Name: Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 2D 스크래치 상처 이동 분석과 3D 스피로이드 발아 분석을 활용한 혈관신생 연구 방법을. 이 기법들은 분자 수준에서 혈관형성 메커니즘을 조사하고 적절한 분석법을 선택하는 데 필수적인 지침을 제공합니다.

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저자는 소피 크뤼거(Sophie Krüger)와 가브리엘레 프린츠(Gabriele Prinz)의 탁월한 기술 지원에 감사를 표한다. 스페로이드 새싹을 정량화하기 위한 ImageJ 플러그인을 개발한 Sebastian Maier와 IncuCyte 시스템을 사용해 준 Lighthouse Core Facility, Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ), Department of Medicine I, University Hospital Freiburg에 감사드립니다. 그래픽은 biorender.com 로 만들어졌습니다. 이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135/3-1 + Bu3135/3-2 to F.B.], Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [Berta-Ottenstein-Program for Clinician Scientists and Advanced Clinician Scientists to F.B.], Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 to F.B.], German Cancer Consortium [CORTEX fellowship for Clinician Scientists to J.R.], Volker Homann Stiftung [to J.N.+F.B.], Freunde der Universitäts-Augenklinik Freiburg 등의 지원을 받았다 e.V." [P.L.에게]

Scratch Wound Migration 및 Spheroid Srouting Assay를 이용한 혈관신생 연구

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<li>Gariano, R. F., Gardner, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+angiogenesis+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal angiogenesis in development and disease.</a> Nature. 438 (7070), 960-966 (2005).</li>
<li>Mancuso, M. R., Kuhnert, F., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+angiogenesis+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat+Res+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental angiogenesis of the central nervous system.</a> Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 173-180 (2008).</li>
<li>Tonnesen, M. G., Feng, X., Clark, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Dermatol+Symp+Proc%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in wound healing.</a> J Investig Dermatol Symp Proc. 5 (1), 40-46 (2000).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+angiogenesis+in+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis.</a> Semin Oncol. 29, 6 Suppl 16 15-18 (2002).</li>
<li>Crawford, T. N., Alfaro, D. V., Kerrison, J. B., Jablon, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Diabetes+Rev%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy and angiogenesis.</a> Curr Diabetes Rev. 5 (1), 8-13 (2009).</li>
<li>Ng, E. W., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+angiogenesis%2C+the+underlying+disorder+in+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration.</a> Can J Ophthalmol. 40 (3), 352-368 (2005).</li>
<li>Blanco, R., Gerhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegf+and+notch+in+tip+and+stalk+cell+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Vegf and notch in tip and stalk cell selection.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (1), 006569(2013).</li>
<li>Hellström, M., Kalén, M., Lindahl, P., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+PDGF-B+and+PDGFR-%CE%B2+in+recruitment+of+vascular+smooth+muscle+cells+and+pericytes+during+embryonic+blood+vessel+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role of PDGF-B and PDGFR-β in recruitment of vascular smooth muscle cells and pericytes during embryonic blood vessel formation in the mouse.</a> Development. 126 (14), 3047-3055 (1999).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li>
<li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+forces+in+fibrillar+extracellular+matrices+control+directional+capillary+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting.</a> J Cell Sci. 112, Pt 19 3249-3258 (1999).</li>
<li>Rapp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+in+vitro+angiogenesis+assays+highlight+different+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">2D and 3D in vitro angiogenesis assays highlight different aspects of angiogenesis.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1870 (3), 167028(2024).</li>
<li>Rapp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+signaling+induced+by+the+IL-6+family+of+cytokines+modulates+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">STAT3 signaling induced by the IL-6 family of cytokines modulates angiogenesis.</a> J Cell Sci. 136 (1), 260182(2023).</li>
