Name: A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 4 s
Description: 배우세요 성인 마우스에서 망막 색소 상피 세포를 간소화된 방법으로 분리하고 배양하는 기술입니다. 이 프로토콜은 높은 순도의 RPE 배양을 제공하여 황반변성 등 망막 질환 연구에 활용됩니다.

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이 간행물에 보고된 연구는 NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250(C.S.S.), NIH Grant F31EY035156(AH) 및 P30 EY011373의 지원을 받았습니다. 자금 지원 기관은 이 연구의 설계나 수행에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

이 연구에서 동물 피험자의 사용은 Case Western Reserve University의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1. 시약 준비
<ol><li>칼슘, 마그네슘, 페놀 레드가 없는 Hank's Balanced Sal 용액(HBSS)에 10mM HEPES 완충 용액을 보충하여 세척 완충 매체를 준비합니다. 사용할 때까지 용액을 4°C에서 유지하십시오.</li>
	<li>Dulbecco's Modified Eagle's Medium에 4.5g/L 포도당, 1.25x GlutaMAX 보충제(스톡 농도 100x 또는 200mM, 최종 농도 2.5mM L-글루타민), 소 태아 혈청 10%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, MEM 비필수 아미노산 용액 1개(100x)를 보충하여 RPE 배지를 준비합니다. 사용하기 전에 수조에서 미디어를 37°C로 사전 예열하십시오.</li>
</ol>2. 쥐 눈 추출
<ol><li>가급적이면 생후 3주에서 14주 사이의 마우스를 IACUC가 승인한 안락사 방법(이 연구에서는 마우스 20g당 0.1mL의 케타민/자일라진 칵테일[87.5mg/kg 케타민 및 12.5mg/kg 자일라진]을 사용한 마취 하에 자궁경부 탈구)을 사용하여 안락사시킵니다. 참고: 어린 쥐에서 채취한 눈은 시간이 지남에 따라 망막 색소 상피 세포 수율을 증가시키고 연속적인 통과 능력을 확장합니다.</li>
	<li>눈을 위로 향하게 하여 마우스를 옆으로 평평하게 눕힙니다.</li>
	<li>검지와 엄지를 각각 눈 위와 아래에 놓습니다. 눈을 둘러싼 뼈 구조에 부드럽게 압력을 가하여 안구의 돌출을 유도합니다.</li>
	<li>약간 열린 가위의 끝을 눈 아래에 삽입하고 눈이 소켓에서 분리될 때까지 손목을 눈에서 90° 부드럽게 회전시킵니다. 알림: 눈이나 시신경을 절단하기 위해 가위를 닫지 마십시오., 아이컵의 해부를 더 어렵게 만들 수 있습니다.</li>
	<li>즉시 눈을 70% 에탄올에 넣고 5초 이상 굴린 후 얼음 위에 보관된 세척 완충 매체로 옮깁니다.</li>
	<li>해부 현미경으로 한 번에 한쪽 눈을 세척 완충액과 적신 거즈 조각으로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>핀셋으로 시신경을 잡아 눈을 안정시킵니다. 3.00mm 45° 수술용 칼 또는 0.009인치 면도날을 사용하여 오라 세라타 높이를 부드럽게 절개합니다.</li>
	<li>Vannas 가위를 사용하여 절개 부위에 가위를 부드럽게 삽입하고 전방분절과 유리체를 제거하고 버릴 수 있을 때까지 ora serrata 둘레를 자릅니다.</li>
	<li>RPE 층을 방해하지 않도록 주의하면서 끈으로 묶인 집게를 사용하여 아이컵에서 망막을 부드럽게 벗겨냅니다. 참고: 망막을 더 쉽게 제거하려면 전사 피펫에 세척 버퍼 매체를 채우고 아이컵 가장자리에 조심스럽게 적용하여 망막을 부드럽게 들어 올립니다.</li>
	<li>마지막으로 가위를 사용하여 아이컵에서 시신경과 과도한 결합 조직을 제거합니다. 아이컵에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하십시오.</li>
</ol>3. 기본 RPE 격리
<ol><li>1mL의 0.25% 트립신 + 0.02% EDTA가 포함된 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 아이컵을 옮깁니다. 참고: 배양 가능한 RPE의 수율을 높이기 위해 Trypsin-EDTA의 부분 표본 1개에 두 개의 아이컵을 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>마이크로 원심분리기 튜브를 37°C로 설정된 수조로 옮기고 10분 동안 배양합니다. 2분마다 수조에서 튜브를 제거하고 튜브 바닥을 조리대에 40번 단단히 두드립니다.</li>
	<li>10분 후 P1000 또는 2mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 3회 이상 피펫팅하여 아이컵을 기계적으로 부드럽게 파괴합니다. 알림: 큰 시트는 제대로 접착되지 않으므로 RPE 시트의 단편화가 필수적입니다.</li>
	<li>아이컵이 아닌 분리된 RPE 시트를 15mL 원뿔형 튜브에 담긴 0.5mL의 소 태아 혈청(FBS)에 겹쳐 트립신을 즉시 중화시킵니다.</li>
	<li>또한 3mL의 RPE 배지를 FBS 및 RPE 시트 층에 적하하여 트립신을 희석합니다.</li>
	<li>RPE를 340 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 24웰 플레이트(1.9cm2/웰) 또는 48웰 플레이트(0.75cm2/웰)에 적합한 양의 RPE 매체에 세포를 재현탁시킵니다. 참고: RPE는 세포외 기질 단백질, 특히 라미닌, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴으로 코팅된 웰 플레이트에 도금하여 부착력을 높일 수 있습니다11. 또한 RPE는 1mL의 RPE 배지에 재현탁하고 40% 밀도 분리 그래디언트에 적층하여 순수 RPE 세포를 추가로 분리할 수 있습니다. 또한, 플레이트를 340 x g 에서 3-5분 동안 회전시키면 세포 접착력이 증가할 수 있다13.</li>
	<li>37 ° C에서 5 % CO2 로 배양합니다.</li>
</ol>4. RPE 배양
<ol><li>최소 3일 동안 격리된 RPE를 중단하지 마십시오. 72시간 후 기존 매체를 조심스럽게 제거하고 미리 데워진 새 매체로 교체합니다.</li>
	<li>처음 48일 후 3시간마다 매체를 교체하십시오.</li>
	<li>세포가 밀도에 도달하면 0.25% 트립신 + 0.02% EDTA를 사용하여 세포를 통과시키고 RPE 배지의 FBS를 2%로 줄입니다. 참고: 일차 RPE는 이전에 5-7회 통과 후에 역분화를 시작하고 육각형 모양과 색소 침착을 잃기 시작하는 것으로 보고되었다14.</li>
</ol>

