. 콜린 결핍 에티오닌(CDE)6을 공급하여 유도된 SAP의 마우스 모델은 조절이 잘 불가능한 고혈당증 및 저칼슘혈증과 같은 특정 합병증을 나타내므로 새로운 진단 및 치료 접근법을 평가하기에 적합하지 않습니다. 한편, L-아르기닌7과 결합된 Caerulein의 복강내 주사는 마우스에서 급성 췌장염을 유발하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법을 나타냅니다. 특히, 콜레시스토키닌 유사체인 Caerulein의 반복적인 복강 내 투여는 발병기전, 염증 및 재생 과정을 포함하여 이 파괴적인 질병과 관련된 다양한 측면을 조사하는 데 매우 적합한 접근 방식을 제공합니다. 콜레시스토키닌(cholecystokinin, CCK)과의 구조적 유사성으로 인해 카에룰레인은 담낭 수축과 췌장 효소 분비를 효과적으로 자극하여 효소 분비의 불균형을 초래하고 이후 자기 파괴를 일으킨다8. 유비쿼터스이며 병원체 관련 분자 패턴 분자로 광범위하게 연구된 LPS(Lipopolysaccharide)는 복강 내 주입을 통해 Caerulein과 결합하여 SAP의 효과적인 마우스 모델을 확립할 수 있습니다. 이 조합은 상당한 수의 염증성 사이토카인을 빠르게 유발하고 방출하여 과도한 국소 및 전신 염증을 유발합니다. 여러 연구에서 LPS와 결합된 Caerulein의 복강 내 주입을 통해 마우스에서 SAP 모델을 유도했다고 보고했습니다. 이는 Caerulein의 복강 내 주사가 마우스에서 췌장 부종과 출혈을 유발할 수 있는 반면, LPS를 추가하면 즉시 췌장 괴사를 유발하고 전신 염증 반응, 패혈증 및 심지어 장기 부전을 악화시킬 수 있다는 사실에 기인할 수 있습니다. 현재 복강내 Caerulein 주사의 용량과 빈도에 차이가 있을 뿐만 아니라 추가 LPS 용량에도 불일치가 있습니다. 마우스 SAP 모델에서 일관성을 달성하는 것은 도전적입니다 9,10,11,12; 따라서 이상적인 모델을 얻기 위해 표준화된 프로토콜을 수립할 필요가 있습니다. 이 기사에서는 마우스의 복강 내 주사를 위한 프로토콜을 설명하고 LPS의 최적 주입 빈도와 추가 투여량을 조사합니다.

