Caerulein과 Lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사

중증 급성 췌장염의 치료는 동물 모델, 특히 C57BL/6J 선택 배경을 가진 마우스를 사용하여 높은 사망률로 인해 어렵습니다. 우리는 치료 표적을 식별하고 새로운 치료법을 개발하기 위해 병리학적으로 SAP를 조사하고 있으며, 단일 SAP 연구에서 다생쥐 방법을 제공하고 있습니다.

이 연구는 HMGB1 유전자가 심판염을 손상시키는 높은 발현을 발견했으며, 이는 중증 급성 췌장염의 염증성 결석과의 연관성을 시사합니다. 우리의 프로토콜에는 담낭 수축을 유도하고 마우스의 단식을 방해하여 소화액 분비를 차단하여 췌장 조직 손상을 유발하는 Caerulein이 포함됩니다. LPS 주사와 병용하여 마우스에 장기 부전을 동반한 중증 췌장염을 유도했습니다. 이 접근 방식은 비침습적이며 짧은 주기와 높은 반복성으로 구현하기 쉽습니다.

[시연자] 시작하려면 실험 마우스의 무게를 측정하고 기록합니다. Caerulein을 복강내 주사하려면 배가 위를 향하고 머리가 꼬리보다 낮게 위치하도록 마우스를 잡고 잡습니다. 오른손에 주사기를 들고 복부 흰색 선 왼쪽의 피하 피부에 바늘을 삽입합니다. 바늘을 약 3-5mm 앞으로 움직여 복강에 45도 각도로 삽입합니다. 바늘을 고정된 상태로 유지하고 Caerulein을 천천히 주입합니다. 바늘을 뽑은 후 멸균 면봉으로 주사 부위를 부드럽게 마사지하고 눌러 약물이 복강으로 완전히 확산되도록 합니다. 주사 12시간 후, 실험자로부터 반대쪽을 향하도록 실험 상자의 그리드 중앙에 마우스를 놓습니다. 비디오 추적 소프트웨어를 켜고 4개의 동시 시야에 대한 모니터링을 설정합니다. 실시간 모니터링 화면에서 상자 내에서 이동할 수 있는 실험 물체의 길이와 너비를 표시합니다. 15분 동안 마우스 활동을 기록합니다. 5주기 동안 췌장 손상 마우스 모델에서 측정된 거시적 변화는 췌장 손상 그룹 5의 마우스가 3분 이내에 낮은 수준의 이동 거리를 유지하는 반면, 3분 이내의 부동성 비율은 각 후속 주기마다 증가하는 것으로 나타났습니다. 췌장 손상 그룹 5는 다른 실험군에 비해 총 이동 거리가 가장 작았으며 그 차이는 통계적으로 유의했습니다. 대조군과 췌장 손상 그룹 1을 제외한 모든 그룹은 음의 D-값 체중 증가를 보였으며 췌장 손상 그룹 5가 가장 큰 변화를 보였습니다. 생존율 분석은 대조군과 유의미한 차이가 없는 다른 그룹과 달리 5일째까지 췌장 손상 그룹 5에서 80%의 사망률을 나타냈습니다. Caerulein을 복강내 주사한 후 36시간 동안 마우스를 안락사시키고 폼 플레이트 위에 누운 자세로 고정합니다. 복부 정중 절개를 하고 소장관을 오른쪽으로 돌려 췌장을 노출시킵니다. 십이지장과 유문관을 분리합니다. 췌장 아래의 소장을 찾은 다음 장관을 따라 췌장 조직을 완전히 제거합니다. 이빨이 없는 집게를 사용하여 비장을 고정하고 부드럽게 위로 당깁니다. 췌장 머리까지 후췌장 인대 조직을 날카롭게 해부합니다. 그런 다음 담관과 혈관을 분리합니다. 복강에서 췌장 조직을 제거하고 흡수지로 표면의 수분을 두드려 말립니다. 췌장 조직의 무게를 측정하고 기록합니다. 파라핀 절편을 준비한 후 췌장 조직을 자일렌에서 각각 5분 동안 두 번 왁스를 제거합니다. 각 절편을 100마이크로리터의 프로테이나제 K로 처리하고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 필요한 양의 3% 과산화수소를 조직에 첨가하고 20분 동안 배양하여 완전히 침투시킵니다. 샘플의 전체 영역을 50마이크로리터의 평형 완충액으로 덮고 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 조직 샘플에 56마이크로리터의 TDT 배양 완충액을 첨가하고 1시간 동안 배양합니다. 조직 절편을 PBS로 각각 5분 동안 4회 세척한 후 100마이크로리터의 스트렙타비딘-HRP 반응 용액에서 30분 동안 배양합니다. DAB 염색의 경우 각 조직 절편에 50마이크로리터의 DAB를 추가합니다. 절편을 헤마트실린 염색 용액에 3-5분 동안 담근 후 순수한 물로 헹굽니다. 신선한 무수 에탄올을 4회 각각 5분 동안 샘플을 탈수합니다. 백색광 현미경으로 조직학적 검사를 수행합니다. 마우스의 췌장 조직에 대한 TUNEL 염색은 췌장 손상 그룹 5에서 세포 괴사의 증가를 나타냈으며, 다른 그룹에 비해 그레이 스케일 값과 양성 괴사율이 유의하게 높았습니다. 단백질 면역블로팅은 세포 괴사의 마커인 Caspase-3 발현을 평가했으며 췌장 손상 그룹 5 조직에서 상당한 증가를 보여주었습니다. Nexin 5 fit CPI로 표지된 췌장 선포 세포 현탁액의 유세포 분석은 다른 그룹에 비해 췌장 손상 그룹 5에서 통계적 유의성과 함께 현저하게 더 높은 세포 사멸률을 나타냈습니다.