Name: Rhizosphere 토양에서 Multispecies Biofilm Communities를 구축하는 접근 방식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: 배우세요 뿌리권 토양에서 다종 생물막 공동체를 구축하는 표준화된 방법을. 오이 종자와 배양 기술을 활용하여 식물 성장 촉진을 위한 2세대 바이오비료 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 중국 국립자연과학재단(42307173 및 42107328)과 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2022YFD1500202 및 2022YFF1001800)의 재정 지원을 받았습니다. P.W, Z.X가 연구를 설계했습니다. P.W, B.X, Z.C, J.X, N.Z는 데이터를 분석하고 수치를 만들었습니다. P.W는 원고의 첫 번째 초안을 썼습니다. Z.X., R.Z. 및 Q.S.가 원고를 수정하였다.

이 프로토콜은 일반적으로 다양한 식물의 뿌리권 토양 미생물군에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 오이를 예로 듭니다. 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 세균 분리
<ol><li>Rhizosphere 토양 격리<ol><li>오이 문화<ol><li>75% 에탄올과 2% 차아염소산나트륨(NaClO) 용액으로 오이 씨앗을 소독한 다음 멸균수11로 헹굽니다.</li>
			<li>멸균 상태에서 씨앗을 발아시키고 두 잎 단계12에 도달하는 씨앗을 선택하십시오. 그 후, 일관되게 싹이 트는 오이 묘목을 2kg의 검은 흙이 들어있는 화분에 이식하십시오. 참고: 중국 북동부의 서로 다른 위치에서 채취한 두 가지 유형의 흑토를 사용하여 시스템 오류를 줄입니다.</li>
		</ol></li>
		<li>토양 현탁액 준비<ol><li>제형을 사용하여 PBS-S 완충액을 제조합니다 :NaH2PO46.33g· H2O, Na2HPO4·7H2O 16.5g, Silwet L-77 200 μL 및 증류수 1 L.</li>
			<li>묘목이 네 잎 단계12에 도달하면 화분을 뒤집어 살균 장갑을 사용하여 2mm 두께의 뿌리 흙과 함께 뿌리를 분리합니다.</li>
			<li>50mL 원심분리기 튜브에 30mL의 PBS-S 완충액에 뿌리를 넣습니다. 20분 동안 흔든 후 100μm 나일론 셀 필터를 통해 현탁액을 여과하여 뿌리와 큰 침전물을 제거합니다.</li>
			<li>여과액을 다른 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 3200 x g 에서 15분 동안 원심분리한 후 4°C에서 임시로 보관합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>rhizosphere 토양 박테리아 세포의 추출. 참고: 이 방법은 차등 원심분리 방법(13)을 채택하지만, Nycodenz 밀도 구배 원심분리 방법(14 )도 이 단계에 적용됩니다.<ol><li>토양 현탁액을 0.2 % Na4P2O7 용액으로 500 mL에 희석하고 1,000 x g 에서 10 분 동안 원심 분리하여 처음에 토양에서 유기체를 분리합니다.</li>
		<li>침전물을 다시 균질화하고 60초 동안 동일한 저속으로 원심분리한 다음 이 과정을 세 번 반복합니다. 상층액을 결합하고 12,000 x g 에서 20분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.</li>
		<li>50mL의 PBS-S 완충액에 침전물을 재현탁시켜 rhizosphere soil bacterial cell suspension을 구성합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. rhizosphere biofilm microbiota의 염기서열 분석 및 식별
<ol><li>미디어 준비 참고: 트립틱 대두 육수(TSB) 및 미니멀 솔트 글리세롤 글루타메이트(MSgg) 배지는 상업적으로 이용 가능합니다. 아래 정립은 참고용입니다.<ol><li>15 μg/mL 트립톤, 5 μg/mL 대두 펩톤, 5 μg/mL NaCl, pH = 7 제형을 사용하여 TSB 배지를 준비합니다.</li>
		<li>다음 제형을 사용하여 MSgg 배지를 제조합니다: 5 mM KH2PO4, 100 mM 3-(N-모르폴리노) 프로판 술폰산(MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM 티아민, 0.5% 글리세롤, 0.5% 글루타메이트, 50 μg/mL 트립토판, 50 μg/mL 페닐알라닌, pH = 7.</li>
		<li>TSB-MSgg 미디어를 준비하려면 TSB 미디어와 MSgg 미디어를 1:1 비율(v/v)로 혼합합니다15.</li>
	</ol></li>
	<li>펠리클 생물막 공동 배양<ol><li>세포 현탁액을 30°C의 TSB 배지에서 하룻밤 동안(보통 12시간) 배양하여 박테리아를 활성화합니다.</li>
		<li>100μm 나일론 셀 필터를 24웰 플레이트에 놓습니다. TSB 배지에서 박테리아를 배양하고 3회 반복합니다. 펠리클 생물막을 30°C에서 36시간 동안 배양합니다. 참고: 마지막 단계의 펠리클 생물막이 잘 배양되지 않은 경우 TSB-MSgg 배지가 TSB 배지를 대체하는 효과적인 대안입니다.</li>