<table><tbody><tr><td>20&배; 구연산 항원 복구 용액(pH 6.0)</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, 중국</td><td>G1202-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>아밀라아제</td><td>마인드레이, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC/PI</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, 중국</td><td>&nbsp; G1511</td><td>&nbsp; 1:20으로 희석</td></tr><tr><td>Anti-HMGB1 토끼 pAB</td><td>우한 서비스바이오 테크놀로지 유한 유한 GB11103</td><td></td><td>&nbsp; 1:1800</td></tr><tr><td>BCA 단백질 정량 검출 키트</td><td>우한 서비스바이오 테크놀로지 유한 유한 기술 유한 유한 기술 유한 회사 중국</td><td>G2026-200T</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II 유세포 분석기</td><td>BD 생명 과학, 산호세, 캘리포니아, 95131, 미국</td><td>BD FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>우한 servicebio 기술 유한 공사, 중국</td><td>GC305010-100g</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Cavion</td><td>Experimental Animal Co., 창저우, 중국</td><td></td><td>라이센스 번호 SCXY (Su) 2011&ndash; 0003</td></tr><tr><td>세룰타이드</td><td>&nbsp; MCE, 뉴저지, 미국</td><td>17650-98-5&nbsp;</td><td>50 & 마이크로; g/kg</td></tr><tr><td>화학발광 이미저</td><td>Cytiva CO.,LTD.; 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>구연산 항원 복구 용액(건조 분말 pH 6.0)</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, 중국</td><td>G1201-5 L</td><td></td></tr><tr><td>콜라게나제 IV</td><td>우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국</td><td>&nbsp; GC305014</td><td>0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>DAB(SA-HRP) Tunel 세포 세포사멸 검출 키트</td><td>Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, 중국</td><td>G1507-100 L</td><td></td></tr><tr><td>치수 EXL(LM 통합 화학 시스템 포함</td>) <td>Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield, USA</td><td>YZB/USA 8311-2014</td><td></td></tr><tr><td>ECL 개발자</td><td>Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에오신 염료(알코올 용해성)</td><td>우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국</td><td>G1001-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>EthoVision XT</td> <td>&nbsp; Noldus, 네덜란드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC 라벨 염소 안티 토끼 IgG</td><td>우한 서비스바이오 테크놀로지 유한 유한 공사, 중국</td><td>GB22303</td><td>&nbsp; 1:50으로 희석</td></tr><tr><td>전자동 혈액 세포 분석기</td><td>Zybio Inc. 중국</td><td>&nbsp; Zybio-Z3 CRP</td><td></td></tr><tr><td>GapDH</td><td>우한 servicebio Technology Co.,Ltd, 중국</td><td>GB11103</td><td>&nbsp; 1:1500으로 희석</td></tr><tr><td>헤마트톡실린 블루 리턴 용액</td><td>우한 servicebio Technology Co.,Ltd, 중국</td><td>G1040-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>헤마트실린 분화 솔루션</td><td>우한 servicebio Technology Co.,Ltd, 중국</td><td>G1039-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>헤마트톡실린 염료</td><td>우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국</td><td>G1004-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>HMGB-1 ELISA 키트</td><td>njjcbio Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>균질화기</td><td>우한 서비스바이오 기술 Co., Ltd, 중국</td><td>KZ-III-F; IC111150 100222</td><td></td></tr><tr><td>HRP 표지 염소 안티 토끼 IgG</td><td>우한 서비스바이오 테크놀로지 유한 유한 유한 회사 중국</td><td>GB23303</td><td>&nbsp; 1:1500</td></tr><tr><td>IL-6 ELISA 키트</td>로 희석 <td>우한 서비스 바이오 테크놀로지 유한 유한</td> 회사 <td>GEM0001</td><td></td></tr><tr><td>리파아제&nbsp;</td><td>마인드레이, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>지포다당류&nbsp;</td><td>우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국</td><td>GC205009</td><td>15 mg/kg</td></tr><tr><td>저온 고속 원심분리기</td><td>Changsha Pingfan Apparatus& Instrument Co., Ltd., 중국</td><td>TGL-20M</td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 파괴 액체</td><td>우한 서비스바이오 기술 Co., Ltd, 중국</td><td>G1204</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰</td><td>Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.; 중국</td><td>CR-601ST</td><td></td></tr><tr><td>나일론 메쉬</td><td>우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국</td><td></td><td>200 메쉬</td></tr><tr><td>원스텝 TUNEL 세포 사멸 검출 키트(DAB 염색 방법)</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, 중국</td><td>G1507-100T</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 조직 포매 기계</td><td>PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; 중국 창저우</td><td>PBM-A</td><td></td></tr><tr><td>병리학적 조직 건조 장치</td><td>PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; 창저우, 중국</td><td>PHY-III</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>우한 서비스 바이오 기술 유한 회사</td> 중국 <td>G4202-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>우한 서비스 바이오 기술 유한 회사</td> 중국 <td>G2008-1 ml</td><td></td></tr><tr><td>양성 형광 현미경</td><td>올림푸스 공사, 도쿄, 일본</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>프로 칼시토닌</td><td>마인드레이, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>Millipore, 미국</td><td></td><td>0.22 & micro; m</td></tr><tr><td>RIPA</td><td>우한 서비스바이오 기술 유한 회사, 중국</td><td>G2002-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>비요타임 바이오테크놀로지, 중국</td><td>P0012A</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&알파; ELISA 키트</td><td>우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국</td><td>GEM0004</td><td></td></tr><tr><td>초음파 수조</td><td>DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO., LTD.; 중국</td><td>KQ-200KDE</td><td></td></tr><tr><td>웨스턴 블롯</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>웨스턴 블롯 이미징 시스템</td><td>글로벌 생명 과학 IP Holdco LLC, 일본</td><td>Amersham ImageQuant 800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>월풀 믹서</td><td>SCILOGEX; 미국</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caerulein과 lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사

Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection

사망률이 높은 중증 급성 췌장염(SAP)의 치료는 임상적으로 중대한 과제입니다. 동물 모델을 사용하여 SAP와 관련된 병리학적 변화를 조사하면 잠재적인 치료 표적을 식별하고 새로운 치료 접근법을 탐색하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전 연구에서는 주로 소듐 타비아우로콜레이트의 역행성 담관 주입을 통해 췌장 손상을 유발했지만, 수술 손상이 동물 모델의 품질에 미치는 영향은 아직 불분명합니다. 이 연구에서는 C57BL/6J 마우스에서 췌장 손상을 유발하기 위해 다양한 빈도의 복강 내 Caerulein 주사와 다양한 용량의 LPS를 결합한 주사를 사용하고 5가지 복강 내 주사 프로토콜에 걸쳐 손상 정도를 비교했습니다. 마우스에서 급성 췌장염을 유발하는 것과 관련하여, 5일 이내에 80%의 높은 사망률을 초래하는 복강 내 주사 프로토콜이 제안됩니다. 구체적으로, 마우스는 Caerulein(50μg/kg)을 매일 10회 복강내 주사한 후, 마지막 Caerulein 투여 1시간 후에 LPS(15mg/kg)를 주사했습니다. 주사 약물의 빈도와 복용량을 조절함으로써 췌장 손상의 중증도를 효과적으로 조절할 수 있습니다. 이 모델은 제어성이 뛰어나고 복제 주기가 짧아 고가의 장비 없이도 한 명의 연구자가 완성할 수 있습니다. 인간 SAP에서 관찰된 주요 질병 특성을 편리하고 정확하게 시뮬레이션하는 동시에 높은 수준의 재현성을 입증합니다.

