Name: Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 학습하세요 Mycobacterium abscessus에 대한 고처리량 약물 스크리닝 분석법을 개발하는 방법을 배우세요. 이중 리포터 균주와 로봇 자동화를 활용하여 약물 발견을 가속화하고 내성 균주에 대한 새로운 치료제 선도 물질을 식별할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Dual Reporters를 사용한 Mycobacterium abscessus 에 대한 High-Throughput Screening Assay

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<li>Nathavitharana, R. R., Strnad, L., Lederer, P. A., Shah, M., Hurtado, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+questions+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+M.+abscessus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Top questions in the diagnosis and treatment of pulmonary M. abscessus disease.</a> Open Forum Infect Dis. 6 (7), ofz221(2019).</li>
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<li>Gupta, R., Netherton, M., Byrd, T. F., Rohde, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter-based+assays+for+high-throughput+drug+screening+against+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reporter-based assays for high-throughput drug screening against Mycobacterium abscessus.</a> Front Microbiol. 8, 2204(2017).</li>
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<li>Lopez-Roa, P., Esteban, J., Munoz-Egea, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+review+on+the+mechanisms+of+pathogenicity+in+Mycobacterium+abscessus%2C+a+rapidly+growing+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Updated review on the mechanisms of pathogenicity in Mycobacterium abscessus, a rapidly growing emerging pathogen.</a> Microorganisms. 11 (1), 90(2022).</li>
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<li>Hurst-Hess, K. R., Rudra, P., Ghosh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+protection+as+a+mechanism+of+lincosamide+resistance+in+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ribosome protection as a mechanism of lincosamide resistance in Mycobacterium abscessus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (11), e0118421(2021).</li>
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<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+l%2Cd-transpeptidases+are+susceptible+to+inactivation+by+carbapenems+and+cephalosporins+but+not+penicillins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus l,d-transpeptidases are susceptible to inactivation by carbapenems and cephalosporins but not penicillins.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (10), e00866-e00917 (2017).</li>
<li>Alvirez-Freites, E. J., Carter, J. L., Cynamon, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+activities+of+gatifloxacin+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1022-1025 (2002).</li>
<li>Braback, M., Riesbeck, K., Forsgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibilities+of+Mycobacterium+marinum+to+gatifloxacin%2C+gemifloxacin%2C+levofloxacin%2C+linezolid%2C+moxifloxacin%2C+telithromycin%2C+and+quinupristin-dalfopristin+%28synercid%29+compared+to+its+susceptibilities+to+reference+macrolides+and+quinolones%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibilities of Mycobacterium marinum to gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, telithromycin, and quinupristin-dalfopristin (synercid) compared to its susceptibilities to reference macrolides and quinolones.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1114-1116 (2002).</li>
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Mycobacterium abscessus(Mab)는 특히 낭포성 섬유증 및 기타 폐 질환이 있는 사람들에게 폐 감염을 일으키는 기회 감염 병원체입니다. Mab에 의한 감염은 다제내성 결핵에 필적하는 정교한 내재적 약물 내성으로 인해 치료가 어려운 것으로 악명이 높다1. 사용 가능한 약물은 불침투성이 높은 마이코박테리아 세포 외피와 항생제를 비활성화하는 여러 효소를 암호화하는 게놈으로 인해 대체로 효과가 없습니다2. 따라서 치료에는 몇 달에서 몇 년이 걸리는 여러 약물의 조합이 포함됩니다. 이처럼 까다로운 다중 약물 요법과 낮은 환자 순응도가 결합되어 평균 완치율이 30%에서 50%에 이릅니다3. 또한, 비결핵성 마이코박테리아에 의한 폐 감염의 유병률은 Mab 1,4에 의한 감염을 포함하여 지난 수십 년 동안 증가했습니다. 그 결과, 과학계는 Mab 감염을 치료하기 위한 새로운 화합물을 개발하기 위해 경쟁하고 있습니다.