		<li>펠리클 바이오필름이 포함된 필터를 제거합니다. 새로운 24웰 셀 플레이트에 PBS-S 완충액 2mL를 추가하고 24웰 필터를 삽입하여 생물막을 세척한 다음 자유 세포를 제거합니다. 세탁 과정을 세 번 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>펠리클 생물막 DNA 추출<ol><li>제조업체의 지침에 따라 DNA 키트를 사용하여 생물막 게놈을 추출합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>고처리량 염기서열분석(High-throughput sequencing) 참고: 생명공학 회사는 대부분의 실험실에서 염기서열분석 실험을 완료하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 나머지 용액의 미생물 조성이 필요한 경우 이 단계에서 염기서열을 분석합니다. 염기서열분석 단계는 기기에 따라 다릅니다. 제조업체의 지침을 따르십시오. 2.4.1단계는 참고용입니다.<ol><li>전장 16S rRNA 유전자 염기서열로 데이터베이스를 기반으로 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 증폭합니다. 샘플당 최소 염기서열 수에 따라 종 OTU를 생성합니다16. 종 분류 주석을 클러스터링하고 각 샘플에서 군집의 구성을 획득합니다.</li>
		<li>염기서열분석 데이터를 기반으로 상대적 풍부도 측면에서 상위 5개 균주를 선택합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>고처리량 박테리아 분리 및 배양 참고: 이 단계는 최신 미생물 및 생물정보학 방법론17에 따라 설계되었습니다. 희석 코팅 플레이트 방법은 여기에서 박테리아 분리에 사용할 수 있지만 고처리량 기술에 비해 시간이 더 많이 걸리고 표적화가 적습니다.<ol><li>배양된 생물막을 혼합합니다. 제한 희석을 사용하여 24웰 플레이트에 있는 웰의 30% 이상이 박테리아 성장을 보이지 않도록 합니다. 참고: 가장 적합한 희석을 결정하려면 광범위한 희석 속도를 사용하여 예비 실험을 수행하십시오. 최적의 희석액에는 밀리리터당 배양 가능한 박테리아가 2개 이하로 포함되어야 하며, 이는 웰의 30% 미만에서 박테리아 배양을 나타냅니다.</li>
		<li>박테리아의 16S rRNA 유전자를 증폭하는 동시에 웰 및 플레이트에 대한 라벨을 추가하고 고처리량 Illumina 플랫폼17을 사용하여 염기서열을 분석합니다.</li>
		<li>각 배양에 대한 순도 및 종 분류학 정보를 얻기 위해 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 생물정보학 분석을 수행합니다.</li>
		<li>연속 라인 배양으로 상위 5개의 풍부한 순수 박테리아를 배양하고 글리세롤을 사용하여 박테리아를 -80 °C에서 보존합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 합성 미생물 군집의 구축
<ol><li>재건된 생물막 배양 참고: 자세한 내용은 Ren et al.18을 참조하십시오. 5 종은 5 개의 단일 종, 10 개의 2 종, 10 개의 3 종, 5 개의 4 종 및 1 개의 5 종 컨소시엄을 포함하여 31 개의 합성 조합에 해당합니다.<ol><li>OD600 이 1에 도달할 때까지 TSB 배지에서 5개의 균주를 배양하여 활성화합니다.</li>
		<li>TSB 배지가 있는 여러 개의 24웰 플레이트를 준비하고 그 위에 100μm 나일론 셀 필터를 놓습니다. 참고: 마지막 단계의 생물막이 잘 배양되지 않은 경우 TSB-MSgg 배지가 TSB 배지를 대체하는 효과적인 방법입니다.</li>
		<li>배지에서 합성 군집의 31 가지 조합을 배양합니다. 각 웰에서 박테리아의 접종 횟수가 일정한지 확인하십시오. 각 조합에 대해 3회 반복을 설정합니다.</li>
		<li>30°C에서 36시간 동안 생물막을 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>펠리클 생물막의 정량화<ol><li>2.2.3단계와 동일한 절차를 따릅니다.</li>
		<li>생물막을 180μL의 결정 보라색 용액이 포함된 새로운 24웰 플레이트로 옮기고 20분 동안 염색합니다.</li>
		<li>염색된 샘플을 200μL의 96% 에탄올이 들어 있는 다른 24웰 플레이트로 옮기고 30분 동안 용리한 다음 OD590을 측정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 펠리클 세포 수 정량화
참고: 펠리클 및 나머지 용액에서 각 종의 비율과 세포 수를 확인하려면 정량적 PCR이 필요합니다. 자세한 내용은 Sun et al.16을 참조하십시오.
<ol><li>선택한 합성 미생물 군집을 위한 균주 특이적 프라이머를 설계합니다.</li>
	<li>Roary를 사용하여 게놈 비교를 수행하고 각 분리체의 균주 특이적 단일 복제 유전자를 찾으십시오. 프라이머가 이러한 유전자를 대상으로 하는지 확인하십시오.</li>
	<li>증폭된 단편을 PMD19T 플라스미드에 리가스합니다. 해당 fragment를 포함하는 plasmid를 template로 사용하여 표준 곡선을 생성합니다.</li>
	<li>2.2단계에서 언급한 것과 동일한 단계를 수행합니다.</li>
	<li>7.2 μL의 H2O, 10 μL의 2x qPCR 마스터 믹스, 0.4 μL의 각 프라이머 10 μM, 2 μL 템플릿 DNA와 같이 반응 성분을 준비합니다.</li>
	<li>95°C에서 10분, 95°C에서 30초, 60°C에서 45초 동안 40주기 동안 Real-time PCR 기기로 PCR을 수행한 후 표준 용융 곡선 세그먼트를 수행합니다.</li>
	<li>각 치료에 대해 6개의 생물학적 복제를 수행합니다.</li>
</ol>

