Name: Monitoring Blood-Brain Barrier Opening in Rats with a Preclinical Focused Ultrasound System (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 32 s
Description: 학습하세요 MRI와 집속 초음파를 활용한 쥐 혈뇌장벽 개방 기법을. 경정맥 카테터 삽입으로 약물 전달과 실시간 모니터링이 가능하며, 이 방법은 신경과학 전임상 연구의 재현성을 높입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 NIDCR(National Institute of Dental and Craniofacial Research) 보조금 K99DE032397, UCSF Department Seed Grant(No. 7504831), UCSF RAP 보조금(PI: Kazim Narsinh, MD) 및 German Research Foundation(DFG, GA 3535/1-1)의 일부 지원을 받았습니다.

이 연구의 모든 동물 실험은 캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스 (UCSF) 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 수컷 Sprague-Dawley 쥐(200-250g)가 사용되었습니다. 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 동물 관리 및 사용 지침(Office of Animal Care and Use Guidelines)에 따르면 쥐는 쥐와 쥐를 대상으로 사육되고 보살핌을 받았습니다. 시약과 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 동물 준비
참고: 원내 절차의 경우, 동물을 준비실로 이송하고 절차는 다음과 같이 진행되었습니다.
<ol>
	<li>쥐를 Lucite 챔버에 개별적으로 놓고 의식을 잃을 때까지 의료용 산소 탱크에서 추출한 산소와 혼합된 이소플루란(2%-3%)을 노출시킵니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 
	참고: 이소플루란을 사용한 마취는 장기 MRI 프로토콜을 구현할 수 있습니다.</li>
	<li>챔버에서 쥐를 제거하고 제모(제모) 크림을 사용하여 목의 앞쪽과 뒤쪽 부위의 털을 면도합니다.</li>
	<li>윤활제 연고를 눈에 바르십시오.</li>
	<li>코를 콧방울에 넣어 자연 호흡으로 마취를 유지합니다(이소플루란 기화기는 2%-2.5%, 산소 유량계는 1-1.5L/min).</li>
	<li>마취된 쥐를 가열된 수술대에 놓고 발가락을 꼬집어 확인합니다. 
	참고: MRI 프로토콜에는 T1 가중치 기울기 에코 이미징 및 T2 가중치 스핀 에코 이미징과 같은 대비 향상 시퀀스가 포함되었습니다. 이러한 염기서열은 혈액뇌장벽(BBB) 투과성을 평가하기 위해 가돌리늄(GAD) 기반 조영제 주입 전후에 수행되었습니다. 여기에는 쥐가 MRI 스캐너에 있는 동안 GAD 조영제를 투여하는 것이 포함됩니다7. 이 과정을 용이하게 하기 위해, 랫트에 캐뉼레이션된 카테터로부터 연장된 카테터 튜브가 사용되었다. 확장에는 카테터 커넥터와 30cm 크기의 폴리에틸렌 튜브가 포함되었습니다. 개통을 보장하고 누출을 방지하기 위해 확장 튜브를 헤파린 처리된 글리세롤(250IU 헤파린/1mL 글리세롤)로 세척했습니다.</li>
</ol>
2. 정위 유도 집속 초음파 시스템
참고: 동물들은 옮겨져 정위 FUS 시스템의 테이블 위에 놓였습니다. 마취를 유지하기 위해 쥐의 코를 콧방울 안에 넣었다. FUS 시스템은 함수 발생기, RF 증폭기 및 오실로스코프로 구성됩니다. 변환기를 설정하기 전에 모든 장치가 시스템과 올바르게 연결되었는지 확인했습니다. 트랜스듀서 설정은 다음 단계를 사용하여 완료되었습니다.
<ol>
	<li>두개골의 브레그마 위치에 날카로운 포인터를 놓고 위치를 저장합니다. Bregma의 위치는 정중선에서 Lambda의 전방 9.0mm 위치를 가리켜 식별할 수 있습니다8. 람다는 양측 고막9 사이의 선 중앙에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>초음파 젤을 쥐의 머리, 물 커플링 백 및 변환기(1MHz 주파수)에 놓습니다. 쥐의 피부, 물 커플링 백 및 변환기 사이에 기포가 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>변환기의 동축 BNC 케이블을 FUS 시스템 모듈의 입력에 연결합니다.</li>
	<li>제어 컴퓨터에서) 사전 등록된 쥐 이미지에 대한 로드를 클릭하십시오. 여러 초점 지점과 음압이 선택됩니다.</li>