이 목표를 위해 추구하는 전략 중 하나는 기존 약물에 대한 새로운 치료 기회를 식별하는 과정인 약물 용도 변경입니다. 이는 신약의 발견 및 개발 파이프라인에 수반되는 가장 큰 과제인 시간5를 우회합니다. 이 간단한 개념은 여러 약물의 이미 확립된 약동학 및 안전성 프로파일을 활용하여 개발 비용을 줄이고 약물을 벤치에서 병상까지 가져오는 데 걸리는 시간을 단축합니다6. 따라서 수백에서 수천 개의 이러한 화합물을 결합한 라이브러리가 컴파일되어 연구자들은 관심 병원체에 대한 약물 용도 변경 가능성을 신속하게 테스트할 수 있습니다.
Mab에 대한 약물 개발에 대한 대부분의 연구는 마이코박테리아(colony-forming units,7)에 대한 화합물의 시험관 내 활성을 평가하는 황금 표준이지만 전통적인 분석을 기반으로 합니다. 정확성에도 불구하고 이 절차는 시간이 매우 많이 소요되며, 수천 개의 화합물이 포함된 라이브러리를 테스트하려는 경우 빠르게 실현 불가능하게 됩니다. 이를 위해 고처리량 스크리닝(HTS)이 약물 개발에 통합되었으며, 로봇 공학 및 액체 처리 장치를 활용하는 강력한 분석법으로 수천 개의 화합물을 병렬로 신속하게 스크리닝할 수 있습니다8. 이는 일반적으로 96웰, 384웰, 1536웰 또는 3456웰 형식의 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 초기에 단일 농도를 테스트하여 수행되며, 이는 히트를 식별하고 임상적으로 사용할 수 있도록 파이프라인을 따라 추가로 최적화하기 위한 시작점 역할을 합니다.
리포터 기반 분석은 다른 염료 및 흡광도 기반 분석에 비해 단순성과 감도로 인해 HTS의 견고성에 상당한 이점을 제공합니다 7,9. 그러나 우리가 아는 한, Mab9에 대한 고처리량 스크리닝을 최적화한 연구는 소수에 불과하다.
최근 우리 연구실에서는 발광과 형광10을 동시에 방출할 수 있는 이중 리포터 균주를 개발하였다. Mab operon_mScarlet는 그러한 균주 중 하나입니다. 박테리아 루시페라아제(luxAB 유전자 발현에 의해)와 장쇄 알데히드 기질(luxCDE 유전자 발현에 의해)을 포함하는 LuxABCDE 오페론의 발현으로 인해 자동 발광합니다. 반면에, 형광 판독은 최근에 개발된 적색 형광 단백질인 mScarlet의 발현을 통해 얻어지는데, 이 단백질은 일반적으로 사용되는 eGFP 및 mCherry 단백질을 능가하여 더 강력한 신호(11)를 제공한다. 이 균주를 사용하면 시약을 추가하거나 추가 단계를 수행하지 않고도 마이크로플레이트 리더에서 발광 신호를 측정하여 액체 배양에서 박테리아 생존력을 평가할 수 있습니다. 검출 측면에서, intrinsic fluorescence는 염료나 항체를 사용하지 않고 살아있는 세포 또는 고정된 세포에서 현미경을 시각화할 수 있습니다. 두 판독값을 모두 가진 단일 균주를 사용하면 HTS 분석에서 이를 사용할 때 상당한 이점이 있습니다 - 분석의 특성에 따라 균주를 교환할 필요가 없기 때문에 판독값이 다른 분석 간의 변동성이 줄어듭니다.