실험적 마우스 모델링 과정은 그림 1에 나와 있습니다. 주입 완료 12시간 후, 오픈 필드 비디오 레코더를 사용하여 5주기 동안 다양한 실험 그룹의 마우스의 이동 거리와 부동성 지속 시간을 모니터링했습니다(그림 2A). 5 사이클 동안 PI V 그룹의 마우스는 3 분 이내에 낮은 수준의 이동 거리를 유지한 반면, 3 분 이내의 부동성 비율은 각 후속 사이클마다 증가했습니다 (그림 2B, C). 또한, 5 사이클 동안 다른 실험 그룹에서 마우스의 총 이동 거리에 대한 통계 분석이 수행되었습니다. PI V 그룹은 다른 실험 그룹에 비해 총 이동 거리가 가장 작았으며 그 차이는 통계적으로 유의했습니다(p &lt; 0.001)(그림 2D,E). 대조군과 PI I 그룹을 제외하고, 다른 실험군의 마우스는 D-Value 가중치에서 음의 성장을 보였다. 그 중 PI V군이 체중 변화가 가장 컸으며, 다른 실험군에 비해 체중 변화 차이가 통계적으로 유의하였다(그림 2F). 각 실험군에서 추가로 10마리의 생쥐의 생존율을 평가한 결과, PI V 군에 속한 생쥐의 폐사율이5일째 되는 날에 80%에 도달한 것으로 나타났다. 그러나 다른 4개의 실험군과 대조군 마우스 간의 사망률에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다(그림 2G).
고출력 현미경을 사용하여 마우스의 PI IV 및 PI V 그룹에서 상당한 세포 팽창, 괴사 및 염증성 세포 침투가 관찰되었습니다(그림 3A, B). 보충 표 2에 제공된 등급 기준을 사용하여 서로 다른 실험 그룹의 마우스의 췌장 병리학을 평가한 결과, 대조군 마우스와 비교하여 췌장 병리학 점수에서 유의한 차이를 관찰했습니다(p &lt; 0.001)(그림 3C; 보충 그림 1). 또한, 대조군과 비교했을 때, 측정된 마우스의 혈청 아밀라아제 및 리파아제 수치는 PI II 내지 PI V 실험군에서 유의하게 높았으며, 그 차이는 통계적으로 유의하였다. 흥미롭게도, PI I 그룹 마우스에서는 통계적으로 유의미한 차이가 없었습니다(그림 3D,E). ELISA 방법은 마우스의 혈청에서 TNF-α 및 IL-6을 포함한 염증 마커14의 수준을 평가하기 위해 사용되었습니다. 그 결과, PI V 그룹 마우스의 TNF-α 및 IL-6 수치가 다른 실험 그룹보다 유의하게 높았으며, 그 차이는 통계적으로 유의한 것으로 나타났습니다(그림 3F,G). 대조군과 비교했을 때, PCT 수치는 4개의 실험군 모두에서 증가하였으나, PI V 집단에서의 차이만이 통계적으로 유의하였다(p &lt; 0.05)(그림 3H).
다양한 실험 그룹의 마우스에서 췌장 조직의 자가사멸 상태 각 마우스 그룹의 췌장 조직에 대해 TUNEL 염색을 수행하여 서로 다른 실험 그룹의 췌장 조직에서 세포 괴사 상태를 관찰했습니다(그림 4A). 췌장 조직 절편의 단위 면적당 회색조 값(OD)과 세포 괴사의 양성률은 Image J 소프트웨어를 사용하여 반정량적으로 분석되었습니다. 그 결과, 다른 실험군과 비교했을 때, PI V 그룹의 마우스의 췌장 조직에서의 세포 괴사 수준이 유의하게 증가하였고, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(p &lt; 0.001)(그림 4B,C). 단백질 면역블로팅 실험은 서로 다른 실험군의 마우스의 췌장 조직에서 세포 괴사 마커인 시스테닐 아스파르테이트 특이적 단백질효소-3(Caspase-3)의 발현 수준을 평가하기 위해 수행되었습니다(그림 4D). 카스파제-3 발현의 정량화는 PI V군의 췌장 조직에서 카스파제-3 단백질의 발현 수준이 유의하게 증가하였고, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(p &lt; 0.001). 단백질 발현 수준을 정량화하고 내부 대조군 GapDH로 정규화했습니다(그림 4E). 또한 신선한 췌장 아시나 세포 현탁액을 Annexin V-FITC/PI로 라벨링하고 유세포 분석으로 분석했습니다. 마우스의 다른 실험 그룹과 비교했을 때, PI V 그룹은 세포 사멸의 양성 비율이 유의하게 유의하게 나타났으며, 이는 통계적으로 유의한 것이었다(p &lt; 0.001)(그림 4F,G).
말초 혈청 내 HMGB-1 함량 및 췌장 조직 내 HMGB-1 발현 수준 HMGB-1 단백질과 췌장 손상 사이의 관계를 조사하기 위해 각 실험군에서 마우스의 췌장 조직에 대해 면역조직화학적 염색 및 정량화를 수행했습니다. 실험군과 대조군 간에 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p &lt; 0.001)(그림 5A,B). ELISA는 다른 실험 그룹에서 마우스의 혈청에서 HMGB-1의 수준을 측정하는 데 사용되었습니다. 그 결과, 대조군과 비교했을 때 HMGB-1의 혈청 수치는 모든 실험군에서 유의하게 높았으며, PI V 그룹에서 가장 높은 수치가 관찰되었으며, 그 차이는 통계적으로 유의한 것으로 나타났다(p &lt; 0.001)(그림 5C). 또한, 웨스턴 블롯 분석은 모든 실험군에서 마우스의 췌장 조직에서 HMGB-1 단백질의 발현 증가를 감지했으며, 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다(p &lt; 0.001)(그림 5D,E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig01.jpg"> 그림 1: 실험 순서도. 2일차 및 3일차: 복강 내 주사. 4일차: 마지막 복강내 주사 12시간 후에 노천 필드 실험을 시작했습니다. 