Name: 전혈에서 매우 생존 가능한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 냉동 보존: 초보자를 위한 가이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 배우세요 전혈에서 고생존율 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고 냉동 보존하는 방법을. 밀도 구심 원심분리법을 사용하여 림프구, 수지상 세포, 단핵구를 확보하고 RNA 시퀀싱 및 유세포 분석을 위한 고품질 샘플을 준비하세요.

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<ol><li>Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMathew%2C+J+%22Physiology%2C+Blood+Plasma%22">Physiology, Blood Plasma</a>. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).</li>
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<li>Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+revealed+dysregulated+RNA-binding+protein+expression+patterns+and+functions+in+human+ankylosing+spondylitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis.</a> Front Med. 11, 1369341(2024).</li>
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<li>Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+role+of+lncRNAs+in+amelioration+of+Parkinson%27s+disease+symptoms+by+transplantation+of+dopaminergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells.</a> NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sars-Cov-2+spike+induces+intestinal+barrier+dysfunction+through+the+interaction+between+CEACAM5+and+Galectin-9%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9.</a> Front Immunol. 15, e1303356(2024).</li>
<li>Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+alterations+and+PI3k-PKB+pathway+suppression+in+patients+with+allergic+rhinitis+undergoing+sublingual+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy.</a> Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).</li>
<li>Rucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+mitochondrial+DNA+copy+number+in+circulating+cell-free+DNA+and+extracellular+vesicles+across+cardiovascular+health+status%3A+A+prospective+case-control+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study.</a> FASEB J. 38 (10), e23672(2024).</li>
<li>Ghamrawi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buffy+coat+DNA+Methylation+Profile+is+Representative+of+Methylation+Patterns+in+White+Blood+Cell+Types+in+Normal+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).</li>
<li>Johansson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+biomarker+profiles+in+autosomal+dominant+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease.</a> Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).</li>
<li>Bonaterra-Pastra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+plasma+lipoprotein+composition+and+function+in+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Biomedicines. 9 (1), 72(2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).</li>
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<li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield+but+severely+compromise+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li>
<li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).</li>
<li>Faass, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+heptose+metabolites+and+the+cag+pathogenicity+island+to+the+activation+of+monocytes%2Fmacrophages+by+Helicobacter+Pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori.</a> Front Immunol. 12, e632154(2021).</li>
<li>Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomagnetic+bead+separation+of+mononuclear+cells+from+contaminating+granulocytes+in+cryopreserved+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples.</a> Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).</li>
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<li>Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+stress+assay+in+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+factors+influencing+its+results%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results.</a> Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).</li>
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<li>Chao, S. -H., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavopiridol+inactivates+P-TEFb+and+blocks+most+RNA+polymerase+II+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo.</a> J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).</li>
<li>Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ethylenediamine+tetraacetic+acid+%28EDTA%29+as+in+vitro+anticoagulant+for+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes.</a> Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).</li>