Rhizosphere 토양에서 Synergistic Multispecies Biofilms 개발

<ol><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+from+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).</li>
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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

프로토콜에 따라, 다양한 식물의 뿌리권 토양에 있는 미생물군을 기반으로 일련의 강력한 합성 다종 생물막 군집이 구성됩니다. 정량적 PCR 기술을 사용하여 각 커뮤니티의 구성을 명확하게 해독합니다. 생물막의 바이오매스는 잠재적인 대사 상호 작용의 강도를 나타내지만, 협력 이면의 다양한 특성과 메커니즘은 여기에서 밝힐 수 없습니다19. 자연 미생물 군집의 규모와 복잡성을 감안할 때, 합성군집(synthetic communities, SynComs)은 기존의 장애물을 극복하기 위한 모델 시스템이다14. 이 프로토콜은 복잡한 rhizosphere 토양 미생물군으로부터 합성 생물막 군집을 구성하는 체계적이고 근본적인 방법론을 강조합니다.
SQR9, XL-1 및 XL-2는 실제 뿌리권에서 안정적인 식민지화에 대한 강력한 잠재력을 보여준다는 것이 마지막 부분에서 분명합니다. 연구자들은 이러한 균주를 기반으로 대사 관계와 공동 집락화 메커니즘을 조사하기 시작할 수 있습니다. 이후에도 오이에 대한 미생물 접종제에 대한 후속 연구도 가능합니다.
언급된 장점에도 불구하고 프로토콜의 단점을 간과하지 않는 것이 중요합니다. 실험실 배양과 현장 조건 간의 차이로 인해, 각 합성 군집의 결과는 실제 뿌리권 토양20에서 미생물군을 정확하게 나타내지 않을 수 있다. 추가 rhizosphere 접종을 통한 확인이 필요합니다. 또한 이러한 결과의 재현성은 상대적으로 낮습니다. 실험실의 펠리클 생물막 종은 토양의 야생 유형에 비해 여러 세대에 걸쳐 돌연변이를 겪었을 수 있으며, 이로 인해 통제할 수 없는 부정확성이 발생할 수 있습니다.
프로토콜의 특정 단계에 대한 몇 가지 대안이 있습니다. 예를 들어, 단계 1.2에서, Nycodenz 밀도 구배 원심분리법은 토양 세포 시료를 수집하는 데 상대적으로 더 효율적이다(13). 또한 2.4단계에서 최신 고처리량 배양 및 박테리아 식별은 더 높은 비용에도 불구하고 실험 효율성을 크게 향상시킵니다. 따라서 전통적인 희석 코팅 플레이트 방법은 몇 가지 종을 선택하는 데 여전히 적합합니다. 마지막으로, 3.2 단계에서 배양된 생물막의 바이오매스는 크리스탈 바이올렛 염색과 분석 저울에서 직접 칭량하여 평가할 수 있습니다.
이 프로토콜은 단순히 미생물 및 환경 연구를 위한 기본 실험 재료를 만드는 것 이상으로 확장됩니다. 가장 강력한 합성 박테리아 다종 생물막 군집을 식별하는 것은 개방적이고 복잡한 뿌리권 생태계를 밝히는 첫 번째 단계일 뿐입니다. SynCom의 핵심 종에 집중함으로써 연구자들은 보다 표적화되고 신속한 방식으로 실제 현장 상황에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 접근법은 또한 rhizosphere 토양 응집체와 같은 더 큰 규모로 biofilms를 탐색하고 식물 성장과 건강을 위한 rhizosphere 미생물 군집의 정확한 관리를 위한 새로운 관점을 제공할 수 있습니다21.
가장 중요한 것은 이 방법론이 뿌리권 토양 미생물군의 집합과 역학을 지배하는 종간 상호 작용에 대한 추가 연구에 빛을 비출 것이라는 것입니다. 예를 들어, 복잡한 rhizosphere community를 다룰 때, 동시 발생 네트워크 분석 또는 게놈 규모 대사 모델링(genome-scale metabolic modeling)15 과 같은 다른 분석 방법은 종종 이러한 기본 단계와 결합되어 대표적인 생물막 커뮤니티를 인위적으로 구축합니다. 여기에는 종간 관계에 대한 고려 사항이 포함됩니다.