따라서 이 작업은 자체 엔지니어링된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mab에 대한 고처리량 분석을 개발했습니다(그림 1). 이를 통해 상업용 라이브러리를 사용하여 용도 변경을 목적으로 하는 in vitro activity 1280 약물을 빠르게 평가할 수 있었습니다( 재료 표 참조). 첫째, 발광을 사용한 배양 분석에서 활성을 평가하고, 둘째, 형광 신호를 이용하는 Mab 감염 대식세포를 사용하여 생체 내12에서 볼 수 있는 감염 과정을 더 잘 모방함으로써 활성을 평가했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig01v2.jpg"> 그림 1: 확립된 프로토콜의 그래픽 요약. 이 스크리닝의 핵심은 자체 개발한 이중 리포터 마이코박테리아 균주로, 모든 실험에서 사용됩니다. 먼저 시약 디스펜서와 플랑크톤 박테리아를 사용하여 단일 농도에서 화합물을 테스트하여 초기 스크리닝을 수행합니다. 식별된 히트는 세 가지 다른 농도를 테스트하는 검증 분석으로 이어집니다. 두 실험 모두 발광 판독값을 사용하여 수행됩니다. 검증된 히트는 감염 분석으로 이어지며, 여기서 세 가지 다른 농도도 테스트되고 골수 유래 대식세포는 MOI 1에서 감염됩니다. High-Content 이미징 시스템은 박테리아 형광 신호를 획득하고, 분석 소프트웨어는 Mycoload 포뮬러를 통해 세포 내 부하를 평가하는 데 사용됩니다. 분석의 복잡성이 증가함에 따라 화합물의 수가 줄어듭니다. BioRender.com 로 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>Bio Optica</td><td>05-01005Q</td><td>고정 용액</td></tr><tr><td>384웰 블랙 라운드 바닥 폴리프로필렌 처리되지 않은 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3658</td><td>White 마이크로플레이트를 사용할 수 있습니다. 폴리스티렌을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>50 TS Washer</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy 밀봉 멤브레인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>셀:: explorer</td><td>Revvity</td><td></td><td>장비 취급 로봇</td></tr><tr><td>Clarithromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3487-100MG</td><td>DMSO에 원하는 농도로 용해</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/4121/PB15</td><td>액체 성장 배지에서 원하는 농도로 희석</td></tr><tr><td>Harmony 5.1</td><td>Revvity</td><td></td><td>분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 인큐베이터, 165 L</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>세포 인큐베이터</td></tr><tr><td>JANUS 4 팁 암 및 MDT 암</td><td>Revvity</td><td></td><td>액체 핸들러</td></tr><tr><td>KB 8182</td><td>Termaks</td><td></td><td>인큐베이터 교반</td></tr><tr><td>Libra S4+</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop&nbsp; 콤비 시약 디스펜서</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opera Phoenix Plus</td><td>Revvity</td><td></td><td>이미징 시스템</td></tr><tr><td>PhenoPlate</td><td>Revvity</td><td>6055302</td><td>고함량 현미경에 필요</td></tr><tr><td>인산염 버퍼 식염수(PBS) 1x</td><td>NA</td><td></td><td>NA 세척 솔루션</td></tr><tr><td>Prestwick 화학 라이브러리&nbsp;</td><td></td><td></td><td>약물 재사용을 위한 상업용 화학 라이브러리</td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터 3031</td><td>GFL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VICTOR Nivo</td><td>Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture medium:</td><td></td><td></td><td>필요한 경우 보충제</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10938-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biowest</td> 10% 추가<td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액 (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>LCCM</td><td>NA</td><td></td><td>NA 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 방출하는 L929 세포주에서 컨디셔닝 배지; 세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>L-글루타민 (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 100 mM (100X)</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Infection 세척 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apirogenic water</td><td></td><td></td><td>여러 공급업체 사용 가능</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution 10x</td><td>Gibco</td><td>14060-040</td><td>흡입력수로 1배로 희석</td></tr><tr><td>Permeabilising Solution</td><td></td><td></td><td>PBS with 0.1% Triton X100</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>다른 공급업체도 사용 가능</td></tr><tr><td>Staining solution</td><td></td><td></td><td>PBS with DAPI (500 ng/mL) 및 HCS Far Red (10 ng/mL)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>HCS Far Red&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>H32721</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td></td><td>여러 공급업체 사용 가능</td></tr><tr><td><강한>액체 성장 매체</강한></td><td></td><td></td><td>필요할 때, 10% 보충제</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td>0.05% 최종 농도를 추가하십시오. 사용 가능한 다른 공급 업체</td></tr><tr><td>< 강> 액체 성장 배지 보충 : < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>D- 포도당 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>G / 0450 / 60</td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Z' 요인 평가 그림 2는 Z' 인자를 계산하기 위해 수행된 두 가지 실험 중 한 가지 실험의 데이터를 보여줍니다. 양성 대조군은 4μg/mL의 클라리스로마이신이었습니다. 두 실험 모두 0.64 및 0.62의 Z' 계수를 산출했으며, 이는 이 분석에 사용된 조건 및 판독값을 후속 스크리닝 분석(Z' &gt; 0.5)에 적용할 수 있음을 의미합니다. 그럼에도 불구하고, 각 실험의 성능을 제어하기 위해 나머지 모든 실험(감염 분석)에 대해 Z' 인자를 계산했습니다.