	<li>제어 컴퓨터에서) 처리 모듈에서 모션 테스트를 클릭하여 트랜스듀서가 버스트 기간 내에 스폿 사이를 이동할 수 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>3단계에서 설명한 초음파 처리 매개변수를 설정합니다.</li>
</ol>
3. 마이크로 버블 주입 및 초음파 처리
<ol>
	<li>microbubble. 를 활성화합니다.
	참고: 이 연구에 사용된 마이크로버블은 직경 1.7μm의 농도와 0.2 × 10 밀리리터당9개의 입자를 특징으로 합니다10. 마이크로버블 바이알은 공급업체가 제공한 처방 지침과 이전에 발표된 report11에 따라 활성화되었습니다.
	<ol>
		<li>루어 락 팁이 있는 5mL 주사기를 준비하고 무첨가 0.9% 염화나트륨 주사 5mL를 채웁니다.</li>
		<li>녹색 캡을 제거하고 시계 방향으로 나사를 조여 주사기를 통풍 디스펜싱 핀(재료 표 참조)에 연결합니다.</li>
		<li>핀 보호 장치를 제거하고 바이알의 고무 마개 중앙에 놓습니다. 스파이크가 스토퍼에 완전히 삽입될 때까지 세게 누릅니다.</li>
		<li>플런저 로드를 눌러 5mL 주사기 전체를 바이알에 비웁니다.</li>
		<li>바이알을 20초 동안 세게 흔들어 모든 내용물을 섞습니다. 일관된 백색의 유백색 액체는 육불화황 지질 미세구가 형성되었음을 보여줍니다.</li>
		<li>필요한 용량을 얻으려면 주사기를 뒤집고 의도한 부피의 현탁액을 5mL 주사기로 천천히 빼냅니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>주입 펌프를 사용하십시오. 
	참고: 주입 접근법12는 주사기 펌프를 사용하여 쥐에게 미세 기포를 전달하는 데 사용되었습니다. 마이크로버블이 들어있는 주사기를 쥐에 삽입한 카테터 커넥터에 연결했습니다. 폴리에틸렌 튜브를 통해 미세기포를 전달하고 주입 펌프 유속을 0.66mL/min으로 설정했습니다. 이 주입 속도를 통해 3mL 주사기에서 3분 동안 2mL의 마이크로버블을 주입할 수 있습니다. 주입은 1 분 동안 초음파 처리 전에 시작되어 2 분 초음파 처리 기간 동안 계속되었습니다.</li>
	<li>sonication. 수행
	참고: 이 연구에서 FUS 펄스는 다음 매개변수로 선택되었습니다: (1) 대상 영역: 왼쪽 해마; (2) 반점의 수 : 뇌의 해마를 덮는 6; (3) 버스트 길이: 10ms; (4) 버스트 기간: 1200ms; (5) 음압 : 0.65 MPa; (6) FUS 시스템의 초음파 처리 모드 메뉴에있는 '버스트 모드'; (7) 초음파 처리 시간 : 120 초.</li>
</ol>
4. 3T 전임상 스캐너를 사용한 MRI 시술
<ol>
	<li>초음파 처리 후, 동물을 전임상 3T 극저온이 없는 스캐너의 테이블로 옮깁니다.</li>
	<li>쥐를 엎드린 자세로 놓습니다. 스캐너에서 가열 패드의 온도를 유지하고 공압 베개 센서를 사용하여 호흡 속도를 모니터링합니다. MRI 프로토콜을 수행하여 다양한 유형의 MR 영상을 테스트합니다(표 1).</li>
	<li>조영제 강화 MRI 외에도 DWI(Diffusion-Weighted Imaging), T2* 매핑, T1 매핑 및 DCE(Dynamic Contrast-Enhanced) MRI와 같은 다른 정량적 이미징 기술을 포함하여 다양한 이미징 연구에 대한 잠재적인 실용성을 입증합니다. 이 연구에서 사용된 MRI 프로토콜은 표 1을 참조하십시오.</li>
	<li>T1 가중 MR 그래디언트 에코 시퀀스 후 GAD 기반 MRI 조영제(Gadavist, 1mmol/kg)를 주입하고 GAD 후 이미지를 획득합니다. 
	참고: 200g의 쥐의 경우 200μL의 MRI 조영제를 주입한 후 200μL 식염수를 주입하여 튜브를 세척했습니다.</li>
</ol>
5. 쥐의 뇌에 대한 거시적 검사
참고: MRI 스캔 후 2mL의 Evans blue solution(인산염 완충 식염수로 희석된 2%)을 주입하고 용액이 몸 전체로 퍼지고 순환할 수 있도록 쥐를 최소 30분 동안 쉬게 했습니다. 그 후, 쥐는 뇌의 거시적 검사를 위해 이소플루란(5%)을 과다 투여하여 안락사시켰습니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 안락사를 확인하기 위해 발가락 주먹질이 필요했고 동물이 최소 1분 동안 호흡이 멈춘 것을 관찰했습니다. 관류 절차를 수행한 후 쥐의 뇌를 검사했습니다. 관류 절차는 다음과 같이 요약됩니다.
<ol>
	<li>수술용 가위를 사용하여 흉부 절개술을 수행하여 가슴의 장기를 노출시키고 심장 부위를 시각화합니다.</li>
	<li>오른쪽 심방을 절개(~5mm)합니다.</li>
	<li>관류 목적으로 식염수를 좌심실에 주입합니다.</li>
	<li>수술용 가위로 두개골 뼈를 열어 뇌를 드러내고 제시합니다. 
	참고: 적절한 관류는 뇌가 균일하게 밝게 보여야 하며, 지속되는 파란색 영역은 Evans blue에서 감지한 바와 같이 BBB 관련 알부민 누출을 나타냅니다.</li>
</ol>