배양된 1차 쥐 RPE의 특성화 및 형태학적 역학

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakkaraju%2C+A+%22Prog+Retin+Eye+Res%22">Prog Retin Eye Res</a>. 100846, (2020).</li>
<li>Lambros, M. L., Plafker, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+the+Nrf2+anti-oxidant+transcription+factor+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration.</a> Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).</li>
<li>Ferrari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+genes+and+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li>
<li>Xia, T., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetic+retinopathy+on+the+barrier+functions+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium.</a> Vision Res. 139, 72-81 (2017).</li>
<li>Edwards, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+rat+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Culture of rat retinal pigment epithelium.</a> In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).</li>
<li>Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+rat+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).</li>
<li>Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+pigment+epithelial+cells+from+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina.</a> Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).</li>
<li>Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).</li>
<li>Sakagami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+rat+eyeballs%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs.</a> Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).</li>
<li>Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+culture+of+adult+rat+retinal+pigment+epithelial+%28RPE%29+cells+to+study+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 9, 449(2015).</li>
<li>Shen, J., He, J., Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigment+epithelial+%28RPE%29+cells+with+Rho-Kinase+and+TGFbetaR-1%2FALK5+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Monit%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor.</a> Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).</li>
<li>Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+cryosectioning+of+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+on+transwell+cell+culture+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101758(2022).</li>
<li>Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+Junctions+of+the+outer+blood+retina+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight Junctions of the outer blood retina barrier.</a> Int J Mol Sci. 21 (1), 211(2019).</li>
<li>Ban, B., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Mol Vis. 3, 18(1997).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+diseases+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Functions and diseases of the retinal pigment epithelium.</a> Front Pharmacol. 12, 727870(2021).</li>
</ol>

관련 재무 또는 비재무 공개가 없습니다.