<li>Heiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+spheroids+as+a+versatile+tool+to+study+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell spheroids as a versatile tool to study angiogenesis in vitro.</a> FASEB J. 29 (7), 3076-3084 (2015).</li>
<li>Rapp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncostatin+m+reduces+pathological+neovascularization+in+the+retina+through+m%C3%BCller+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Oncostatin m reduces pathological neovascularization in the retina through müller cell activation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (1), 22(2024).</li>
<li>Fagotto, F., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell contact-dependent signaling.</a> Dev Biol. 180 (2), 445-454 (1996).</li>
<li>Rapp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+bias+in+manual+segmentation+of+spheroid+sprouting+assays+with+U-Net%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Addressing bias in manual segmentation of spheroid sprouting assays with U-Net.</a> Mol Vis. 29, 197-205 (2023).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).</li>
<li>Guy, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+cell+invasion+and+migration+process%3A+A+comparison+of+the+video+microscope-based+scratch+wound+assay+and+the+Boyden+chamber+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the Boyden chamber assay.</a> J Vis Exp. (129), e56337(2017).</li>
<li>Decicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> J Vis Exp. (91), e51312(2014).</li>
<li>Vernon, R. B., Angello, J. C., Iruela-Arispe, M. L., Lane, T. F., Sage, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+basement+membrane+matrices+by+cellular+traction+promotes+the+formation+of+cellular+networks+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Reorganization of basement membrane matrices by cellular traction promotes the formation of cellular networks in vitro.</a> Lab Invest. 66 (5), 536-547 (1992).</li>
<li>Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+from+diverse+tissues+exhibit+differences+in+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology.</a> Microvasc Res. 55 (1), 65-76 (1998).</li>
<li>Müller, A. M., Hermanns, M. I., Cronen, C., Kirkpatrick, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+adhesion+molecule+expression+in+cultured+human+macro-and+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of adhesion molecule expression in cultured human macro-and microvascular endothelial cells.</a> Exp Mol Pathol. 73 (3), 171-180 (2002).</li>
<li>Chiew, G. G. Y., Wei, N., Sultania, S., Lim, S., Luo, K. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+three-dimensional+co-culture+of+cancer+cells+and+endothelial+cells%3A+A+model+system+for+dual+analysis+of+tumor+growth+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Bioengineered three-dimensional co-culture of cancer cells and endothelial cells: A model system for dual analysis of tumor growth and angiogenesis.</a> Biotechnol Bioeng. 114 (8), 1865-1877 (2017).</li>
<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 35 (1), 101-111 (1994).</li>
<li>Lambert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+choroidal+neovascularization+model+to+study+age-related+macular+degeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2197-2211 (2013).</li>
<li>Kastana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+plug+assay+for+in+vivo+evaluation+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel plug assay for in vivo evaluation of angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1952, 219-232 (2019).</li>
</ol>

저자는 이 프로젝트에 대한 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 보고서에서는 in vitro에서 혈관신생을 연구하기 위한 기능적 및 분자적 판독과 함께 다양한 기법을 제시했습니다. 
마이그레이션 분석은 습식 실험실 작업의 모든 분야에서 사용되는 잘 정립된 기술을 나타냅니다. 스크리닝 및 용량 반응 실험에 적합한 96웰 형식, WoundMaker 도구로 생성된 표준화되고 재현 가능한 상처 크기, 최대 24시간 동안 타임랩스 이미징을 통해 이동 역학을 관찰할 수 있는 기회 및 자동 이미지 정량화 소프트웨어를 활용하기 위해 상업적으로 이용 가능한 라이브 셀 이미징 접근 방식을 선택했습니다. 그러나 혈관신생 분석 소프트웨어가 장착된 생명세포 이미징 시스템이 실험실이나 핵심 시설에 있어야 합니다. 특정 라이브 셀 이미징 현미경 또는 기타 특수 장비를 필요로 하지 않는 수많은 대체 실험 설정이 확립되었습니다10. 