생물막은 표면에 부착되거나 계면으로 연결된 복잡한 미생물 군집을 나타냅니다. 자연 서식지, 임상 환경 및 산업 맥락과 같은 다양한 환경에서 발견되는 대부분의 박테리아가 생물막 군집 내에서 지속된다는 광범위한 인정이 있습니다1. 토양에서 뿌리 표면과 인접한 2mm 두께의 영역을 포함하는 뿌리권은 영양 가용성이 높은 생태학적 틈새를 형성합니다. 특정 박테리아는 이 틈새를 활용하기 위한 전략을 진화시켜 미생물 증식을 촉진하고 뿌리권에서 생물막 군집의 형성을 촉진했다2.
Rhizosphere 미생물은 식물의 '두 번째 게놈'으로 간주됩니다3. 식물 성장 촉진 미생물(PGPM)은 식물과 상호 공생하여 중요한 성장 촉진 및 생물 제어 기능을 제공합니다4. 한편으로, PGPM은 식물 뿌리에 영양분을 공급하고, 영양분 흡수를 촉진하고, 병원균에 대한 방어를 하고, 뿌리권 토양의 오염 물질을 분해할 수 있다5. 반면에 PGPM은 식물 뿌리 삼출물을 성장과 진화를 위한 영양 공급원으로 활용하여 자신의 신진대사를 통해 근권 토양과 뿌리 시스템에 영향을 미칩니다. 이러한 모든 기능의 전제 조건은 식물 뿌리권에서 PGPM의 효과적인 집락화로 안정적인 생물막을 형성하는 것이라는 점은 주목할 가치가 있습니다6.
Rhizosphere biofilm은 rhizosphere microbes의 조립 과정에 영향을 미치며, rhizosphere microbe assembly의 시간적 및 공간적 특성은 다종 생물막7의 상호 작용과 밀접한 관련이 있습니다. 이는 식물-미생물 상호 작용의 허브 역할을 하여 식물-미생물 상호 작용이 효과적으로 상호 작용할 수 있는 안정적이고 제어 가능한 틈새를 제공합니다. 따라서 rhizosphere biofilm을 연구하는 것은 식물과 미생물 간의 상호 작용에 대한 통찰력을 얻는 중요한 방향이기도합니다.
그러나 현재 rhizosphere multispecies biofilms에 대한 연구는 거의 없습니다. 마이크로바이옴 구성의 높은 복잡성으로 인해 자연 미생물 군집을 둘러싼 근본적인 생태학적 질문에 답하기가 어렵습니다8. 실험 과정에서 토양 유형, 식물 유형 및 많은 수의 미생물 군집과 같은 많은 조건을 고려해야 합니다. 다양한 요인이 rhizosphere multispecies biofilms의 연구를 제한합니다.
종간 시너지 상호작용 또는 대사산물교차 섭식8과 같은 뿌리권 토양으로부터의 다종 생물막 군집을 추가로 조사하기 위해서는, 실험실 조건 하에서 단순화되고, 대표적이며, 안정적이고, 다루기 쉬운 합성 미생물 군집을 인위적으로 구축하는 것이 바람직하다(9,10). 여기에서 표준화된 프로토콜은 여러 최신 미생물학 및 생물정보학 기술을 결합합니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 % Na4P2O7 용액</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd.</td><td>20041418</td><td>토양 현탁액을 희석하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>100 &amp;뮤; m 나일론 셀 필터</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>F613463-0001</td><td>배양액을 여과하고 펠리클 생물막을 분리하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>2% NaClO 용액</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd.</td><td>L03336903</td><td>씨앗을 살균하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>PSRP010</td><td>micobial 재배 및 펠리클 생물막 분리에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>3-(N-모르폴리노) 프로판 설폰산(MOPS)</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2360010</td><td>MSgg 배지를 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>50mL 원심분리기 튜브</td><td>Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.</td><td>62.547.254</td><td>당사 프로토콜에 적합한 크기의 원심분리기 튜브.</td></tr><tr><td>75 % C 2 &lt; / sub&gt;H &lt; &gt; 5 &lt; / sub&gt;OH 용액</td><td>Sinopharm 화학 시약 (주)</td><td>801769680</td><td>씨앗을 살균하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii XL-1</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>근권 토양에서 분리된 균주.</td></tr><tr><td>Bacillus velezensis SQR9</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>근권 토양에서 분리된 균주.</td></tr><tr><td>박테리아 DNA 키트</td><td>Nanjing Dinsi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>D3350020000K04U021</td><td>세균성 DNA를 추출하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>검은 흙 I</td><td>난징 농업 대학</td><td>N/A</td><td>길림성의 흑토.</td></tr><tr><td>흑토 II</td><td>난징 농업 대학</td><td>N/A</td><td>흑토 헤이룽장성.</td></tr><tr><td>Burkholderia cenocepacia XL-2</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td> 근<td>권 토양에서 분리된 균주.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10035048</td><td>MSgg 미디어를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>G508009-0001</td><td>고속 원심분리기.</td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR 마스터 믹스</td><td>Vazyme Biotech Co., Ltd.</td><td>Q311-02</td><td>qPCR에서 DNA 증폭에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>클린 벤치</td><td>쑤저우 안타이 Airtech Co., Ltd.</td><td>NB026143</td><td>무균 작동에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>항온 인큐베이터</td><td>ShangHai CIMO Medical Instrument Co., Ltd</td><td>GNP-9080BS-<img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/66926/66926eq01.jpg" style="margin: auto; "></td><td>미생물 배양에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Cristal 바이올렛 염료</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600331</td><td>펠리클 생물막 염색 및 정량화에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>오이 씨앗</td><td>난징 농업 대학</td><td>N / A</td> <td>"Jinchun I"오이 씨앗.</td></tr><tr><td>Culturome v 1.0</td><td>The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences</td><td>N/A</td><td>고처리량 뿌리권 토양 박테리아 배양 및 식별에 사용됨</td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011918</td><td>MSgg 배지를 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>냉장고</td><td>Hefei Midea 냉장고 Co., Ltd.