<li>Mohri, M., Rezapoor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heparin%2C+citrate%2C+and+EDTA+on+plasma+biochemistry+of+sheep%3A+Comparison+with+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum.</a> Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).</li>
<li>Edwards, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-mediated+PCR+interference+in+SARS-CoV-2+assays+and+subsequent+reversal+with+heparinase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I.</a> J Virol Methods. 327, 114944(2024).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1000 &마이크로; L Tips</td><td>Gilson</td><td>F174501</td><td>PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>15 mL tube</td><td>Biopioneeer</td><td>CNT-15</td><td>To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>2 mL Cryovials</td><td>Globe Scientific</td><td>3012</td><td>에 대한 환자/치료 조건 당 2 팁 필요PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 20 &micro에 대해 환자/치료 조건당 약 40개의 cryovials</td></tr><tr><td>가 필요합니다. L Tips</td><td>Gilson</td><td>F174201</td><td>세포 계수에 사용; 필요한 부피는 사용된 세포 계수 방법에 따라 다릅니다. 해동할 풀링되지 않은 냉동 PBMC 1mL당 팁</td></tr> 1개가 필요합니다. <tr><td>50mL Conical Tube</td><td>CEM Corporation</td><td>50-187-7683</td><td>PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 해동될 풀링되지 않은 냉동 PBMC 1mL당 3개가 필요합니다.</td></tr><tr><td>CD14 항체</td><td>Biolegend</td><td>325621</td><td></td></tr><tr><td>CD16 항체</td><td>Biolegend</td><td>360723</td><td></td></tr><tr><td>CD19 항체</td><td>Biolegend</td><td>363007</td><td></td></tr><tr><td>CD3 항체</td><td>Biolegend</td><td>300405</td><td></td></tr><tr><td>CD56 항체</td><td>Biolegend</td><td>318303</td><td></td></tr><tr><td>CD66b 항체</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기</td><td>Biopioneeer</td><td>DGN258367</td><td>해동될 풀링되지 않은 냉동 PBMC 1mL당 1</td></tr>개 <tr><td>필요 CPT 단핵 세포 준비 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>362753</td><td>PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Cryo Freezer Box에 대한 환자/치료 조건당 6개의 튜브 필요</td></tr><tr><td></td><td>Southern Labware</td><td>SB2CC-81</td><td>PBMC</Plasma/>Buffy Coat Collection</td>Cryotube Rack Fisherbrand에 대한 환자/치료 조건당 1개 필요</tr><tr><td></td><td></td><td>05-669-45</td> 최대 <td>50개의 cryovial 보유</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection에 대한 환자/치료 조건당 약 2.5mL 필요</td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free 증류수</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td>PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection의 환자/치료 조건당 약 2mL 필요 해동</td></tr><tr><td>할 냉동 PBMC 1mL당 약 9mL 필요EDTA 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td>PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection에 대한 환자/치료 조건당 1개의 튜브 필요</td></tr><tr><td>Flavopiridol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3055-5MG</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR 항체</td><td>Biolegend</td><td>307609</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin</td><td>GeminiBio</td><td>800-120</td><td>PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection에 대한 환자 또는 치료 조건당 약 25mL 필요</td></tr><tr><td>Human Trustain FcX</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292912-1KG-K</td><td>Mr. Frosty</td></tr><tr><td>라벨 프린터</td><td>Phomemo</td><td>M110-WH</td><td></td></tr><tr><td>Live-Dead Stain</td><td>Biolegend</td><td>423105</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>에 사용최대 18개의 튜브를 수용할 수 있습니다. PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection의 환자/치료 조건에 따라 2개의 Mr. Frostys가 필요합니다.</td></tr><tr><td>Multidispense Pipette</td><td>Brandtech</td><td>705110</td><td></td></tr><tr><td>Multidispense Pipette Tips</td><td>Brandtech</td><td>705744</td><td>PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>P1000 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td>에 대해 환자/치료 조건당 약 3개의 팁이 필요합니다.<td></td></tr><tr><td>P20 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F144056M</td><td>세포 계수에 사용; 필요한 부피는 사용된 세포 계수 방법에 따라 다릅니다.</td></tr><tr><td>프린터 라벨</td><td>Phomemo</td><td>PM-M110-3020</td><td>PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 해동될 풀링되지 않은 냉동 PBMC 1mL당 약 5개의 라벨 필요</td></tr><tr><td>RNase-Free EDTA (0.5 M)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>약 40 &마이크로; L 해동할 냉동 PBMC 1mL당 필요</td></tr><tr><td>RNase-Free PBS (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>해동할 냉동 PBMC 1mL당 약 1mL 필요</td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Transfer Pipettes Fisherbrand에 대한 환자 또는 치료 조건당 약 80mL 필요</td></tr><tr><td></td><td></td><td>13-711-7M</td><td>PBMC/Plasma/Buffy Coat 수집 튜브 홀더에 대한 환자/치료 조건당 약 5개 필요</td></tr><tr><td></td><td>Endicott-Seymour</td><td>14-781-15</td><td>최대 80개의 CPT/EDTA 튜브 보유</td></tr></tbody></table>