우리의 경험에 비추어 볼 때, HUVEC 및 기타 혈관 내피 세포 유형은 대비가 좋지 않아 현미경 소프트웨어의 자동 판독을 방해할 수 있으므로 분석기 설정을 최적화하는 것이 중요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 추가적인 형광 염색 단계(예: 라이브 셀 염색)를 도입할 수 있습니다. Live-cell 이미징 시스템은 이러한 염색 및 관심 단백질을 추적하기 위한 다중 색상 염색을 지원합니다. 이 분석의 주요 한계 중 하나는 세포 이동과 증식을 구별하는 것이 항상 간단하지 않고 분석 결과가 두 과정의 조합을 나타낸다는 것입니다. 이 연구에 사용된 라이브 셀 이미징 솔루션은 상대 상처 밀도(RWD)를 도입하여 이 문제를 해결하려고 합니다. 긁힌 영역에서 전통적으로 사용된 합류점과 달리 RWD는 외부 긁힌 영역을 기준으로 긁힌 영역 내의 합류점을 평가합니다. 긁힌 영역에서의 이동은 세포 이동으로 인해 긁힌 영역 외부의 합류를 감소시키는 동시에 긁힌 영역 내부의 합류도를 증가시켜 RWD를 상승시킵니다. 반대로, 세포 증식은 긁힌 영역 외부의 합류를 증가시켜 RWD를 감소시킵니다. 이를 최종 판독값에 대한 확산의 영향을 줄이기 위한 전략적 분석 접근 방식으로 인식하는 것이 중요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 보완적 증식 분석이 필요할 수 있습니다. 대안적으로, 미토마이신 C와 같은 세포주기 억제제를 분석에 추가하여 증식을 차단할 수 있습니다. 이러한 억제제에 대한 프로토콜 구현은 분석의 동적 범위를 줄이지 않고 원하는 효과를 얻을 수 있도록 각 실험실에서 신중하게 최적화해야 합니다. 또한 각 웰의 스캐닝 빈도를 증가시킴으로써 이 설정은 이러한 상세한 추적이 특히 필요한 경우 개별 수준에서 움직이는 세포를 정확하게 추적할 수 있는 쉽게 구현할 수 있는 기회를 제공합니다. 
live-cell imaging migration assay는 확장성과 자동화된 편향되지 않은 분석의 이점을 보여주지만, 이전 연구에서는 혈관신생의 보다 복잡한 세부 사항을 캡처할 수 있는 spheroid srouting assay의 능력을 강조했습니다. 여기에는 팁 및 스토킹 세포 형성, 세포-매트릭스 상호 작용 및 해당작용 스위치(12)와 같은 기본 측면이 포함됩니다. 분석 재현성을 보장하려면 이 과정에서 pH와 온도의 변화가 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 조사자는 콜라겐 매트릭스를 준비하는 데 경험이 있어야 합니다. 또한 분석은 수동으로 수행됩니다. 따라서 이미지 분석은 시간이 많이 걸리고 편향의 위험이 있습니다. 분석 중 조건을 적절하게 마스킹하는 것은 바이어스가 유입되는 것을 방지하는 데 필수적입니다. 이러한 우려를 해결하기 위해 우리는 최근 발아 분석 분석에서 잠재적 편향을 식별하고 완화하기 위한 신경망 기반 접근 방식을 제안했으며, 이는 쉽게 구현할 수 있습니다17. 결론적으로, 결과를 검증하는 가장 좋은 방법은 두 분석을 결합하는 것입니다. 그러나, 2D 및 3D 설정12의 뚜렷한 특성으로 인해 차이가 발생할 수 있음을 인정하는 것이 중요하다.