설계된 HTS 분석의 개념 증명으로 약물 용도 변경을 위한 화합물 라이브러리를 테스트했습니다. 1280개의 다양하고 작은 분자로 구성되어 있으며, 그 중 95%는 FDA 및 EMA 승인 약물입니다. 이 분자는 높은 화학적 및 약리학적 다양성을 제공합니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig02.jpg"> 그림 2: Z' 요인 평가 결과. 2.5 x 105 CFUs/mL의 Mab를 37°C에서 48시간 동안 4μg/mL의 클래리스로마이신과 함께 또는 배제하고 배양했습니다. 배양 기간 후, 마이코박테리아 생존력을 평가하기 위해 발광을 측정했습니다. 이 그래프는 하나의 독립적인 실험에서 처리된 생존 가능한 마이코박테리아와 처리되지 않은 마이코박테리아의 개별 발광 값을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
히트작에 대한 라이브러리 심사 모든 화합물은 Mab에 대해 6.66μM에서 테스트되었습니다. 라이브러리의 크기 때문에 화합물은 4개의 서로 다른 마이크로타이터 384웰 플레이트로 나뉘었습니다(그림 3A-D). 결과는 용매와 검증된 가장자리 효과 모두에 대해 정규화되었습니다.
이 스크리닝 분석에서 33개의 히트가 확인되었으며, 그 중 30개는 발광 방출을 크게 감소시켜 마이코박테리아 생존력을 감소시켰습니다(그림 3). 흥미롭게도, 세 가지 화합물이 더 높은 발광 방출을 유도했으며, 이는 박테리아 대사 증가 또는 증식과 관련이 있을 수 있습니다(그림 3). 이 프로파일이 유지되는지 테스트하기 위해 발광을 증가시키는 3개의 화합물을 포함하여 33개의 모든 히트가 검증 분석으로 수행되었습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig03.jpg"> 그림 3: 라이브러리 스크리닝 결과. (A-D) 2.5 x 105 CFUs/mL에서 Mab를 37°C에서 48시간 동안 6.66μM에서 1280개의 화합물과 함께 배양했습니다. 배양 후, 마이코박테리아 생존력을 평가하기 위해 발광을 측정하였다. 그래프는 하나의 독립적인 실험의 RLU를 보여주며, 용매 및 에지 효과 정규화 후 임의의 단위로 표시됩니다. 임계값을 결정하기 위해 각 플레이트에 대해 AVG RLU 및 해당 SD를 계산했습니다(회색; AVG ± 3SD)를 참조하십시오. 원형 기호는 테스트된 화합물을 나타냅니다. 파란색의 경우, 해당 임계값을 벗어난 모든 화합물은 적중으로 간주됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
히트 검증 분석 이 분석에 사용된 농도는 13.3μM, 6.66μM 및 3.3μM였습니다. 각 화합물은 견고성을 높이기 위해 중복으로 테스트되었습니다.
중요한 것은 이전에 더 높은 RLU(그림 3A,C)와 관련이 있었던 화합물 30, 31 및 32가 화합물 32로 처리된 웰에서 200% 이상의 마이코박테리아 생존력을 달성하면서 이 프로필을 유지했다는 것입니다(그림 4).
화합물 20 및 33은 테스트된 모든 농도에서 마이코박테리아 생존율이 100%에 가깝기 때문에 비활성인 것으로 간주되었습니다(그림 4).
화합물 9 및 21은 두 개의 가장 낮은 농도에서 유사한 비활성을 나타냈다; 그러나 20과 달리 가장 높은 13.3μM에서 활성 상태를 유지하며 화합물 21이 더 높은 효능을 나타냅니다(그림 4).