Enhancing Drug Delivery to the Brain: MRI-Guided Ultrasound Techniques in Rats

<ol><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (1), a020412(2015).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+focused+ultrasound+in+the+brain%3A+from+thermoablation+to+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Applications of focused ultrasound in the brain: from thermoablation to drug delivery.</a> Nat Rev Neurol. 17 (1), 7-22 (2021).</li>
<li>Mungur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-intensity+focused+ultrasound+technique+in+glioblastoma+multiforme+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Low-intensity focused ultrasound technique in glioblastoma multiforme treatment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 903059(2022).</li>
<li>Boado, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+brain+uptake+of+a+genetically+engineered+bifunctional+fusion+antibody+targeting+the+mouse+transferrin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and brain uptake of a genetically engineered bifunctional fusion antibody targeting the mouse transferrin receptor.</a> Mol Pharm. 7 (1), 237-244 (2010).</li>
<li>Hendricks, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+delivery+methods+bypassing+the+blood-brain+and+blood-tumor+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+Focus%22%5BJournal%5D)">Novel delivery methods bypassing the blood-brain and blood-tumor barriers.</a> Neurosurgical Focus. 38 (3), E10(2015).</li>
<li>Hynynen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+MR+imaging-guided+focal+opening+of+the+blood-brain+barrier+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits.</a> Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).</li>
<li>Hynynen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+reversible+blood-brain+barrier+disruption+by+non-invasive+focused+ultrasound+at+frequencies+suitable+for+trans-skull+sonications%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Local and reversible blood-brain barrier disruption by non-invasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications.</a> NeuroImage. 24 (1), 12-20 (2005).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive%2C+targeted+creation+of+neuromyelitis+optica+pathology+in+AQP4-IgG+seropositive+rats+by+pulsed+focused+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive, targeted creation of neuromyelitis optica pathology in AQP4-IgG seropositive rats by pulsed focused ultrasound.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 78 (1), 47-56 (2019).</li>
<li>Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+do+you+measure+the+Bregma+for+rodent+stereotaxic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22IBRO+Neurosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery.</a> IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).</li>
<li>Kotopoulis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SonoVue+vs.+Sonazoid+vs.+Optison%3A+Which+bubble+is+best+for+low-intensity+sonoporation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">SonoVue vs. Sonazoid vs. Optison: Which bubble is best for low-intensity sonoporation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 98(2022).</li>
<li>Bracco Diagnostics Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22LUMASON+%28sulfur+hexafluoride+lipid-type+A+microspheres%29+for+injectable+suspension%2C+for+intravenous+use+or+intravesical+use%22">LUMASON (sulfur hexafluoride lipid-type A microspheres) for injectable suspension, for intravenous use or intravesical use</a>. , Lumason - accessdata.fda.gov. (2016).</li>
<li>Lapin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+opening+of+the+blood+brain+barrier+using+focused+ultrasound+with+constant+intravenous+infusion+of+microbubble+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Consistent opening of the blood brain barrier using focused ultrasound with constant intravenous infusion of microbubble agent.</a> Sci Rep. 10, 16546(2020).</li>
<li>Vlachos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+dependence+study+of+the+focused+ultrasound-induced+blood-brain+barrier+opening+at+distinct+pressures+and+microbubble+diameters+using+DCE-MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Permeability dependence study of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening at distinct pressures and microbubble diameters using DCE-MRI.</a> Magn Reson Med. 66 (3), 821-830 (2011).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+all-ultrasound+cranial+imaging+method+to+establish+the+relationship+between+cranial+FUS+incidence+angle+and+transcranial+attenuation+in+non-human+primates+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An all-ultrasound cranial imaging method to establish the relationship between cranial FUS incidence angle and transcranial attenuation in non-human primates in 3D.</a> Sci Rep. 14 (1), 1488(2024).</li>
<li>Plaksin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+analysis+predicts+nanoparticle+concentration+delivered+to+the+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging analysis predicts nanoparticle concentration delivered to the brain parenchyma.</a> Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+and+monitoring+focused+ultrasound+mediated+blood-brain+barrier+opening+in+rats+using+power+Doppler+imaging+and+passive+acoustic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Guiding and monitoring focused ultrasound mediated blood-brain barrier opening in rats using power Doppler imaging and passive acoustic mapping.</a> Sci Rep. 12 (1), 14758(2022).</li>
</ol>

저자는 선언할 관련 이해 상충이 없습니다.