</td><td>BCD-556WKPM(Q)</td><td>변형 보존에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>글루타메이트</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2180020</td><td>MSgg 배지를 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sinopharm 화학 시약 유한 공사</td><td>10010618</td><td>MSgg 매체를 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>수경 재배 바구니</td><td>Yulv 가구점</td><td>6526262626</td><td>오이 수경법에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10017618</td><td>MSgg 미디어를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>7791186</td><td>MSgg 미디어를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Xilong 과학적인 Co., 주식 회사.</td><td>10400101</td><td>MSgg 미디어를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Msgg 매체</td><td>Shanghai Bioesn Biotechnology Co., Ltd.</td><td>BES20791KB</td><td>Pellicle 생물막 배양 배지.</td></tr><tr><td>Na2HPO4· 7H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td> (영문)<td>S9390-100G</td><td>TSB 매체를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>공급자:NaCI</td><td>Chinasun Specialty Products co., Ltd.</td><td>HS0416</td><td>TSB 매체를 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>NaH2PO4· H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td> (영문)<td>S9638-25G</td><td>TSB 매체를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>PBS-S 완충기</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>E607008-0001</td><td>생체 조직을 위한 기본 완충액.</td></tr><tr><td>페닐알라닌</td><td>RYON</td><td>RT3486L005</td><td>MSgg 매체를 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>피펫</td><td>베이징 Labgic 기술 Co., Ltd.</td><td>BS-1000-T</td><td>균주 접종에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>PMD19T 플라스미드</td><td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd.</td><td>D102A</td><td>qPCR 표준 곡선을 생성하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>냄비</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd.</td><td>YHHWS2401</td><td>오이 토양 재배에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>qPCR</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td> 입문서<td>N/A:</td><td>qPCR에서 DNA 증폭에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Real-Time PCR 기기</td><td>Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.</td><td>4484073</td><td>선택된 펠리클 생물막에서 qPCR을 수행하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Roary</td><td>The Wellcome Trust SangerInstitute</td><td>N/A</td> qPCR Shaker Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd ZQTY-50S<td>의 프라이머를 설계하는 데 사용되며</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>용액 혼합 및 미생물 배양에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Cytiva Bio-technology(항저우) Co., Ltd.</td><td>SL77080596</td><td>TSB 매체를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>콩 펩톤</td><td>칭다오 하이테크 산업 단지 희망 생명 공학 Co., Ltd</td><td>HB8275</td><td>TSB 매체를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Shanghai Yidian Analysis Instruments Co., Ltd.</td><td>76713100010</td><td>펠리클 생물막 크리스탈 바이올렛 정량화에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>멸균 물</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd.</td><td>SW150302</td><td>펠리클 생물막을 세척하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>살균 니트릴 장갑</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>223016852LLZA</td><td>기본 실험 작업에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>템플렛 DNA</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>N/A:</td><td>qPCR에서 DNA 증폭에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>티아민</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2180020</td><td>MSgg 배지를 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>TSB 배지를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>트립토판</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2190020</td><td>MSgg 배지를 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>TSB 매체</td><td>Guangdong Huankai Microbial Sci. &amp; Tech. Co., Ltd.</td><td>024048</td><td>광범위한 박테리아 매체.</td></tr><tr><td>TSB-Msgg Meidium</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>적용 가능성이 더 넓은 펠리클 생물막 배양을 위한 혼합 배지.</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>C0310520123</td><td>MSgg 매체를 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