이 기사에서는 쥐 망막 색소 상피의 분리 및 배양을 위한 간소화된 프로토콜을 간략하게 설명했습니다. 성체 마우스의 눈에서 분리한 RPE 세포는 RPE 특이적 마커인 RPE65와 세포간 접합 마커인 ZO-1을 발현했습니다. 또한, 배양된 세포는 배양에서 착색된 육각형 시트로 발달했습니다.
설치류에서 RPE를 분리하는 여러 가지방법이 이전에 6,7,8,9,10,11,12로 발표되었습니다. 많은 프로토콜이 브루흐 막에서 RPE 층을 벗겨내기 때문에 기술적 기술이 필요하고 RPE 손상 또는 세포 사멸의 위험이 증가합니다 6,7,9,11,12,16. 따라서 이 프로토콜은 기계적 해리가 아닌 RPE 층의 효소적 분리를 활용하여 생존을 촉진하고 배양에서 RPE 시트의 무결성을 유지합니다. 이 방법은 긴밀한 접합 단백질의 발현을 보존하는 고도로 색소 침착된 육각형 모양의 세포로 RPE 형태를 유지하는 배양에서 마우스 RPE를 생성합니다. 또한, 이 프로토콜은 투과성 멤브레인 삽입체, 추가적인 세포외 기질 코팅 단백질 또는 특수 조직 해리 시약과 같은 다른 프로토콜에서 사용되는 복잡한 시약 또는 물질의 사용이 부족합니다. 대신, 이 프로토콜은 0.25% Trypsin-EDTA를 사용하는 간단한 효소 분해와 조직 교반을 함께 사용하여 Bruch's membrane에서 RPE 층을 해리합니다. 이 프로토콜은 3주에서 14주령 사이의 마우스에서 성공적으로 수행되었습니다. 그러나 어린 마우스에서 confluent culture를 성공적으로 얻기 위해서는 더 많은 눈이 필요할 수 있습니다.
이 프로토콜을 실행하는 동안 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 오라 세라타 주위를 정밀하게 절단하고 RPE 층을 방해하지 않고 망막을 조심스럽게 제거하려면 기술이 필요합니다. 공막의 둘레를 자르는 동안 망막이 방해를 받을 수 있으며, 이로 인해 RPE 생존력이 변경될 수 있습니다. 이 기법의 연마는 반복적이고 지속적인 연습을 통해서만 달성될 수 있습니다. 또한 RPE 시트는 제거 후에도 망막층에 부착된 상태로 남아 있을 수 있습니다. RPE의 과도한 손실을 방지하려면 세척 완충 매체를 채운 주사기 또는 전사 피펫을 사용하여 아이컵에서 망막의 가장자리를 부드럽게 들어 올려 망막 박리를 자극합니다. 히알루로니다아제 배양은 또한 박리를 촉진할 수 있다16. RPE가 Bruch의 멤브레인과 맥락막에서 제대로 분리되지 않는 경우 수조에서 트립신으로 배양 시간을 늘리십시오. 또한 신선한 트립신의 부분 표본을 -20 °C에서 동결하고 사용 직전에 해동하여 최적의 효소 활성을 유지합니다. 분리 후 RPE가 웰 플레이트에 부착되지 않는 것은 셀이 너무 낮은 밀도로 파종되거나 분리 프로세스 중에 RPE가 손상된 경우 발생할 수 있습니다. 또한, 당사의 프로토콜은 배양을 위해 세포외 기질(ECM) 단백질의 코팅을 요구하지 않습니다. 그러나 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐 IV(collagen IV), 라미닌(laminin) 또는 콜라겐 I(collagen I)과 같은 ECM 단백질은 세포 부착을 증가시키는 것으로 나타났으므로 부착력이 좋지 않은 경우 고려해야 합니다11.
RPE 배양 단층의 수율을 높이려면 동일한 유전적 배경을 가진 연령 일치 마우스의 눈을 최소 2-3개 풀링합니다. 세포는 충분히 높은 밀도로 파종되지 않으면 시간이 지남에 따라 육각형 모양과 색소를 잃을 수 있습니다. 생후 8주가 지난 마우스의 경우, 24웰 플레이트당 2개의 눈은 최적의 농도를 위해 충분해야 합니다. 생쥐가 8주 미만인 경우 3-4개의 눈을 사용하면 더 나은 접착력과 합류성을 얻을 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 세포는 색소 침착이 손실되고 길쭉한 모양이 획득되는 상피-중간엽 전이(EMT)에 취약해질 수 있습니다. Y27632 및 Repsox와 같은 Rho-Kinase 및 TGFβR-1/ALK5 억제제를 각각 첨가하면 배양된 RPE 세포의 EMT를 예방할 수 있다12. 격리 프로토콜은 간단하여 2-4개의 눈을 분리하는 데 1시간만 필요하지만 1차 배양은 완전한 밀도에 도달하는 데 최대 7-10일이 걸릴 수 있습니다. 또한 RPE를 통과하는 것은 제한적이며 이후의 모든 통과에서 EMT의 위험이 증가합니다.
망막 색소 상피 세포는 눈의 항상성을 유지하는 데 중요한 세포입니다. RPE는 식세포(phagocyte)로 작용하여 광수용체(photoreceptor)의 유지를 돕고, 신경층이 빛으로 인한 손상을 방지하며, 수송을 조절하는 단단한 상피 장벽(epithelial barrier)으로 작용한다17. 연령 관련 황반변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증과 같이 RPE에 직접적인 영향을 미치는 질병은 염증을 악화시키고, 세포사멸을 증가시키며, 세포 접합을 방해하여 망막 변성 및 실명의 가능성을 높일 수 있습니다17. 원발성 RPE의 배양은 RPE에 영향을 미치는 안구 질환의 발병 기전에 대한 연구를 용이하게 합니다. 결론적으로, 당사의 프로토콜은 고순도 세포 배양을 유지하면서 분리 기간을 단축하고 필요한 기술과 시약을 단순화합니다.