BBB 개방 연구를 위한 경정맥 카테터 삽입의 쥐 모델을 사용하는 프로토콜 및 동물 절차가 개발되었습니다. 수많은 전임상 프로토콜이 존재하지만 이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 FUS 시스템과 쥐 모델을 통합하여 동물 준비 절차를 최소화하여 실험 재현성을 보장합니다.
이 프로토콜에서 마이크로버블 선택은 안정성과 실온 보관을 기반으로 했습니다. 다른 상업용 마이크로버블을 대안으로 고려할 수 있습니다. Kotopoulis et al. 췌장암의 저강도 초음파 다공화에 대한 다양한 미세 기포 유형을 조사하고 비교했습니다10. 시험관 내 결과에 따르면, 본 연구에서 선택된 마이크로버블은 낮은 강도에서 최적의 제형인 반면, 다른 마이크로버블은 높은 강도에서 더 효과적인 것으로 나타났습니다. 그러나 쥐 모델에서 BBB를 여는 데 가장 적합한 미세 기포는 아직 불분명합니다. Vlachos et al.13 은 음압과 미세기포 크기가 BBB 개방량과 혈관 파괴 및 부종과 같은 조직 손상에 미치는 영향을 조사했습니다. 제안된 프로토콜은 쥐 모델에서 사용하기에 가장 적합한 미세 기포 및 초음파 처리 매개변수를 조사하고 식별하기 위한 향후 연구를 권장합니다.
본 연구에서는 다지점 표적화를 위한 빠르고 정확한 기능으로 인해 전임상 FUS 시스템을 선택했습니다. 이 시스템은 사전 정의된 초점을 자동으로 통과하도록 프로그래밍되어 있으며, 이는 표적 조직 영역을 향한 국소 초음파 처리를 용이하게 하는 기능입니다. 대안으로, Sonic Concepts 및 ExAblate Neuro(재료 표 참조)에서 제공하는 것과 같은 확립된 집속 초음파(FUS) 변환기를 사용하여 혈액-뇌 장벽을 열 수 있습니다14,15. 특히, ExAblate Neuro 변환기는 MR 영상과 호환되도록 설계되어 치료 과정에 대한 실시간 안내 및 모니터링을 제공합니다. 앞으로 이러한 변환기는 개발된 프로토콜에 통합될 수 있습니다.
제안된 MRI 프로토콜은 다양한 MRI 시퀀스를 통합하여 다양한 영상 연구에 대한 잠재적인 실용성을 입증합니다. BBB 누출로 인해 MRI 조영제에 의해 유도된 신호 강도의 변화를 포착하기 위해 사전 및 사후 조영제 T1 강조 그래디언트 에코 시퀀스 및 T2 강조 스핀 에코 시퀀스가 권장됩니다. 사용자는 이미징 프로토콜에 DWI, DCE 및 T2* 매핑을 포함할 수 있습니다. MRI 스캐너를 사용하는 대신 Singh 등16 은 BBB 개방 영역과 상관관계가 있는 미세 기포의 캐비테이션을 감지하기 위해 초점 위치 파악 및 수동 음향 매핑을 위해 도플러 초음파 영상을 사용하는 방법을 도입했습니다. 따라서 이 프로토콜은 모든 초음파 시스템 내에서 구현될 가능성이 있으며 잠재적인 대안을 제시합니다.
본 연구에서는 초음파 처리 중 주입을 의미하는 주입 접근법12 를 사용하였다. 이 접근법은 뇌에 지속적으로 미세 기포를 제공하기 때문에 볼루스 주입에 비해 BBB가 더 안정적이고 일관되게 열릴 수 있습니다. Lapin et al.12 는 일관된 BBB 개방을 위한 주입 및 볼루스 접근법 간의 비교를 조사하여 7.2μL Definity 마이크로버블/kg/min 이하의 비율이 다양한 압력 수준에서 부상 없이 BBB를 열 수 있음을 발견했습니다. 그러나 이 접근 방식은 시간이 지남에 따라 주사기 내 미세 기포의 농도를 유지하는 데 잠재적인 제한이 있을 수 있습니다. 미세 기포는 주사기 상단에 떠다니고 응집되는 경향이 있어 미세 기포 용량이 감소할 수 있습니다. 또는 미세 기포의 일시 주입을 안와후 부비동으로 수행할 수 있습니다. 제안된 프로토콜을 사용하는 향후 연구는 쥐 모델에서 BBB 개방을 최적화하기 위해 다양한 마이크로버블 주입 방법 및 유형과의 비교를 탐색해야 합니다.
이 연구의 한계는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 또는 크리스탈 바이올렛 염색 결과와 같은 거시적 손상에 대한 조직화학적 검증이 없다는 것입니다. 그러나 제안된 프로토콜은 뇌의 거시적 손상을 피하기 위해 초음파 처리 및 MRI 매개변수를 최적화하는 데 활용될 수 있습니다. 또한 이러한 한계를 해결하기 위해 조직병리학 분석 절차를 향후 연구에 통합할 수 있습니다.