전혈에서 매우 생존 가능한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 냉동 보존: 초보자를 위한 가이드

Isolation and Cryopreservation of Highly Viable Human Peripheral Blood Mononuclear Cells From Whole Blood: A Guide for Beginners

PBMC 수집 및 동결 보존 후, 56개의 고유한 샘플에서 해동된 PBMC, 단핵구 및 림프구의 생존력을 제조업체의 지침에 따라 표 4에 나열된 시약을 사용하여 유세포 분석으로 평가했습니다(그림 2A-F). PBMC, 단핵구 및 림프구의 평균 ±SD 생존율은 각각 94± 4.0%, 98± 1.1%, 93± 5.6%로 달성되었습니다(그림 2G). Trypan Blue 배제에 의한 생존도 측정은 평균 생존율이 88 ± 7.5%이고 세포 수가 2.3 x 106 ± 1.9 x 106이었습니다. 유세포 분석 분석은 또한 살아있는 단핵구가 17 ± 5.9%를 차지하고 림프구가 전체 PBMC의 53 ± 13.0%를 구성한다는 것을 보여주었습니다.
이어서, 유세포 분석에 의해 59개의 고유한 샘플로부터 해동된 PBMC로부터 단핵구를 분류하고, 다른 문헌24에 기술된 바와 같이 라이브러리 준비 및 RNA-시퀀싱을 위해 제출하였다. 93 ± 6.3%의 판독 정렬과 49.6 ± 1.4%의 GC 함량으로 평균 ±18.0 ± 1,630만 개의 SD 총 염기서열 수가 달성되었습니다(그림 3A-B). 56개의 고유 샘플의 하위 집합에서 평균 SD 고유 매핑 읽기 비율이 88 ± 3.6%인 것으로 나타났습니다.± 이러한 매개변수는 고품질 RNA 염기서열분석을 포함한 다운스트림 응용 분야에 적합한 실행 가능한 PBMC가 이 프로토콜을 사용하는 모든 수준의 실험실 교육을 받은 작업자가 얻을 수 있음을 보여줍니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>구성 요소</td>
			<td>밀도</td>
			<td>인용</td>
		</tr><tr><td>혈장</td>
			<td>1.022 g/mL 내지 1.026 g/mL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>혈소판</td>
			<td>&lt;1.061 g/mL - &gt;1.070 g/mL</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>PBMC (폴리엠비엠비)</td>
			<td>&lt;1.077g/mL</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>저밀도 호중구*</td>
			<td>&lt;1.077g/mL</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>과립구(호중구*, 호염기구 및 호산구)</td>
			<td>&gt;1.077g/mL</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>적혈구</td>
			<td>1.11g/mL</td>
			<td>4</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 전혈의 성분을 밀도가 감소하는 순서로 나열. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>레이건트/소재</td>
			<td>금액(CPT 튜브 6개 및 EDTA 튜브 1개당)</td>
			<td colspan="5">팁</td>
			<td colspan="3">주의 문구</td>
		</tr><tr><td>CPT 튜브</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="5">환자 또는 샘플 ID에 따라 라벨을 부착합니다.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>EDTA 튜브</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">환자 또는 샘플 ID에 따라 라벨을 부착합니다.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>50 mL 코니컬 튜브</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">환자 또는 검체 ID 외에도 PBMC용 튜브 1개와 폐기물용 튜브 1개에 라벨을 부착합니다.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>크라이오비얼</td>
			<td>39</td>
			<td colspan="5">PBMC의 경우 라벨 30, EDTA 플라즈마의 경우 8, 버피 코트의 경우 1. 모든 극저온을 사용할 수 있는 것은 아닙니다.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>미스터 프로스티</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">이소프로판올을 중간 지점까지 채우고 -20°C에서 밤새 미리 식힙니다.</td>
			<td colspan="3">이소프로판올은 가연성 자극제입니다. 스파크/화염으로부터 멀리하십시오. 흡입을 피하고 장갑을 끼고 주의하십시오.</td>
		</tr><tr><td>플라보피리돌</td>
			<td>100 μL의 1000X 스톡</td>
			<td colspan="5">1000X 플라보피리돌 스톡을 제조하려면 DMSO 1.14mL에 플라보피리돌 5mg을 10mM 농도로 현탁시킵니다. 200 μL를 개별 용기에 분취 한 다음 얼립니다. 사용하려면 개별 부분 표본을 해동하고 DNase/RNase가 없는 증류수에 1:10으로 희석한 다음 1000X 용액으로 사용합니다.</td>
			<td colspan="3">플라보피리돌은 자극제입니다. 장갑으로 다루고 주의하십시오.</td>
		</tr><tr><td>해결 방법 1</td>
			<td>50mL</td>
			<td colspan="5">RPMI 중간. 50mL의 원액을 만들려면 50mL의 RPMI 배지를 사용합니다.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>해결 방법 2</td>
			<td>15mL</td>
			<td colspan="5">RPMI 배지 + 12.5% 인간 혈청 알부민 + 1μM 플라보피리돌. 50mL의 원액을 만들려면 25mL RPMI 배지 + 25mL 인간 혈청 알부민 + 50μL 1000X 플라보피리돌을 사용합니다.</td>
			<td colspan="3">플라보피리돌은 자극제입니다. 장갑으로 다루고 주의하십시오.</td>
		</tr><tr><td>해결 방법 3</td>
			<td>15mL</td>
			<td colspan="5">RPMI 배지 + 11.25% 인간 혈청 알부민 + 1μM 플라보피리돌 + 10% DMSO. 50mL의 원액을 만들려면 22.5mL RPMI 배지 + 22.5mL HSA + 5mL DMSO + 50μL 1000X Flavopiridol을 사용합니다.</td>