2D 및 3D in vitro angiogenesis assay의 선택이 다양하기 때문에 다른 방법과 비교하여 제시된 assay의 장점과 단점을 고려하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 스크래치 상처 분석은 플라스틱 접시의 2D 수평 이동에 초점을 맞추는 반면, Boyden 챔버 분석은 "외부 챔버"에서 화학 유인제가 있는 메쉬 인서트를 통한 수직 이동을 특성화합니다. 간단한 설정 및 판독을 기반으로 하는 Scratch Wound Assay는 특히 96웰 형식으로 고처리량 실험을 가능하게 하여 높은 재현성을 제공할 뿐만 아니라 실험을 시각화하고 타임랩스를 수행할 수 있는 가능성을 제공합니다. 불행히도, 스크래치 상처 분석의 단점은 증식과 이동을 구별하기 어렵고, 부착 세포가 필요하며, 상처 제조 도구가 없는 경우 불균등한 긁힘으로 인한 변동성이 높다는 것입니다. Boyden Chamber Assay의 판독은 운동성 세포18 에 대한 용해성 물질의 화학주성 효과를 측정하는 이점이 있으며 침입 및 이동을 모두 강조합니다. 불행히도, 단점은 분석의 낮은 재현성과 높은 분산, 세포의 움직임을 시각화할 수 없음, 신호를 얻는 데 필요한 이동된 세포의 수가 많음, 상당히 길고 정교한 설정 및 판독, 타임랩스 설정의 기회 부족 등이다19.
스페로이드 발아 분석은 내피 세포가 3D 겔 매트릭스로 발아하는 것을 정량화하는 반면, 튜브 형성 분석은 겔 매트릭스20 표면에 세포관의 형성을 특성화합니다. 새싹 분석은 세포가 매트릭스로 침입하는 것뿐만 아니라 증식 및 이동을 특성화하는 장점이 있습니다. 단점은 적정된 콜라겐 겔의 더 높은 분산과 이를 기반으로 한 스페로이드의 품질입니다. 튜브 형성 분석의 장점은 뚜렷한 시간(사이토카인에 따라 다름) 후에 혈관 튜브가 형성되고 쉽게 접근할 수 있다는 것입니다. 단점은 세포의 침입이 없고 Matrigel 자체가 튜브 형성에 미치는 영향입니다21.
제시된 모든 실험은 HUVEC으로 수행되었습니다. 서로 다른 기원(예: 거대혈관 대 미세혈관)의 혈관내피세포의 행동에 상당한 차이가 존재한다는 것은 잘 알려져 있습니다22,23. 따라서 다른 혈관 내피 세포주와 함께 실험 결과를 검증해야 할 수도 있습니다. 실험 설정은 HRMVEC가 더 높은 FBS 농도를 필요로 한다는 사실을 제외하고는 인간 망막 미세혈관 내피(HRMVECS)에 대해 이전할 수 있었습니다. 반면에, 일반적으로 사용되는 소 대동맥 내피 세포주(BAEC)는 과도한 기저 발아 속도로 인해 스페로이드 발아 분석에 사용할 수 없었습니다.
제시된 두 분석 모두 단일 세포 유형에 국한된다는 한계가 있습니다. in vivo 혈관신생이 복잡한 다세포 과정이라는 점을 감안할 때, 이 중요한 측면은 어느 분석으로도 정확하게 포착되지 않습니다. 두 분석에 대한 공동 배양 변형이 특히 스페로이드 발아 분석에 중점을 두고 개발되었으며 최근에는10,24에 대해 논의되었습니다. 또는 관련 in vivo 혈관신생 모델에서 직접 데이터를 검증하는 것이 실행 가능한 옵션입니다. 이러한 목적을 위해 확립된 분석법으로는 산소 유도 망막병증(OIR)25에 대한 마우스 모델, 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(Laser-CNV) 모델(26) 및 플러그 분석법(27)이 있습니다.
전반적으로, 2D 라이브 셀 이미징 이동 분석과 3D 스페로이드 발아 분석은 제시된 분자 분석 도구와 함께 혈관 신생 연구를 위한 강력한 플랫폼을 제공하며 혈관 신생 커뮤니티 내에서 널리 인정받고 있습니다. 이러한 분석을 후속 in vivo 분석과 결합하여 결과를 검증하면 특정 혈관신생 관련 질문을 조사하기 위한 견고한 기반을 제공할 수 있습니다.