BBB는 혈관과 뇌 조직 사이의 이온, 분자 및 세포의 이동을 조절합니다1. 이 기능은 신경 기능과 건강을 유지하는 동시에 치료용 고분자 물질이 뇌 조직에 전달되는 것을 방지합니다. BBB의 제한된 투과성은 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병과 같은 뇌종양 및 신경퇴행성 질환에 대한 치료의 효능과 효과를 감소시키는 결과를 초래할 수 있습니다2. 따라서 대류 강화 전달, 직접 두개내 주사, 삼투압 파괴 및 향상된 약물 설계와 같은 다양한 접근 방식이 치료제의 제어 전달을 위해 BBB를 우회하는 것으로 조사되었습니다3,4,5.
그러나 이러한 접근 방식에는 침습성, 감염 위험, 출혈 위험, 이질성 및 약물의 급속한 유출과 같은 본질적인 한계가 있습니다. 마이크로버블을 주입하는 저강도 펄스 집속 초음파(FUS)는 국부적이고 가역적인 BBB 파괴를 허용하는 유망한 비침습적 기술입니다. 마이크로버블과 결합된 초음파의 기계적 효과는 BBB의 투과성(즉, BBB 개구부)을 일시적으로 변경할 수 있습니다6,7. BBB 개구부를 활용한 치료 응용 분야의 추가 발전을 위해서는 in vivo 소동물 실험이 필수적입니다.
이 연구에서는 쥐 모델에서 BBB 개방을 모니터링하기 위한 MRI 프로토콜과 동물 절차를 도입했습니다. 이 프로토콜에는 상업 기관에서 캐뉼러한 경정맥 카테터가 있는 쥐 모델이 포함되었습니다(재료 표 참조). 경정맥 카테터 삽입의 랫트 모델은 신속한 약물 투여, 혈역학적 모니터링 검사 및 안정적인 카테터 삽입의 잠재적인 이점이 있습니다. BBB 개방은 전임상 FUS 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 쥐 및 생쥐와 같은 작은 동물 모델에서 BBB를 개방하기 위해 특별히 설계된 이 시스템은 벤치탑 시스템, 제어 컴퓨터, 변환기, 물 탈기 장치 및 함께 제공되는 액세서리와 같은 필수 구성 요소를 통합합니다. 이 정위 유도 전임상 FUS 시스템을 사용하면 정밀도가 향상될 뿐만 아니라 동물 절차 및 MRI 프로토콜이 간소화되어 전체 실험 프로토콜의 재현성과 단순성에 기여합니다.

<table><tbody><tr><td>1mL 주사기</td><td>BD plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20mL, 염화나트륨 0.9%</td><td>Hospira, Inc</td><td>00409-7101-67</td><td></td></tr><tr><td>3mL 주사기</td><td>BD plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL 주사기</td><td>BD plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>무딘 바늘, 21G</td><td>SAI 주입 기술</td><td>B21-50</td><td></td></tr><tr><td>카테터 커넥터, 21G</td><td>SAI 주입 기술</td><td>CC-25-25</td><td></td></tr><tr><td>카테터 잠금 솔루션</td><td>SAI 주입 기술</td><td>Sku # HGS-10</td><td>(500 &마이크로;/mL) 글리세롤</td></tr><tr><td>에반스 블루</td><td>시그마 알드리치</td><td>E2129-10g</td><td></td></tr><tr><td>ExAblate Neuro</td><td>Insightec Inc., 이스라엘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gadavist</td><td>Bayer</td><td>2068062</td><td></td></tr><tr><td>GE&nbsp; 이소플루란 기화기&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPS-12RS 주사기 펌프</td><td>Inovenso</td><td>IPS-12</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란 USP</td><td>수의사 한 마리</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Lumason 마이크로버블</td><td>Bracco Diagnostics Inc</td><td>SKJ709700</td><td></td></tr><tr><td>수컷 Sprague-Dawley 쥐 (200&ndash; 250g)&nbsp;</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>바늘, 18 G</td><td>BD Precisionglide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Mediatech</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>BD Intramedic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전임상 3T cryogen-free Bruker Biospin 스캐너&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Biospec3T</td><td></td></tr><tr><td>쥐와 경정맥 카테터 삽입</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RK-50&nbsp; 집중 초음파 변환기</td><td>FUS Instruments</td><td>Tx-50-1000-0</td><td></td></tr><tr><td>RK-50 벤치탑 초점 초음파 시스템</td><td>FUS Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic Concepts</td><td>Inc., WA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>통풍 분배 핀&nbsp;</td><td>B 브라운</td><td>4550560</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring blood-brain barrier opening in rats with a preclinical focused ultrasound system