또한 화합물 3은 화합물 21보다 작지만 가장 낮은 농도에서 비활성과 6.66μM에서 활성 손실을 나타냅니다(그림 4). 가장 낮은 농도에서만 화합물 2, 7, 8, 10, 16, 18, 24 및 28이 더 낮은 치료 잠재력을 나타냈습니다. 그러나 2, 10, 28은 여전히 마이코박테리아 생존력의 &lt;50%를 차지합니다.
전 세계적으로 나머지 14개 화합물은 테스트된 모든 농도에서 활성을 보였습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig04.jpg"> 그림 4: 적중 검증 분석 결과. 2.5 x 105 CFUs/mL의 Mab를 37°C에서 48시간 동안 13.3μM, 6.66μM 및 3.3μM(각각 DMSO의 1.3%, 0.7% 및 0.3%)에서 이전에 확인된 각 히트와 함께 배양했습니다. 배양 기간 후, 마이코박테리아 생존력을 평가하기 위해 발광을 측정했습니다. 이 그래프는 하나의 독립적인 실험에서 처리되지 않은 마이코박테리아에 비해 처리된 생존 가능한 마이코박테리아의 비율을 보여주며, 각 화합물은 중복으로 테스트되었습니다. 라운드 기호는 각 화합물에 대한 중복을 나타냅니다. 막대는 이러한 중복의 평균을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
감염 분석 테스트된 33개의 화합물 중 28개가 감염 분석을 위해 선택되었습니다(그림 4). 화합물 7, 8, 9, 20 및 33은 이 분석을 위해 선택되지 않았습니다. 9, 20 및 33은 검증 시 비활성으로 인해 제외되었지만(그림 4) 처음 두 개는 기술적인 이유로 제외되었습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 화합물은 리팜피신(rifampicin)과 리네졸리드(linezolid)로 확인되었는데, 이들은 이미 Mab 감염을 치료하는 데 사용된 항생제이다12. 감염 분석에서 테스트한 모든 화합물이 확인되었으며 표 1에 나열되어 있습니다. Mab-감염된 대식세포에 대한 화합물의 항균 활성은 박테리아의 고유 형광을 판독값으로 사용하여 평가하였다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>화합물</td>
			<td>이름</td>
			<td>화합물</td>
			<td>이름</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>설파티아졸</td>
			<td>18</td>
			<td>세푸록시메</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>시프로플록사신(Ciprofloxacin)</td>
			<td>19</td>
			<td>리팍시민</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>세포탁심</td>
			<td>21</td>
			<td>세프디니르</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>다우노루비신</td>
			<td>22</td>
			<td>클라리스로마이신</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>독소루비신</td>
			<td>23</td>
			<td>베시플록사신</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>티오스트렙톤</td>
			<td>24</td>
			<td>레보플록사신</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>아미카신</td>
			<td>25</td>
			<td>리파부틴</td>
		</tr><tr><td>11</td>
			<td>뜸살락탐</td>
			<td>26</td>
			<td>가티플록사신(Gatifloxacin)</td>
		</tr><tr><td>12</td>
			<td>설파메티졸</td>
			<td>27</td>
			<td>에피루비신</td>
		</tr><tr><td>13</td>
			<td>설파모노메톡신</td>
			<td>28</td>
			<td>피르비늄 파모에이트</td>
		</tr><tr><td>14</td>
			<td>세폭시틴</td>
			<td>29</td>
			<td>목시플록사신</td>
		</tr><tr><td>15</td>
			<td>노보비오신</td>
			<td>30</td>
			<td>트로레안도마이신</td>
		</tr><tr><td>16</td>
			<td>세프메타졸</td>
			<td>31</td>
			<td>링코마이신</td>
		</tr><tr><td>17</td>
			<td>록시트로마이신</td>
			<td>32</td>
			<td>스피라마이신</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 감염 분석에서 테스트한 화합물 목록. 4단계에서 검증된 화합물은 감염 분석(5단계)에서 테스트되었습니다.