혈관신생술은 기존의 혈관에서 새로운 혈관이 형성되는 것을말하며1 생리적 발달 및 병리학적 조건에서 중요한 과정이다. 이는 망막(retina)2 또는 발달 중인 중추신경계(central nervous system)3와 같이 대사 활동이 활발한 조직에 에너지를 공급하고, 손상된 조직4을 치유하는 과정에서 필수적이다. 반면에 비정상적인 혈관 신생은 수많은 질병의 기초가 됩니다. 대장암이나 비소세포폐암과 같은 고형암은 혈관신생을 촉진하여 종양의 성장과 필요한 에너지 공급을 촉진한다5. 암 외에도 당뇨병성 망막병증 또는 연령 관련 황반 변성과 같은 눈의 신생 혈관 질환은 선진국에서 실명의 주요 원인으로 비정상적인 혈관 성장의 결과입니다 6,7. 근본적인 발병 기전에 대한 자세한 이해는 예를 들어 혈관 증식성 안구 질환과 같은 병리학적 상태를 더 잘 제어하면서 상처 치유에서 생리적 혈관 신생을 향상시킬 수 있는 방법을 이해하는 데 중요합니다.
세포 수준에서, 혈관 내피 세포는 혈관 신생에서 다양한 신호 분자에 의해 활성화되어 세포 증식과 이동을 시작한다8. 세포는 이어서 계층으로 조직되며, 비증식하는 팁 세포는 발달 중인 혈관 분지(8)의 선두 가장자리에 선체(filopodia)를 형성합니다. 이와 함께 빠르게 증식하는 줄기 세포가 팁 세포를 따라가며 새로 나오는 혈관의 형성에 기여합니다. 그 후, pericyte 또는 평활근 세포와 같은 다른 세포 유형이 모집되어 초기 분지9를 더욱 안정화시킨다.
혈관 내피 세포 수준에서 분자 과정을 탐구하기 위해 수많은 in vitro 프로토콜이 개발되었으며 최근에는10 검토되었습니다. 이러한 분석은 일반적으로 두 가지 범주로 나뉩니다: 더 단순하지만 확장 가능한 2D 접근 방식과 더 정교한 3D 프로토콜. 최근 프로젝트에서 우리는 2D 긁힌 상처 이동 분석과 3D 스페로이드 발아 분석(11 ) 간의 포괄적인 비교 분석을 수행하여 차이점의 정도와 혈관 신생의 다양한 측면을 모델링할 수 있는 능력을 평가했습니다12. 
둘 다 신뢰할 수 있고 쉽게 구현할 수 있다는 장점을 제공하지만, 분자 수준에서 3D 스페로이드 발아 분석은 대사 스위치 또는 세포-매트릭스 상호 작용과 같은 생체 내 데이터와 비교하여 혈관 신생의 주요 측면을 해결하는 데 유리했습니다. in vitro angiogenesis assay는 신호전달 경로(13)의 혈관조절 전위를 평가하고 치료제를 스크리닝하는 데 사용되기 때문에, in vitro 결과를 in vivo 환경으로 이전하는 것이 필수적이다. 또한, 통제된 조건에서 혈관 생성 과정의 표적 조절에 대한 반응으로 분자 변화를 특성화하기 위한 RNA 및 단백질 수준에 대한 오믹스 기반 분석의 기회는 생체 내 설정에 비해 중요한 이점으로 남아 있습니다14,15.