망막 색소 상피(RPE)는 광수용체와 맥락막1 사이에 위치한 브루흐 막(Bruch's membrane)을 둘러싸고 있는 특수 세포 단층입니다. RPE 세포는 망막의 적절한 기능에 중요한 역할을 합니다. RPE 세포는 포도당과 비타민 A를 광수용체로 운반하고, all-trans retinal을 11-cis retinal로 재이성질화하여 시력을 촉진하고, 벗겨진 외부 분절의 phagocytosis를 통해 광수용체의 외부 분절을 유지하고, 망막하 공간에서 수분을 제거하고, 긴밀한 접합부의 존재를 통해 외부 혈액-망막 장벽을 형성하고, 신경 영양 성장 인자(예: Pigment Epithelium Derived Factor, 및 Basic Fibroblast Growth Factor)를 지원하여 광수용체를 지원한다2. RPE 세포의 기능 장애는 연령 관련 황반 변성, 색소 망막염 및 당뇨병성 망막증을 포함한 다양한 망막병증의 발병에 관여합니다 3,4,5. RPE 세포를 사용한 체외 연구는 이러한 질병의 발병 기전에 대한 이해를 높이는 데 매우 중요합니다. RPE 세포주는 쉽게 구할 수 있지만 1차 RPE 세포의 주요 특성이 부족하기 때문에 이러한 연구에서 훨씬 선호됩니다.
다양한 종이 일차 RPE 세포의 공급원으로 활용되어 왔지만, 마우스는 유전자 변형을 사용하여 망막병증의 발병 기전을 이해하는 데 도움이 되는 장점이 있습니다. 설치류로부터 RPE 세포를 분리하기 위한 이전에 설명된 프로토콜은 신생아 동물의 사용을 필요로 하거나, 시간이 오래 걸리거나, 기술적 기술을 요구하거나, 배양에 적합하지 않다 6,7,8,9,10,11,12. 당사는 RPE 세포를 고순도 배양액을 생성하는 성체 마우스에서 RPE 세포를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.009 RD 단일 가장자리 블레이드</td><td>Personna</td><td>941202</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td>, <td>4.5 g/L 포도당, L-글루타민, 소나트륨 피루브산</td></tr>, <tr><td>태아 혈청</td><td>Corning</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX, 100x</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드</td></tr><tr><td>없음 HEPES 버퍼 용액 (1M)</td> <td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산, 100x</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Unitome 나이프</td><td>BVI 비버</td><td>377546</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토 마이신 용액, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 마이크로 플레이트</td><td>Falcon</td><td>08-772-1</td><td>24-well 또는 48-well</td></tr><tr><td>Regular Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>페<td>놀 레드</td>Vannas 가위가 있는 <td>Gibco</td><td>25200056</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-12</td><td></td></tr></tbody></table>