Monitoring Blood-Brain Barrier Opening in Rats with a Preclinical Focused Ultrasound System

뇌에는 혈액-뇌 장벽(BBB)이라고 하는 매우 선택적인 반투과성 혈액 장벽이 있어 치료용 고분자 물질이 뇌에 전달되는 것을 방지합니다. MR 유도 저강도 펄스 집속 초음파(FUS)와 마이크로 버블 사전 주입의 통합은 비침습적 및 무독성 BBB 조절을 위한 유망한 기술입니다. MRI는 우수한 연조직 조영제와 혈관 투과성, 관류 및 MRI 조영제의 공간-시간 분포와 같은 다양한 정량적 평가를 제공할 수 있습니다. 특히, 가돌리늄 기반 MR 조영제를 사용한 조영제 강화 MRI 기술은 BBB 개구부를 감지하기 위한 황금 표준으로 나타났습니다. 이 연구는 쥐 모델에서 BBB 개방을 모니터링하기 위한 MRI 프로토콜 및 동물 절차와 관련된 포괄적인 방법론을 설명합니다. 랫트 모델은 경정맥 카테터 활용의 추가적인 이점을 제공하여 신속한 약물 투여를 용이하게 합니다. 정위 유도 전임상 FUS 변환기는 동물 절차 및 MRI 프로토콜의 개선 및 간소화를 용이하게 합니다. 그 결과 생성된 방법은 재현성과 단순성이 특징이므로 전문 수술 전문 지식이 필요하지 않습니다. 이 연구는 랫드 모델을 사용한 전임상 절차의 최적화에 기여하고 BBB 조절에 대한 추가 연구를 장려하여 신경 장애에 대한 치료 개입을 강화하기 위해 노력합니다.