			<td colspan="3">플라보피리돌(Flavopiridol)은 자극제이며 DMSO는 독성이 있어 피부를 통해 쉽게 흡수됩니다. 장갑으로 다루고 주의하십시오.</td>
		</tr></tbody></table>표 2: PBMC를 수집하고 동결 보존하기 위해 준비하고 라벨을 부착해야 하는 시약 및 물질 체크리스트.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>레이건트/소재</td>
			<td>양(냉동 PBMC 1mL 분취액당)</td>
			<td colspan="2">팁</td>
			<td>주의 문구</td>
		</tr><tr><td>해결 방법 4</td>
			<td>10mL</td>
			<td colspan="2">PBS + 2mM EDTA 50mL의 원액을 만들려면 5mL 10X PBS + 200μL 0.5M EDTA + 44.8mL DNase/RNase-free 증류수를 사용합니다.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>50 mL 코니컬 튜브</td>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">환자 또는 검체 ID 외에도 사전 변형된 PBMC의 경우 튜브 1개, 변형 후 PBMC의 경우 1개, 폐기물의 경우 1개의 튜브에 라벨을 부착합니다. 사전 염색된 PBMC용으로 라벨이 부착된 튜브에 동결 PBMC의 mL당 9mL의 용액 4를 채웁니다.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">세포 계수용; 환자 또는 샘플 ID가 있는 라벨</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>0.4% 트리판 블루 용액</td>
			<td>20 μL</td>
			<td colspan="2">세포 계수용; 전날 미리 1.5mL 튜브에 추가할 수 있습니다.</td>
			<td>트리판 블루는 발암 물질입니다. 장갑으로 다루고 주의하십시오.</td>
		</tr></tbody></table>표 3: PBMC의 해동 및 계수를 위해 준비하고 라벨을 부착해야 하는 시약 및 재료의 체크리스트.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>시약/재료</td>
			<td>금액(100만 셀당)</td>
		</tr><tr><td>살아있는 죽은 얼룩</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>휴먼 트러스트 테인 FcX</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD3 항체</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD19 항체</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD56 항체</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD66b 항체</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>HLA-DR 항체</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD14 항체</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD16 항체</td>
			<td>2.5 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>RNA신</td>
			<td>100개 유닛</td>
		</tr></tbody></table>표 4: 유세포 분석에 의한 PBMC에서 단핵구 분리를 위한 시약 표.
<img alt="밀도 구배 원심분리 다이어그램의 혈액 성분 분리; 플라즈마, PBMC, 버피 코트 레이어." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 밀도 구배 원심분리 또는 EDTA 튜브에서 원심분리로 분리한 전혈 성분. (A) 밀도 구배 원심분리 튜브에서 전혈을 원심분리하면 밀도 구배 배지 위의 혈장, 혈소판 및 PBMC가 밀도 구배 배지 아래에 다핵 및 적혈구가 분리됩니다. (B) EDTA 튜브에서 전혈을 원심분리하면 최상층에서 혈장을, 최하층에서 적혈구를, 계면에서 버피코트를 분리합니다. Biorender.com 로 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="유세포 분석 산점도; PBMC, 단핵구, 림프구; 생존력 분석, 세포 유형 그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 해동된 동결 보존된 PBMC의 생존력은 활성/데드 플로우 염색 및 유세포 분석으로 평가되었습니다. (A) 별표 *로 표시된 파편은 전방 및 측면 산란 게이팅에 의해 PBMC에서 제외됩니다. (B) 전체 PBMC의 대표적인 살아있는/죽은 분석 (C) Pan-monocyte는 다음 FITC 표지 표면 항원(CD3, CD19, CD56 및 CD66b)에 대해 HLA-DR 양성 및 음성으로 gated. (D) 단핵구의 대표적인 살아있는/죽은 분석. (E) 다음 FITC 표지된 표면 항원에 의해 차단된 림프구: CD3, CD19, CD56 및 CD 66b. (F) 림프구의 대표적인 살아있는/죽은 분석. (G) 56개 샘플에서 정량화된 각 세포 유형의 생존율(%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="FastQC 데이터 분석 그래프; 백만 개의 시퀀스 대 정렬 가능한 GC 콘텐츠 배포." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 냉동 보존된 PBMC에서 분류된 단핵구의 RNA 염기서열 분석 품질. 56개의 고유한 샘플이 염기서열 분석되었고 총 염기서열 1,630만 ± 평균 SD 18.0± 생성되었습니다. (A) 염기서열의 92.5% ± 6.3%가 기준 게놈과 일치하여 정렬률이 높았습니다. (B) 이들 서열의 GC 함량은 49.6 ± 1.4%였다. FastQC25로 제작되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 비디오 1: 원심분리기 사용 방법 시연 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794_R1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 비디오 2: 다중 디스펜서 피펫 작동 방법 시연. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794_R2.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are commonly used in biomedical research on the immune system and its response to disease and pathogens. This ...