Mab에 감염된 대식세포에 대한 화합물의 독성이 평가된 첫 번째 매개변수였습니다. 화합물을 독성 또는 무독성으로 간주하기 위해 설정된 임계값은 생존 가능한 대식세포의 85%였습니다(그림 5). 테스트된 28개의 화합물 중 4, 5, 6, 27 및 28이 독성이 있는 것으로 간주되었습니다. (그림 5). 따라서, 이들 5가지 화합물은 다음의 대식내 활성 평가에서 제외되었다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig05.jpg"> 그림 5: Mab에 감염된 대식세포에 대한 히트의 독성. BALB/c 마우스 BMM을 Mab(MOI=1)에 감염시키고 이전에 확인된 각 히트를 13.3μM, 6.66μM 및 3.3μM(각각 DMSO의 1.3%, 0.7% 및 0.3%)에서 7%CO2로 37°C에서 48시간 동안 배양했습니다. 세포 생존율을 측정하기 위해 핵의 수(DAPI로 염색)를 사용하여 고함량 스크리닝 형광 현미경으로 세포를 이미지화했습니다. 이 그래프는 두 개의 독립적인 실험에서 생존 가능한 비치료 감염 대식세포에 대한 생존 가능한 치료된 감염된 대식세포의 비율을 보여줍니다. 둥근 기호는 각 분석에 대한 세포의 생존력을 나타냅니다. 막대는 두 개의 독립적인 실험의 평균을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
세포 내 Mab에 대한 나머지 23개 화합물의 대식내 활성을 추론하기 위해(그림 6), Mycoload 공식(이전에 6단계에서 설명)을 사용하여 치료되지 않은 감염된 대식세포에 대해 정규화된 마이코박테리아 생존력의 백분율을 얻었습니다. 대부분의 화합물은 적중 검증 분석(그림 4)에 비해 내부화된 마이코박테리아에 대한 치료 잠재력을 잃었는데, 이는 테스트된 최고 농도에서 적중 횟수가 25회에서 6회로 감소했기 때문입니다. 놀랍게도, 처리되지 않은 박테리아에 비해 플랑크톤 Mab의 생존력을 증가시킨 세 가지 화합물 모두(30, 31 및 32; 그림 3 및 그림 4)는 화합물 30 및 32가 화합물 32의 경우 3.3μM에서도 DMSO와 비교할 때 상당한 통계적 차이를 나타내면서 세포 내 Mab에 대한 항마이코박테리아 활성을 나타냈습니다(그림 6). 화합물 11 및 23으로 처리된 마이코박테리아는 13.3μM에서 생존율&lt;50%)을 나타냈습니다. 그러나 이는 DMSO 대조군과 크게 다르지 않았습니다(그림 6). 화합물 21, 26 및 29는 13.3μM에서 상당한 통계적 차이를 보증할 만큼 충분히 강력했으며 29가 가장 활성이었습니다(그림 6). 마지막으로, 화합물 17, 22 및 25는 내부화된 마이코박테리아에 대해 테스트된 모든 농도에서 매우 강력했습니다. 이들은 각각 록시트로마이신(roxithromycin), 클래리스로마이신(clarithromycin) 및 리파부틴(rifabutin)으로 확인되었다(표 1). 세 가지 화합물 중 클래리스로마이신은 Mab에 대해 가장 활성이 높았으며, 마이코박테리아 생존력이 10%를 넘지 않았으며, DMSO와 비교하여 테스트한 모든 농도에서 p-값 &lt;0.0001을 나타냈습니다(그림 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig06.jpg"> 그림 6: Mab에 감염된 대식세포에 대한 Hits의 대식내 활성. BALB/c 마우스 BMM을 Mab(MOI=1)에 감염시키고 이전에 확인된 각 히트를 13.3, 6.66 및 3.3μM(각각 DMSO의 1.3, 0.7 및 0.3%)에서 7%CO2로 37°C에서 48시간 동안 배양했습니다. 세포를 high-content screening 형광 현미경으로 이미지화하고, 형광 신호를 사용하여 Mycoload를 계산하였다(단계 6 참조). 이 그래프는 두 개의 독립적인 실험에서 치료되지 않은 감염된 대식세포와 비교하여 치료된 감염된 대식세포에서 발견된 Mycoload의 백분율을 보여줍니다. 통계는 Dunnet의 다중 비교 테스트와 함께 양방향 분산 분석을 사용하여 수행되었습니다. *, p &lt; 0.05; **, p &lt; 0.01; , p &lt; 0.001; , p &lt; DMSO(용매 제어)와 비교하여 0.0001입니다. 별표는 그래프의 범례와 각 농도에 대해 동일한 색상 코드를 따릅니다. 둥근 기호는 각 분석에 대한 Mycoload를 나타냅니다. 막대는 두 개의 독립적인 실험의 평균을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: Z' 계수 평가에 사용된 384웰 플레이트 레이아웃의 예. 흰색 - 빈 웰 (액체 성장 매체 만 해당); 노란색 - 양성 대조군 (항생제로 처리 된 박테리아); 빨간색 - 음성 대조군(처리되지 않은 박테리아). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 라이브러리 스크리닝에 사용된 384웰 플레이트 레이아웃의 예. 흰색 - 빈 웰 (액체 성장 매체 만 해당); 녹색 - 용매 제어; 빨간색 - 음성 대조군 (처리되지 않은 박테리아); 파란색 - 스크리닝할 화합물. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: 히트 검증에 사용되는 384웰 플레이트 레이아웃의 예. 흰색 - 빈 웰 (액체 성장 매체 만 해당); 녹색 - 용매 제어(중복); 빨간색 - 음성 대조군 (처리되지 않은 박테리아); 파란색 - 스크리닝할 화합물(중복). 희미한 색상은 1:2 연속 희석을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4: 감염 분석에 사용된 96웰 플레이트 레이아웃의 예. 흰색 - 빈 우물 (증발을 방지하기위한 물); 빨간색 - 음성 대조군(처리되지 않은 대식세포); 노란색 - 양성 대조군 (항생제로 처리 된 대식 세포); 녹색 - 용매 제어; 파란색 - 테스트할 화합물입니다. 희미한 색상은 1:2 연속 희석을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 5: 이미지 분석 프로토콜. 이 작업에는 상세한 이미지 분석 프로토콜이 사용되며, 이는 오픈 소스 소프트웨어에 적용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%205.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 결핵균(Mtb) 감염에 대한 약물의 효능을 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 생체 내 감염을 모방하는 Mtb/대식세포 응집체를 포함하는 체외 감염 모델이 생성됩니다. 적절한 항생제를 도입하면 약물 농도가 증가하는 박테리아의 생존을 모니터링하기 위해 레수자린 분석을 통해 그 효능을 테스트합니다.

Mycobacterium tuberculosis 감염 모델에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 분석

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

차세대 항결핵 약물을 위한 초기 약물 개발 과정을 개선할 수 있는 새로운 모델과 분석이 매우 바람직합니다. 여기에서는 고처리량 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있는 결핵균에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 빠르고 저렴한 BSL-2 호환 분석에 대해 설명합니다.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

세포 변성 효과 (CPE) 기반의 분석, 용량 - 반응 분석 및 시간 - 중 - 추가 TOA () 분석 등의 세 가지 분석은 물론, 개발, 최적화, 검증 및 Bluetongue 바이러스에 대한 새로운 항 바이러스제 (BTV)를 식별하기 위해 사용 된 새로 확인 된 항 바이러스제에 사용할 수있는 기계 장치의 액션 (대학교 미술관)을 결정하기로.

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

여기에서 우리는 세포 독성을 설명하고 화합물의 신속하고 정확한 검사를 허용 한 라운드 감염의 분석은 세포 독성 (CC 50)을 결정하고, WT 및 약물 HIV-1 저항에 대한 IC 50 값.

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

이 프로토콜은 유형 I 및 III IFN 발현 시그니처 분석을 위한 고처리량 qRT-PCR 분석을 설명합니다. 이 분석은 이러한 유전자의 매우 유사한 전사체 간의 단일 염기쌍 차이를 구별합니다. 배치 조립 및 로봇 피펫팅을 통해 분석은 일관되고 재현성이 있습니다.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

학습하세요 Mycobacterium abscessus에 대한 고처리량 약물 스크리닝 분석법을 개발하는 방법을 배우세요. 이중 리포터 균주와 로봇 자동화를 활용하여 약물 발견을 가속화하고 내성 균주에 대한 새로운 치료제 선도 물질을 식별할 수 있습니다.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

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