이 간행물에서는 단백질 수준에서의 전사체 분석을 위한 RNA 염기서열 분석 및 면역조직화학과 같은 후속 분자 분석을 포함하여 살아있는 세포 이미징 이동 분석 및 스페로이드 발아 분석의 활용을 통해 혈관 신생 관련 질문을 탐구하기 위한 주요 분석을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>10x 미디엄 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)' 2-프래그먼트</td><td>잭슨 IR&nbsp;</td><td>115-606-072</td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert. A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CapturePro 2.10.0.1</td><td>JENOTIK 광학 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 타입 1 쥐 꼬리</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11088858001</tr><tr><td>내피 세포 기초 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>EBM</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산&nbsp;</td><td>Serva</td><td>11290.02</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>소 태아 세럼</td><td>Bio& SELL</td><td>S 0615</td><td>FBS</td></tr><tr><td>인간 엄빌리컬 베인 내피 세포, 풀드</td><td>Lonza</td><td>C2519A</td><td>HUVEC</td></tr><tr><td>IncuCyte ImageLock 96-웰 플레이트&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte S3 라이브 셀 분석 시스템</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methocel</td><td>Sigma</td><td>m-0512</td><td></td></tr><tr><td>10% FBS가 있는 미세혈관 내피 세포 배지</td><td>PB-MH-100-4090-GFP</td><td>PELOBiotech</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth</td><td>P031.2</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate 표지(0.5mg/mL 메탄올)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282-.1MG</td><td>Phalloidin-FITC</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>14190-094</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1차 인간 망막 미세혈관 내피 세포</td><td>세포 시스템</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific의 NucBlue Invitrogen</td><td>을 사용한 ProLong Glass Antifade Mountant</td><td>2260939</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent</td><td>QIAGEN</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 혈관 내피 성장 인자</td><td>PeproTech</td><td>100-20</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>제곱 페트리 접시</td><td>Greiner</td><td>688102</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>PAN-Biotec</td><td>P10-024100</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-R2 (monoclonal)</td><td>ThermoFisher Scientific Inc.</td><td>B.309.4</td><td></td></tr><tr><td>WoundMaker</td><td>장갑</td><td>4493</td><td></td></tr></tbody></table>

scratch wound migration assay와 spheroid sprouting assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

Investigating Angiogenesis on a Functional and Molecular Level by Leveraging the Scratch Wound Migration Assay and the Spheroid Sprouting Assay

혈관신생은 종양 성장 또는 신생혈관 안질환을 포함한 신체 내 생리학적 및 병리학적 과정 모두에서 중요한 역할을 합니다. 근본적인 분자 메커니즘에 대한 자세한 이해와 신뢰할 수 있는 스크리닝 모델은 질병을 효과적으로 표적으로 삼고 새로운 치료 옵션을 개발하는 데 필수적입니다. 혈관신생을 모델링하기 위해 여러 in vitro assay가 개발되었으며, 분자 수준에서 혈관신생 동인을 규명하고 치료 표적을 스크리닝하기 위해 통제된 환경이 제공하는 기회를 활용하고 있습니다.
이 연구는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 사용하여 체외 에서 혈관 신생을 조사하기 위한 워크플로우를 제시합니다. 2D 설정에서 내피 세포 이동을 측정하는 라이브 셀 이미징 시스템을 활용한 스크래치 상처 이동 분석과 콜라겐 매트릭스가 제공하는 3D 설정에서 내피 세포 발아를 평가하는 스페로이드 발아 분석에 대해 자세히 설명합니다. 또한 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 3D 환경에서 전사체학(transcriptomics)과 같은 추가 분자 분석을 가능하게 하는 시료 전처리 전략을 간략하게 설명합니다. 전체적으로 이 프레임워크는 과학자들에게 체외 혈관신생 분석에 대한 과학적 연구를 추구할 수 있는 신뢰할 수 있고 다재다능한 도구 세트를 제공합니다.