rhizosphere 토양에서 multispecies biofilm communities를 구축하는 접근 방식

An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil

다종 생물막은 뿌리권 토양을 포함하여 자연에서 자연적으로 발생하는 박테리아의 지배적 인 생활 방식이지만 현재의 이해는 제한적입니다. 여기에서 우리는 시너지 효과가 있는 다종 생물막 커뮤니티를 신속하게 구축할 수 있는 접근 방식을 제공합니다. 첫 번째 단계는 차등 원심분리 방법을 사용하여 근권 토양에서 세포를 추출하는 것입니다. 그 후, 이러한 토양 세포를 배양 배지에 접종하여 펠리클 생물막을 형성합니다. 36시간의 배양 후 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱 방법을 사용하여 생물막의 박테리아 조성과 그 아래의 용액을 결정합니다. 한편, 펠리클 생물막에 대한 고처리량 세균 분리는 제한 희석 방법을 사용하여 수행됩니다. 그런 다음, 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱 데이터(펠리클 생물막 샘플)에서 가장 풍부도가 높은 상위 5개의 박테리아 분류군을 선택하여 다종 생물막 군집을 구축하는 데 추가로 사용합니다. 5가지 박테리아 분류군의 모든 조합은 24웰 플레이트를 사용하여 신속하게 확립되었으며, 결정 보라색 염색 분석에 의해 가장 강력한 생물막 형성 능력을 위해 선택되었으며 qPCR로 정량화되었습니다. 마지막으로, 가장 강력한 합성 박테리아 다종 생물막 군집은 위의 방법을 통해 얻어졌습니다. 이 방법론은 rhizosphere multispecies biofilm에 대한 연구를 수행하고 이러한 종 간의 상호 작용을 지배하는 원칙을 연구하기 위한 대표 군집을 식별하기 위한 유익한 지침을 제공합니다.