5일차: 복강 내 주사 후 36시간 후에 안락사. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig02v2.jpg"> 그림 2: PI 마우스 모델의 거시적 변화. (A) 마우스의 실시간 이동 궤적 플롯이 그려져 있습니다. (B) 서로 다른 실험 그룹의 마우스에 대한 각 모니터링 기간 내의 총 이동 거리. (C) 서로 다른 실험 그룹의 마우스에 대한 각 모니터링 기간 내 부동성 시간의 백분율. (D,E) 15분 동안의 총 이동 거리와 부동성 시간 백분율은 다른 실험 그룹의 쥐에 대해 분석되었습니다. (F) 모델링 과정 전후의 마우스의 무게를 나타내는 D-값이 표시됩니다. (G) 각 그룹에서 10마리의 마우스의 생존은 복강 내 주사 후 7일 동안 관찰되었습니다. 데이터는 SEM, n = 4± 의미로 표현됩니다. "ns"는 유의하지 않음을 나타내고, *P &lt; 0.05, ****P &lt; 0.001을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig02largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig03.jpg"> 그림 3: 서로 다른 실험군에서 발생한 마우스 췌장염의 병리학적 변화. (A) 다른 실험 그룹에서 마우스 췌장 조직의 H&amp;E 염색된 조직학적 단면(헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 파라핀 내장 췌장 조직 절편, 각각 100배 및 눈금 막대 200μm, 400배 및 눈금 막대 50μm). 노란색의 긴 화살표는 섬을 나타냅니다. 빨간색 긴 화살표는 acinar 세포를 나타냅니다. 갈색의 긴 화살표는 혈관을 나타냅니다. 파란색의 긴 화살표는 덕트를 나타냅니다. (B) 생쥐의 체중에 대한 췌장 체중의 비율 계산. (C) 생쥐 췌장의 병리학적 점수화. (D,E) 생쥐의 혈청 아밀라아제 및 리파아제 수치 검출. (F-G) 마우스의 혈청 TNF-α 및 IL-6 수치의 ELISA 측정. (H) PCT 수준의 평가. 데이터는 SEM, n = 4± 의미로 표현됩니다. "ns"는 유의하지 않음을 나타내며, *P &lt; 0.05, ****P &lt; 0.001을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig04.jpg"> 그림 4: 생쥐의 췌장 조직의 세포사멸. (A) TUNEL 염색의 대표 이미지는 생쥐의 췌장 파라핀 절편과 확대 영역 이미지에서 얻었습니다. (400×, 눈금 막대 50μm, 갈색을 띤 노란색은 양성 세포). (나,씨) 생쥐 췌장 조직의 TUNEL 염색 절편의 단위 면적당 그레이스케일 값과 양성으로 염색된 죽은 세포의 비율에 대한 정량 분석. (D) 췌장 조직에서 Caspase-3의 발현 수준은 웨스턴 블롯에 의해 검출되었습니다. (E) 췌장 조직에서의 Caspase-3 발현의 정량화. (F) 생쥐 췌장 아시나 세포에서 세포 사멸 정도를 평가하기 위해 유세포 분석을 사용했습니다. (G) 마우스 췌장 아시나 세포에서 말기 죽은 세포의 계수. 데이터는 SEM, n = 4± 의미로 표현됩니다. "ns"는 유의하지 않음을 나타내고, *P &lt; 0.05, ****P &lt; 0.001을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig05.jpg"> 그림 5: 생쥐 췌장 조직에서의 HMGB-1 발현. (A) 췌장 절편에서 HMGB-1의 면역조직화학적 염색을 보여주는 대표 이미지 및 확대 이미지(x400, 눈금 막대 50μm). 갈색을 띤 노란색은 양성 세포(n = 4)를 나타냅니다. (B) 췌장 조직 절편에서 HMGB-1 양성 세포의 비율(n = 24). (C) 마우스 혈청 내 HMGB-1 수준(n = 4). (D,E) 췌장 조직에서 HMGB-1의 발현 수준을 검출하고 정량화 결과(n=4)를 얻기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 데이터는 SEM± 의미로 표현되며, "ns"는 유의하지 않음을 나타내고, *P &lt; 0.05, ****P &lt; 0.001을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: PI V 그룹 마우스 모델의 다발성 장기 손상. (A) CON 및 PI V 그룹 마우스에서 수집된 췌장, 폐, 간 및 신장 조직의 조직학적 변화의 대표 이미지는 H&amp;E 염색(200x 배율, 눈금 막대 50μm)을 사용하여 분석했습니다. 아시나 세포 괴사와 관련된 병리학적 변화는 검은색 화살표로 표시됩니다. 노란색 화살표는 폐포의 간질성 출혈과 부종을 특징으로 하는 병리학적 변화를 나타냅니다. 간세포 부종과 괴사는 녹색 화살표로 표시됩니다. 사구체 출혈 관련 병리학적 변화는 빨간색 화살표로 표시됩니다. (B) 조직학적 점수의 계산은 CON 그룹 및 PI V 그룹 마우스에서 얻은 췌장, 폐, 간 및 신장 조직에 대해 수행되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/supplementary%20FIG%203.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 복강 내 주사 프로토콜. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충표 2: 췌장염의 중증도에 대한 병리학적 채점 기준. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

