Preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells (마우스 흉선 상피 세포의 단세포 현탁액 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색)

T세포는 감염병과 암으로부터 우리 몸을 보호하는 면역세포입니다. 흉선은 T세포를 생산하고 신체의 자체 구성 요소에 따라 발달 중인 T세포를 선택하는 기관입니다. 우리는 흉선이 어떻게 우리 몸을 보호하면서도 몸에 관대함을 느끼는 T 세포를 생산하고 선택하는지에 관심이 있습니다.

우리 연구실은 흉선에서 T 세포의 생산 및 선택에 중요한 역할을 하는 흉선 상피 세포의 분석에 기여했습니다. 흉선 상피 세포의 단일 세포 수준 분석은 T 세포 발달 및 선택의 분자 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이 되었습니다. 흉선 상피 세포는 복잡한 구조를 가진 매우 다양하여 분리가 어렵습니다.

단일 세포 현탁액을 분리하기 위한 현재 기술은 제한적이며 개선이 필요합니다. 그럼에도 불구하고 흉선 상피 세포의 단일 세포 분리는 흉선 상피 세포의 발달 및 기능과 관련된 분자 기계에 대한 이해를 향상시킵니다. 이번 연구가 면역세포의 생성과 재생에 대한 이해에 기여할 수 있기를 바랍니다.

우리는 그것이 인류 건강 증진을 위한 중요한 초석 역할을 할 것이라고 믿습니다. 쥐에서 흉선을 채취한 후 얼음 위의 60mm 플라스틱 접시에 10밀리몰 HEPES가 포함된 RPMI 1640 5ml에 넣습니다. 해부 현미경 아래에서 구부러진 파인 팁 핀셋을 사용하여 혈액, 흉선이 아닌 조직 및 지방 조직을 제거합니다.

해부 가위로 흉선을 작은 조각으로 자릅니다. 흉선 조각을 1밀리리터당 1밀리그램의 콜라겐분해효소 및 디스파제와 2%FBS를 함유한 RPMI 1640의 밀리리터 DNase당 1단위가 들어 있는 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 20분 동안 배양합니다.

그런 다음 3ml 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 현탁액을 혼합하고 약 30분 동안 또는 조직 조각이 보이지 않을 때까지 계속 배양합니다. 1%FBS를 함유한 HBSS에 5밀리리터의 5밀리몰 EDTA를 첨가합니다. 60미크론 나일론 메쉬를 통해 셀 현탁액을 새로운 50ml 튜브로 여과합니다.

현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 350G로 원심분리하고 펠릿을 10ml의 FACS 버퍼에 재현탁합니다. 세포를 얼음 위에 저장하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정합니다. 신생아 마우스에서 흉선을 채취한 후 구부러진 가는 끝 핀셋을 사용하여 혈액, 흉선이 아닌 조직 및 지방 조직을 제거합니다.

흉선을 10밀리몰 HEPES가 포함된 0.2mL의 RPMI 1640이 들어 있는 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 배지를 버린 다음 0.5 밀리리터의 콜라겐 분해 효소 및 디스 파아제와 0.5 밀리리터의 Dnase 밀리리터 당 1 단위를 2 % FBS를 포함하는 RPMI 1640에 첨가합니다. 섭씨 37도의 열 블록에서 튜브를 배양합니다.

배양하는 동안 1ml 피펫을 사용하여 부드럽게 섞습니다. 10분 후 1% FBS가 포함된 HBSS에 0.5밀리리터의 5밀리몰 EDTA를 첨가합니다. 60미크론 나일론 메쉬를 통해 셀 현탁액을 새로운 15ml 원추형 튜브로 필터링합니다.

10 밀리몰 HEPES를 함유 한 RPMI 1640 9 밀리리터를 튜브에 첨가합니다. 세포 현탁액을 350G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 1-3밀리리터의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 세포를 얼음 위에 저장하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정합니다.

먼저 5ml 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 6개의 신생아 또는 출생 후 마우스 흉선 세포의 힘에 16 곱하기 10을 더합니다. 세포 현탁액을 350G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. FACS 완충액에서 항-FC 수용체 단클론 항체의 작업 농도 10마이크로리터에 세포 펠렛을 재현탁합니다.

튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 배양합니다. FACS 완충액에 항-CD45 단클론 항체, 항-EpCAM 단클론 항체, 항-Ly-51 단클론 항체 및 UEA-1을 각각 40마이크로리터씩 추가합니다. 튜브의 내용물을 섞어 섭씨 4도에서 45분 동안 배양합니다.

배양 후 2ml의 FACS 완충액을 추가합니다. 세포 현탁액을 350G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 1마이크로리터의 Ghost Dye violet 510 용액에 재현탁합니다. 튜브의 내용물을 섞어 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다.

이제 2ml의 FACS 완충액을 추가하고 세포 현탁액을 원심분리한 후 실온에서 10분 동안 1ml의 2% 파라폼 알데히드로 세포를 고정합니다. 튜브에 PBS 3.5ml를 추가합니다. 세포 현탁액을 700G에서 섭씨 4도에서 8분 동안 원심분리하고 1ml의 세포 내 고정 및 투과화 완충액으로 세포를 투과화합니다.

튜브의 내용물을 섞어 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후 세포 현탁액을 원심분리하고 1ml의 투과 완충액을 추가합니다. 다시 말하지만, 항 베타5t 항체 또는 항 CCL21 항체의 작동 농도를 각각 100 마이크로 리터씩 추가하기 전에 현탁액을 원심 분리하십시오.

실온에서 60분 동안 배양합니다. 투과화 완충액 1ml를 추가하고 700G에서 섭씨 4도에서 8분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 이제 100마이크로리터의 작업 농도의 항토끼 IgG를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

투과화 완충액을 추가한 후 세포 현탁액을 원심분리합니다. 세포 펠릿을 200마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁하고 잘 혼합합니다. 유세포 분석 전에 60미크론 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.

제로 데이 마우스와 2주 된 마우스에서 소화된 흉선 세포를 소화한 Collagenase 및 Dispase의 유세포 분석 프로파일은 미립자 신호의 90% 이상이 생존 가능한 세포를 나타내는 것으로 나타났습니다. 생존 가능한 세포의 형광 신호는 CD45 및 EpCAM으로 표현되었습니다. 신생아 단계에서는 cTEC가 mTEC보다 더 빈번했지만, 출생 후에는 cTEC 방출 효율이 낮기 때문에 mTEC가 우세했습니다.

세포의 고정 및 투과화는 TEC 내에서 세포 내 분자를 검출할 수 있도록 합니다. beta5t 발현은 대부분의 cTEC에서 검출되었지만 mTEC에서는 검출되지 않았습니다. CCL21은 mTEC의 일부에서 검출되었지만 cTEC에서는 검출되지 않았습니다.

이에 비해 공기는 mTEC의 하위 모집단에서 발현되었습니다.