a simplified method for isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

망막 색소 상피 세포(RPE)는 망막의 적절한 기능에 매우 중요합니다. RPE 기능 장애는 연령 관련 황반 변성, 색소 망막염 및 당뇨병성 망막병증과 같은 중요한 망막 질환의 발병 기전에 관여합니다. 쥐 성인 눈에서 RPE를 분리하기 위한 간소화된 접근 방식을 제시합니다. 이전에 보고된 방법과 달리, 이 접근법은 성체 마우스에서 고순도 RPE의 분리 및 배양을 가능하게 합니다. 이 간단하고 빠른 방법은 광범위한 기술이 필요하지 않으며 기본적인 과학 도구와 시약으로 달성할 수 있습니다. 1차 RPE는 3주에서 14주까지의 C57BL/6 배경 마우스에서 안구 적출 후 전방 분절 제거에 의해 분리됩니다. 효소 트립신화 및 원심분리는 아이컵에서 RPE를 해리하고 분리하는 데 사용됩니다. 결론적으로, 이 접근법은 망막 기능 및 질병 연구에서 RPE를 활용하기 위한 빠르고 효과적인 프로토콜을 제공합니다.

설명된 프로토콜은 C57BL/6 배경 마우스에 사용되었습니다. 성별은 RPE를 배양하는 능력을 변화시키지 않는 것으로 보인다. 6주 미만의 마우스는 나이가 많은 마우스에 비해 제한된 RPE 시트를 생성하며 최적의 밀도에 도달하기 위해 더 많은 눈이 필요할 수 있습니다. 분리 후 RPE 세포가 안정화되어 세포 배양 플레이트에 부착되는 데 약 3일이 걸립니다. 분리 후 약 24시간이 지나면 무핵세포처럼 보이는 동그랗고 색소가 있는 세포가 가라앉기 시작했지만 플레이트에 완전히 부착되지 않았습니다(그림 1A). 다음 48-72시간 동안 세포는 어두운 색소 침착과 투명한 핵을 유지하면서 부착되고 퍼지기 시작합니다(그림 1B, C). 5일 후, RPE는 밀도가 증가하고 육각형 모양의 편광 단층을 연상시키는 세포 간 접촉을 형성하기 시작했습니다(그림 1D).
분리된 RPE는 배양 6일 후 순도 및 밀착 접합 무결성에 대해 평가되었습니다. RPE는 먼저 RPE에 특이적인 마커인 레티노이드 이소메로가수분해효소 또는 망막 색소 상피 65kDA 단백질(RPE65)의 존재에 대해 평가되었습니다(그림 2, 녹색). 또한 RPE가 착색된 육각형 세포의 단일 층을 형성하려면 세포 간 접합부가 손상되지 않은 상태로 유지되어야 합니다. 밀착 접합 단백질-1 또는 조눌라 폐색-1(zonula occludens-1, ZO-1)은 개별 RPE 세포 사이의 밀착 접합부의 유지 및 무결성에 필수적인 스캐폴딩 단백질이다14. Confluent isolated RPE 배양은 세포 주변부에서 발견되는 ZO-1의 염색으로 입증된 세포 간 접합 단백질을 유지했습니다(그림 2, 빨간색). 이러한 세포가 큰 시트에서 밀도에 도달하면 최대 2주 동안 과도하게 성장하지 않고 세포 간 접촉을 유지합니다. 이전 연구에 따르면 ZO-1은 배양에서 최대 9일 동안 높게 발현되는 것으로 나타났습니다15. 일차 RPE 배양에 사용되는 추가 마커에는 콜라겐 IV, CRALBP 및 OTX211이 포함됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66921/66921fig01.jpg"> 그림 1. 표준 폴리스티렌 24웰 플레이트에서 배양된 마우스 1차 RPE의 형태. (A) C57BL/6 마우스의 양쪽 눈에서 분리하고 분리 직후 비코팅 조직 배양 폴리스티렌 24웰 플레이트의 단일 웰에서 배양한 1차 RPE. (나,씨) 48시간 및 72시간 후, 일차 RPE는 플레이트에 부착되기 시작하고 색소가 있는 이핵 세포를 형성합니다. (D) 5일 후, 명시야 현미경 검사는 과색소가 함유된 육각형 모양의 세포가 밀도를 높이고 세포 간 접촉을 형성하기 시작하는 것을 보여줍니다. 눈금 막대: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66921/66921fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66921/66921fig02.jpg"> 그림 2. RPE 특이적 마커인 RPE-65 및 세포간 접합 마커인 ZO-1은 분리된 원발성 쥐 RPE에서 보존됩니다. 3마리의 C57BL/6 마우스로부터의 1차 RPE를 4% 파라포름알데히드로 고정하기 전에 6일 동안 배양하였다. 세포를 PBS에서 0.1% Triton-X로 5분 동안 투과시키고, 5% 정상 염소 혈청으로 차단하고, RPE-65(녹색) 또는 ZO-1(빨간색)에 대한 항체로 배양했습니다. 눈금 막대: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66921/66921fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66921/66921fig03.jpg"> 그림 3. 망막 색소 상피 분리 프로토콜의 단순화된 개략 도. 마우스에서 안구를 제거한 후 세척 버퍼로 이동하기 전에 70% 에탄올에 잠시 담가 눈을 살균합니다. 세척 버퍼에서 ora serrata를 따라 자르고 앞쪽 부분을 제거합니다. 망막을 제거하고 트립신/EDTA가 있는 튜브에 아이컵을 넣습니다. 총 10분 동안 2분마다 카운터의 튜브를 부드럽게 두드리고 상층액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 RPE의 펠릿을 원심분리합니다. 셀과 플레이트를 24웰 또는 48웰 플레이트에 재현탁합니다. BioRender를 사용하여 생성된 그래픽. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66921/66921fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