복강 내 약물 투여는 췌장 손상을 유발하기 위한 안전하고 효과적인 비침습적 접근법입니다. 이 연구는 다양한 정도의 췌장 손상을 유발하기 위해 마우스에 대한 5가지 고유한 복강 내 주사 프로토콜을 비교하고 중증 급성 췌장염(SAP)에 대한 병리학적 변화와 치료 전략을 조사하기 위해 중증 췌장 손상 모델을 설정했습니다.

Caerulein과 Lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological ...

preparing-mice-model-severe-acute-pancreatitis-via-combination

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 타우로콜레이트나트륨의 췌장 주입을 통해 급성 담췌장염이 있는 마우스 모델을 생성하는 절차를 설명합니다. 이 모델은 췌장에서 타우로콜산나트륨에 의해 유발된 병태생리학적 변화를 연구하는 데 도움이 됩니다.

급성 담췌구염 모델: 췌관관 주입을 통해 급성 담췌구염 마우스 모델을 생성하는 방법

가혹한 급성 췌장염을 위한 동물 모형은 염증성 사건의 진화의 관측을 용이하게 하는 초기 단계에서 병리학적 변화의 연구를 가능하게 합니다. 여기서 우리는 마취 C57BL/6 마우스의 췌장 덕트에 타우로콜린산 나트륨의 역그레이드 주입에 의하여 가혹한 급성 담즙 췌장염의 유도를 위한 프로토콜을 제공합니다.

C57BL/6 마우스에서 타우로콜레이트 나트륨 유도 심한 급성 췌장염

만성 췌장염 (CP)은 췌장의 염증과 섬유증을 특징으로하는 질병이며 종종 난치성 복통과 관련이 있습니다. 이 문서는 2,4,6 -trinitrobenzene 설포닉 산 (TNBS)로 담관 주입을 통해 CP의 마우스 모델을 생성하는 기술을 정제에 초점을 맞추고 있습니다.

담즙 덕트 TNBS 주입을 통한 만성 췌장염을 위한 마우스 모델

중증 급성 췌장염의 마우스 모델은 본원에 기재된다. 여기에 제시된 절차는 매우 빠르고 간단하며 접근 가능하므로 잠재적으로 분자 메커니즘및 급성 췌장염의 다른 치료 내정간섭에 대한 연구가 편리한 방법으로 허용됩니다.

비리오크크레아티드 덕트에 타우로콜레이트 나트륨의 역행 주입을 사용하여 마우스 심각한 급성 췌장염 모델의 설립

본 프로토콜은 췌관 폐쇄를 유발하기 위해 췌관의 시각화 및 췌관의 전기응고를 포함하는 만성 폐쇄성 췌장염을 모델링하는 새로운 접근 방식을 설명합니다.

전기응고술을 통해 확립된 폐쇄성 만성 췌장염 모델

이 동영상은 어떻게 조직 병리학하여 심각도를 평가하기 위해 SJL 마우스 및 면역 hypophysitis를 유도하는 방법을 보여줍니다.

SJL 마우스의 실험적 면역 Hypophysitis의 유도

여기 우리는 즉시 정화하여 intraperitoneal 접종 다음과 찬란 다음 주사 사이트에서 자신의 이해와 움직임을 모니터링하고 이러한 이벤트를 중재 전지 특성화 감염 두뇌 자료에서 집계 프리온 봉 라벨 면역 세포 프리온 이해와 인신 매매를 감시를위한 소설 분석을 설명합니다.

Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링

아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록...

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

멀티 양상 이미징 작은 동물 모델에서 세균성 식민지 공부를위한 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 생물 발광과 생쥐의 감염을...

의 4D 좌석 Multimodality 이미징<em&gt; Citrobacter rodentium</em마우스에서&gt; 감염

우리는 급성 폐 손상을 모델링하기 위해, 분무에 의해 에어로졸 리포 폴리 사카 라이드에 도전하여 호중구 폐 염증을 유도하는 방법을 설명합니다. 또한, 폐 격리, 기관 삽관 및 기관지 세척액에 대한 기본적인 수술 기법도 설명되어 있습니다.

에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법

학습하세요 Caerulein과 LPS 복강 내 주사를 이용한 중증 급성 췌장염 마우스 모델 수립 방법을. 비침습적 기법으로 췌장 손상 및 장기 부전을 유도하여 치료 표적 연구에 활용할 수 있습니다.

Caerulein과 Lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사

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