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오에서는 면역자기 음성 분리를 통해 전인의 혈액에서 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 단핵구는 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

면역자기 음성 선택에 의한 전혈에서 단핵구의 분리

이 비디오에서는 밀도 구배 원심분리를 통해 인간 버피 코트에서 단핵구와 림프구를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 PBMC는 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells from Human Buffy Coats

추가 분석을 위한 다양한 성분을 얻기 위해 전혈을 처리하는 방법론을 간략하게 설명합니다. 당사는 비임상 환경에서 전혈 샘플의 빠르고 높은 처리량의 동시 처리를 가능하게 하는 간소화된 프로토콜을 최적화했습니다.

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유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기에서는 인간 항응고 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 말초 혈액 단핵 세포에서 자기 비드 분리에 의해 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 5일 동안 배양한 후 인간 단핵구는 미성숙 수지상 세포로 분화되고 비임상 환경에서 실험 절차를 수행할 준비가 됩니다.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

이 프로토콜은 번역 바이오마커 분석에 사용될 수 있는 임상 시험 현장에서 고품질 PBMC 및 플라즈마 바이오샘플의 임상 구현 가능한 제제를 상세히 설명합니다.

바이오마커 분석을 위한 임상 시험 현장에서 단하나 혈액 무승부에서 말초 혈액 단핵 세포 펠릿 및 플라즈마의 준비

우리는 세자리 증후군으로 진단 된 환자로부터 얻은 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포를 분리하기위한 간단한 프로토콜을 제시하고, CD4 + T 세포의 선택, phorbol12-myristate13-acetate 및 A23187 ionophore로 자극, 전사 프로파일 링을위한 RNA 준비.

전사 프로파일링을 위해 세자리 증후군 환자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 CD4+ T 세포 분리

분리된 말초 혈액 단핵 세포는 면역 기능 및 장애, 대사 질환 또는 미토콘드리아 기능의 분석에 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 전혈에서 PBMC를 준비하고 후속 냉동 보존을 위한 표준화된 방법을 설명합니다. 냉동 보존은 이 시간과 장소를 독립적으로 만듭니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포의 냉동 보존 및 생체 에너지 평가

여기서는 냉동 보존된 전혈 샘플에 대한 사이토카인시스 블록 소핵 분석을 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 소핵 분석을 위한 전혈의 이 최적화된 냉동 보존 방법은 대규모 샘플링 및 다기관 연구에 신뢰할 수 있는 기술이며 다른 혈액 관련 분석에도 사용할 수 있습니다.

냉동 보존된 전혈에 대한 소핵 분석

이 프로토콜은 바이오뱅킹 및 기타 목적을 위해 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 고처리량 자동화 호환 방법에 대해 자세히 설명합니다.

High Throughput Immunomagnetic Bead Separation을 통해 Buffy Coats에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 분리

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전혈에서 매우 생존 가능한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 냉동 보존: 초보자를 위한 가이드

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