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이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.

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수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

망막 안료 상피 (RPE)은 눈의 다기능 상피가 이다. 여기 선물이 murine RPE에서 파생 하는 기본 세포 배양을 설정 하는 프로토콜.

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

프로토콜은 혈청과 항생제가 없는 R16 정의 배지에서 망막 색소 상피 (RPE)와 함께 재배 된 마우스 신경망막의조직화 각질을 설명합니다. 이 방법은 생체 내 실험과 비교할 때 비교적 간단하고, 비용이 적게 들고, 시간이 많이 소요되며, 수많은 실험 응용 프로그램에 적응할 수 있다.

통가 경사진 마우스 망막의 장기, 세럼 없는 재배는 그대로 망막 색소 상피와 함께 익스처스

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

이 프로토콜은 단백질 분석을 위해 뮤린 막대 광수용체의 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 기술을 제시합니다. 첫 번째 방법은 살아있는 망막과 셀룰로오스 여과지를 사용하여 막대 외부 세그먼트를 분리하는 반면, 두 번째 방법은 동결 건조 된 망막과 접착 테이프를 사용하여 막대 내부 및 외부 세그먼트 층을 제거합니다.

단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 단리를 위한 두 가지 박리 방법

이 프로토콜은 세포 수율, 순도 및 생존성에 최적화된 뮤린 출생후 망막 내피 세포의 단리를 위한 방법을 설명한다. 이 세포는 차세대 시퀀싱 접근법에 적합합니다.

차세대 염기서열분석을 위한 뮤린 망막 내피 세포의 분리

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

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이 논문은 신생아 Sprague-Dawley(SD) 쥐에서 1차 망막 뮐러 세포를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차에는 안구 적출, 망막 조직 해부, 세포 추출 및 식별, 후속 세포 배양을 위한 주요 고려 사항이 포함됩니다.

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배우세요 성인 마우스에서 망막 색소 상피 세포를 간소화된 방법으로 분리하고 배양하는 기술입니다. 이 프로토콜은 높은 순도의 RPE 배양을 제공하여 황반변성 등 망막 질환 연구에 활용됩니다.

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A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

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