언급된 절차에 따라, 오이 뿌리권 토양 미생물군으로부터 생물막 형성 능력의 상당한 구배가 관찰됩니다(그림 1). 생물막 앰플리콘 시퀀싱을 통해 펠리클의 종을 확인했습니다(그림 2). 염기서열 분석 데이터의 히트 매핑을 기반으로 펠리클의 풍부도가 나머지 용액의 농도보다 큰 상위 5개의 박테리아 종을 선택했습니다(그림 3). 여기에서는 일반적인 합성 커뮤니티 그룹을 예로 들었습니다. Crystal violet 염색 및 정량적 PCR은 펠리클 바이오매스의 차이와 군집 내 각 종의 상대적 풍부도를 직접 시각화합니다. 증가된 공동 배양 바이오매스는 rhizosphere 토양에서 시너지 효과가 있는 다종 생물막 군집을 구축하는 데 성공했음을 나타냅니다(그림 4 및 그림 5).
그 결과, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SQR9, 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) XL-1 및 버크홀데리아 세노세파시아 XL-2(Burkholderia cenocepacia XL-2)가 세 종 모두로 구성된 가장 강력한 군집과 함께 탁월한 시너지 컨소시엄을 형성할 수 있음을 보여줍니다. 그들은 생물막 형성에서 강력한 시너지 효과를 나타낼 것으로 예측됩니다. XL-1이 '헌정자' 역할을 한다는 점도 주목할 만하다. 이는 XL-2 및 SQR9의 생물막 형성을 촉진합니다., 컨소시엄에서 성장이 미미하고 풍부함이 미미함에도 불구하고(그림 5). 많은 다종 공동 배양 생물막이 시너지 효과를 나타내는 표현형을 나타내지만, Chryseobacterium sp.와 같은 일부 종은 합성 생물막의 생물량을 감소시킴으로써 항상 다른 균주와 부정적인 관련이 있습니다(그림 2). 이 현상은 이 프로토콜의 대상과 관련이 없지만 향후 추가 조사가 필요할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig01.jpg"> 그림 1: 다양한 합성 군집(SynCom)의 생물막 형성. 여기서 샘플은 표준 24웰 플레이트에 있습니다. 사진은 확대 없이 캡처됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig02.jpg"> 그림 2: 펠리클과 용액의 박테리아 조성. 그래프는 프로토콜 step 2.3에서 언급한 16S rRNA 유전자 앰플리콘 염기서열분석 데이터를 기반으로 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig03.jpg"> 그림 3: 펠리클 및 용액의 생물막 형성 용량의 히트맵. 빨간색은 용액보다 높은 생물막의 풍부도를 나타내고 파란색은 그 반대를 나타냅니다. 속은 차이가 보이지 않습니다. 상위 5개 풍부도의 종은 왼쪽에 표시되어 있습니다. BB: 까만 biofilm; BS: 블랙 솔루션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig04v2.jpg"> 그림 4: 그림 1의 합성 군집의 생물막 바이오매스 정량화. 데이터는 OD = 590 nm의 결정 보라색 정량화에서 얻은 것입니다. 제시된 데이터는 평균 ± SD, n = 5입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig05.jpg"> 그림 5: 그림 1의 합성 군집의 세포 수 및 종 상대적 풍부도. 데이터는 정량적 PCR에서 가져온 것입니다. 제시된 데이터는 평균 ± SD, n = 6입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

다양한 rhizosphere 토양에서 시너지 효과가 있는 다종 생물막 군집을 구축하기 위한 빠르고 표준화된 절차가 여기에 제시되어 있습니다. 이는 복잡한 rhizosphere 토양 미생물군을 조사하고 시뮬레이션하도록 설계된 고유한 프로토콜입니다.