본 연구는 상용 동물용 FUS 시스템을 사용하여 쥐 모델에서 BBB 개방을 모니터링하기 위한 전임상 프로토콜을 제시합니다. FUS 시스템은 벤치 또는 대형 카트 운반체 위에 설치되었습니다(그림 1). 쥐는 트랜스듀서 홀더가 포함된 프레임 내의 노즈 콘을 통해 산소와 혼합된 이소플루란으로 마취되었습니다. 음향 공동 현상을 감지하기 위해 500 kHz로 공진하는 하이드로폰을 공진 주파수가 1.0 MHz인 FUS 트랜스듀서에 삽입하였습니다.
그림 2에서 보듯이, FUS 시스템에는 초음파 처리 설정과 표적 위치를 조정하는 기능이 포함되어 있습니다. 트랜스듀서가 버스트 주기 내에 지점 간 이동이 가능한지 확인하기 위해 '모션 테스트'를 수행해야 합니다.
BBB가 개방되면 GAD와 Evans blue 분자가 BBB를 통과합니다. T1 강조 MR 영상은 GAD로 인해 유도된 MR 신호 강도의 변화를 포착했습니다(그림 3A). 관류 절차 후, Evans blue로 염색된 조직을 직접 확인할 수 있었습니다(그림 3B).
BBBO의 재현성을 입증하기 위해 세 마리의 쥐를 대상으로 실험을 수행하였습니다. 그림 4A는 초음파 처리 및 GAD 투여 후의 T1 가중 경사 에코 영상을 보여줍니다. 세 차례의 실험 모두에서 표적 부위의 MR 신호 강도가 유의미하게 증가하는 것이 관찰되었습니다. DCE-MR 영상에서는 MRI 조영제 볼러스 투여 후 7-8분 후에 신호 강도의 가장 유의미한 변화가 나타났습니다(그림 4B). T1 가중 경사 및 T2 가중 스핀 에코 시퀀스에서 BBB 개방 영역이 명확하게 나타난 반면, GAD 투여 전의 T1 맵에서는 유의미한 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 4C).
본 연구에서 제안된 동물 및 MRI 프로토콜은 경정맥 카테터 삽입술을 시행한 랫 모델을 이용한 MR 영상 연구의 가능성을 입증합니다. BBB 개방을 탐지하기 위한 새로운 MRI 바이오마커를 조사하기 위해 MR 관류 영상 및/또는 확산 텐서 영상을 프로토콜에 통합할 수 있습니다.
<img alt="초음파 영상 장비 구성; 1 MHz 트랜스듀서, 오실로스코프, 쥐 고정 장치 등이 포함됨." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 1"> 
그림 1: 벤치탑 전임상 FUS 시스템 및 쥐 배치. (A) 벤치탑 전임상 FUS 시스템. (B) 시스템 내 쥐 배치. (C) 1 MHz 트랜스듀서와 하이드로폰, 하이드로폰이 FUS 트랜스듀서의 중심에 배치되어 있음. (D) 쥐의 머리 위에 트랜스듀서와 수조 결합 용기를 배치하는 모습. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig01large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.</a>
<img alt="집속 초음파 타겟팅 분석을 위한 소니케이션 파라미터 표시 및 MRI 지점 국소화." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 2"> 
그림 2: 전임상 FUS 시스템 소프트웨어의 사용자 인터페이스. 전임상 FUS 시스템 소프트웨어의 사용자 인터페이스를 통해 소니케이션 설정과 타겟 위치를 수정할 수 있습니다. 소니케이션을 시작하기 전, 버스트 기간 내에 트랜스듀서가 지점 간에 이동할 수 있는지 확인하기 위해 '모션 테스트'를 수행해야 합니다. 이 기능은 소니케이션 없이 지점 간 트랜스듀서의 이동 시간을 측정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="비교 해부학 분석을 위한 실제 R1, R2 샘플이 포함된 뇌의 관상면 및 축상면 슬라이스." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 3"> 
그림 3: GAD 투여 후 T1 강조 영상 및 BBB 개방 후의 뇌 영역. (A) GAD 투여 후 T1 강조 영상 및 (B) BBB 개방 후 쥐 뇌의 사진. (A)의 R1 및 R2 레이블은 (C)에 표시된 영역에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="동적 대비 증강 MRI; 쥐 뇌 영상; 신호 강도; T1, T2 가중치, T1 매핑." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 4"> 
그림 4: 초음파 처리 및 GAD 주입 후의 MR 영상. (A) 초음파 처리 및 GAD 주입 후 세 마리 쥐의 T1-가중 MR 영상. (B) 쥐 #3의 동적 대비 증강(DCE) MRI로, 시간 변화에 따른 신호 강도의 변화를 보여줌. 빨간색 화살표로 표시된 시점에 GAD 기반 MRI 조영제를 주입함. (C) GAD 조영제 주입 전에 획득한 쥐 #3의 T1-가중, T2-가중 MR 영상 및 T1 맵. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2D 확산 강조 영상 (2D DWI)</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>관상면 2D T1 맵</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>관상면 2D DCE (볼루스 1)</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R2* 맵</td>
			<td></td>
			<td>FLASH 전처치</td>
			<td>희귀 질환 전단계</td>
			<td></td>
			<td>FLASH 게시물</td>
			<td>RARE 게시물</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>서열</td>
			<td>에피제네틱스(Epigenetics)</td>
			<td>글루코코르티코이드 반응 요소 (Glucocorticoid Response Element)</td>
			<td>전달성 해면상뇌증 (Transmissible Spongiform Encephalopathies)</td>
			<td>글루코코르티코이드 수용체(Glucocorticoid Receptor)</td>
			<td>전염성 해면루성 뇌증 (TSE)</td>
			<td>글루코코르티코이드 수용체(Glucocorticoid Receptor)</td>
			<td>글루코코르티코이드 반응 요소</td>
			<td>전염성 해면성 뇌증 (TSE)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TR</td>
			<td>2100 ms</td>
			<td>500 ms</td>
			<td>2400, 1600, 1100, 800, 450, 300 ms</td>
			<td>30 ms</td>
			<td>2000ms</td>
			<td>39.3 ms</td>
			<td>30 ms</td>
			<td>1500 ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>22.1 ms</td>
			<td>12개의 에코;</td>
			<td>10.29 ms</td>
			<td>5.1 ms</td>
			<td>65 ms</td>
			<td>2.9 ms</td>
			<td>5.1 ms</td>
			<td>65 ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 - 47 ms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>두께</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>시야 (Field of view)</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>매트릭스</td>
			<td>192</td>
			<td>192</td>
			<td>192</td>
			<td>256</td>
			<td>192</td>
			<td>128</td>
			<td>256</td>
			<td>192</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA (도)</td>
			<td>90</td>
			<td>60</td>
			<td>90/180</td>
			<td>20</td>
			<td>90/180</td>
			<td>12</td>
			<td>20</td>
			<td>45/180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>슬라이스 수</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>획득 시간</td>
			<td>4분 12초</td>
			<td>3분 12초</td>
			<td>10분 38초</td>
			<td>2분 9초</td>
			<td>1분 52초</td>
			<td>8분 23초</td>
			<td>3분 52초</td>
			<td>1분 24초</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>옵션</td>
			<td>세그먼트 12, 3방향, b = 0, 54, 180, 522 s/mm2</td>
			<td>평균 횟수 = 2, 에코 간격 = 4 ms</td>
			<td>에코 간격 10.3 ms, RARA 인자 2</td>
			<td></td>
			<td>RARE 계수 10, 평균 4</td>
			<td>200 µL 조영제 (Gadavist, 1 mmol/kg)</td>
			<td></td>
			<td>RARE 계수 10, 평균 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200g 쥐 대상, 투여 전 1분, 투여 후 7분, 주사 200 µL/min, 200 µL 식염수 플래시</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 3T MRI 스캐너에서의 전임상 MRI 프로토콜.

이 연구는 자기공명영상(MRI)과 저강도 펄스 집속 초음파(FUS) 프로토콜을 결합한 방법을 설명하며, 경정맥 카테터 삽입이 있는 살아있는 쥐를 활용하여 혈액뇌장벽(BBB) 개구부를 모니터링합니다.

The brain has a highly selective semipermeable blood barrier, termed the blood-brain barrier (BBB), which prevents the delivery of therapeutic ...

monitoring-blood-brain-barrier-opening-rats-with-preclinical-focused

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 Microbubble-매개 집중 초음파 장애는 두뇌의 비침습 타겟 약물 전달을위한 유망...

쥐 모델에서 Transcranial 집중 초음파를 사용하여 혈액 - 뇌 장벽의 MRI를 유도 장애

이 비디오는 마이크로 버블 매개 집속 초음파(FUS)를 사용하여 일시적인 개구부를 만들어 혈액뇌장벽(BBB)을 일시적으로 파괴하는 방법을 설명합니다. 이러한 일시적인 국소 BBB 개구부는 결국 더 큰 크기의 약물 분자를 뇌 실질로 직접 전달하는 데 사용될 수 있습니다.

Focus Ultrasound based microbubble mediated Blood-Brain Barrier Opening: A technique to create localized transient openings in mouse by sosoporation(초음파 기반 마이크로버블 매개 혈액-뇌 장벽 개구부: 초음파 처리에 의한 마우스의 혈액-뇌 장벽에 국부적인 일시적인 개구부를 생성하는 기술)

마이크로 버블 에이전트를 가진 집중한 초음파는 혈액 두뇌 장벽을 초점하고 일시적으로 열 수 있습니다. 이 기술은 혈액 뇌 장벽을 통해 에이전트의 넓은 범위를 제공하기 위해 사용되었습니다. 이 문서에서는 MRI 지침유무이드 없이 설치류 뇌에 국소화된 전달을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

쥐 모델에서 집중 초음파를 사용하여 위치 특정 혈액 뇌 장벽 개방에 대한 벤치 탑 접근

혈액-뇌 장벽 (BBB) 일시적으로 마이크로 버블 매개 집중 초음파로 중단 될 수 있습니다 (FUS). 여기서는 비초음파 전문가가 액세스할 수 있는 모듈식 FUS 시스템을 사용하여 생체 내 고처리량 BBB 개방을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

설치류의 혈액 뇌 장벽 개방을 위한 고처리량 이미지 유도 입체 신경 탐색 및 집중 초음파 시스템

이 프로토콜은 집속 초음파 혈액 뇌 장벽(BBB) 개방, 결과 유전자 발현 평가 및 조직학적 검사를 통한 화학 유전 수용체의 신경 조절 활성 측정을 통해 유전자 전달에 필요한 단계를 설명합니다.

뇌 구조를 표적으로 삼고 화학 유전 학적 신경 조절을 평가하기위한 집중 초음파 유도 혈액 뇌 장벽 개방

이 프로토콜은 혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중 된 초음파 및 마이크로 버블 치료 중에 설치류 뇌의 생체 내 다광 형광 이미징에서 실시간으로 가능하게하는 수술 및 기술적 절차를 설명합니다.

혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중된 초음파 및 마이크로 버블 치료를 시각화하는 실시간 인트라바이탈 다광원 현미경 검사법

기술은 광범위하게 microbubbles와 초음파를 사용하여 마우스의 혈액 - 뇌 장벽을 여는 대해 설명되어 있습니다. 이 기법을 사용하여, 망간은 마우스 뇌에 관리할 수 있습니다. 망간은 depolarized 뉴런에 축적 MRI 대비 에이전트이기 때문에, 이러한 방식의 연결 활동의 이미징을 가능하게합니다.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

이 절차의 전반적인 목표는 비보에 허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 평가 대 한 높은 재현 기법을 제공 하는입니다.

허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.

병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델

학습하세요 MRI와 집속 초음파를 활용한 쥐 혈뇌장벽 개방 기법을. 경정맥 카테터 삽입으로 약물 전달과 실시간 모니터링이 가능하며, 이 방법은 신경과학 전임상 연구의 재현성을 높입니다.

Monitoring Blood-Brain Barrier Opening in Rats with a Preclinical Focused Ultrasound System

더 많은 동영상 탐색