Rhizosphere 토양에서 Multispecies Biofilm Communities를 구축하는 접근 방식

The multispecies biofilm is a naturally occurring and dominant lifestyle of bacteria in nature, including in rhizosphere soil, although the current ...

an-approach-to-constructing-multispecies-biofilm-communities-from

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: 미켈 게녹, C. 외. 공초점 및 전자현미경을 이용한 섬유성 곰팡이 군락의 박테리아 바이오필름 정성적 다척도 분석에 관한 새로운 방법. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 콜로판 형성과 방사형 성장을 지원하기 위해 처리된 셀로판 막 위에 곰팡이 배양물을 준비하는 과정을 보여줍니다. 그 후 상호작용 분석에 대한 토양 박테리아 세포의 배양 및 준비 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 박테리아 세포가 곰팡이 집락에 어떻게 부착하여 바이오필름을 형성하는지를 보여주어 박테리아-곰팡이 간 상호작용 연구를 가능하게 합니다.

바이오필름 형성을 위한 곰팡이-박테리아 공동 배양 확립

이 방법 용지의 목적은 일반적으로 인간 치은 연상 치석에서 식별 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을위한 마이크로 유체 시스템의 사용을 설명하는 것이다. 방법은 생물막 구조, 생물막 생존 및 강조 표시됩니다 문화에 의존 또는 문화 독립적 인 분석을위한 수확 바이오 필름에 대한 접근을 설명한다.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

생물막은 주변 환경과 복잡한 상호 작용을 합니다. 생물막-환경 상호 작용을 종합적으로 조사하기 위해 여기서는 생물막 개발을 위한 이질적인 화학적 환경을 조성하고, 국소 유속을 정량화하고, 생물막 군집 내부 및 주변의 질량 수송을 분석하는 일련의 방법을 제시합니다.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

진화 시나리오되지만 (공간적 분리)의 역할은 공간 분포의 조정을 허용하는 제어 실험실에서 미생물 단순한 시스템을 사용하여 조사 할 수있다. 설립자 셀 밀도를 수정하여, 다양한 구색 수준은 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 식민지 바이오 필름에 형광 표지 된 박테리아 균주를 사용하여 시각화 할 수 있습니다.

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이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

이 문서는 생태계 식물 및 높게 통제 된 실험실 조건에서 식물-미생물 상호작용 연구를 활성화 하는 장치 (EcoFABs)의 제조에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

식물-미생물 상호작용 연구 위한 실험실 생태계의 건설에 대 한 생태계 제조 (EcoFAB) 프로토콜

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

필드에서 식물 뿌리의 발굴 뿐만 아니라 endosphere, rhizosphere, 및 토양 샘플의 처리는 DNA 추출 및 데이터 분석 방법 등 자세하게에서 설명 되어 있습니다. 이 문서는 토양, endosphere, rhizosphere microbiomes의 연구에 대 한 이러한 기법을 사용 하 여 다른 실험실을 사용 하도록 설계 되었습니다.

절연 및 토양, Rhizosphere, 및 다년생 잔디 실험에 뿌리에서 미생물 커뮤니티의 분석

이 프로토콜은 박테리아 종간 상호 작용의 영향을 탐구하는 데 사용할 수 있는 낭포성 섬유증(CF) 폐 관련 4종 다미생물 생물막 모델을 설명합니다.

커뮤니티 표현형을 조사하기 위한 낭포성 섬유증 관련 다미생물 생물막 성장

우리는 미생물군 및 생물막과 함께 식물 및 곰팡이 바이오매스를 포함하는 매우 이질적이고 섬세한 샘플을 시각화하기 위한 최적화된 주사 전자 현미경 프로토콜을 제안합니다. 이 프로토콜을 사용하면 미생물군 조직의 공간적 차원을 설명할 수 있습니다.

Attine Ants' Gardens의 미생물군: 주사 전자 현미경을 통한 미생물 풍경 시각화

이 프로토콜은 혐기성 조건에서 복잡한 배설물 군집의 연속 유동 배양에 활용되는 미니 생물반응기 어레이의 조립에 대해 자세히 설명합니다. 또한 추가 분석을 위해 반응기의 조립, 접종 및 샘플링 방법에 대해서도 논의합니다.

복잡한 분변 군집의 지속적인 배양을 위한 Bioreactor Assembly

배우세요 뿌리권 토양에서 다종 생물막 공동체를 구축하는 표준화된 방법을. 오이 종자와 배양 기술을 활용하여 식물 성장 촉진을 위한 2세대 바이오비료 개발에 활용할 수 있습니다.

Rhizosphere 토양에서 Multispecies Biofilm Communities를 구축하는 접근 방식

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