이동 분석의 경우, 완전히 형성된 세포 단층의 존재가 시스템에서 정확하게 감지되도록 t = 0h 시점에서 캡처된 이미지를 철저히 검사하는 것이 중요합니다(그림 1B). 또한 스크래치 테두리의 선명도와 직진도를 확인해야 합니다(그림 1B). cell-free 영역에는 이물질이 거의 없어야 합니다. 분석이 끝날 때, 예를 들어 25ng/mL VEGF를 양성 대조군으로 자극한 그룹은 원래의 긁힌 영역에서 성공적인 이동을 보여야 합니다(그림 1B). 기술적 문제의 예는 고르지 못한 세포 성장, 이중 긁힘 또는 긁힘 경계의 물결 모양으로 나타날 수 있습니다(그림 1C). 또한 음성 대조군(EBM 자극 샘플)과 양성 대조군(VEGF 샘플) 사이에 상당한 동적 범위를 설정하는 것이 중요합니다(그림 1D). 실험 설정에서는 12시간 후 RWD가 25% 증가하는 것을 최적의 범위로 간주합니다(그림 1D). 기술적으로 문제가 있는 분석에서는 positive control과 negative control이 올바르게 분리되지 않아 dynamic range가 낮다는 것을 나타냅니다(그림 1E).
성공적인 염색을 검증하기 위해 형광 현미경으로 시각화한 커버슬립에 대한 HUVEC의 면역세포화학적 염색(그림 1F). 대부분의 세포를 조사하고 슬라이드의 특징적인 영역을 식별하는 것이 중요합니다. 염색 특이성은 비특이적 결합을 배제하기 위해 2차 항체로만 처리된 대조군 슬라이드를 사용하여 평가합니다(그림 1F). 특정 염색 신호는 표적 단백질의 알려진 subcellular localization에 따라 비판적으로 검사해야 합니다. 우리는 대조군 샘플에 신호가 없는 것과 함께 세포 내 국소화 패턴을 성공적인 면역염색 프로토콜의 지표로 사용합니다.
마찬가지로, 고품질 스페로이드 발아 분석을 위해서는 특정 측면을 고려해야 합니다. 이 경우 품질은 분석이 끝날 때 예를 들어 t = 24h에서 평가해야 합니다. 현미경으로 관찰된 콜라겐 매트릭스는 균질성을 보여야 하며 부서지기 쉽거나 거칠게 보이지 않아야 합니다(그림 2B). 음성 대조군으로 기저 배지만으로 자극하고 양성 대조군으로 25ng/mL VEGF를 자극한 스페로이드는 명확하게 구별할 수 있어야 합니다(그림 2B). 또한 스페로이드는 겔 속에 떠 있어야 하며 땅으로 떨어지지 않아야 하며, 땅으로 떨어져 분산되어 품질이 낮다는 것을 나타냅니다(그림 2C). 이 문제는 혼합물의 적정 중 콜라겐의 부적절한 냉각 또는 pH의 과잉 또는 과소 적정으로 인해 종종 발생합니다(그림 2C). 각 웰에 대해 웰당 최소 10개의 스페로이드를 이미지화할 수 있어야 합니다. 음성 대조군(EBM 자극 샘플)은 중간 정도의 기준선 발아 속도를 보여야 하는 반면, 양성 대조군 역할을 하는 VEGF는 대조군에 비해 RSL을 이상적으로 두 배 또는 세 배로 늘리는 것이 좋습니다(그림 2D, 왼쪽 그래프). 새싹의 수도 비슷한 동적 범위를 보여야 합니다(그림 2D, 오른쪽 그래프). 기술적 차선의 분석은 대조군 간의 이러한 동적 범위를 보여주지 않으므로 데이터를 잘못 해석할 수 있습니다(그림 2E).
아날로그에서 2D로의 염색, 형광 현미경으로 슬라이드 검사 및 염색된 구조에 대한 비판적 평가는 성공적인 염색을 위해 매우 중요합니다(그림 2F). 구조의 세포 국소화와 대조군과 비교한 신호 강도를 이해할 수 있다면 염색이 성공적이었다고 가정할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66954/66954fig01v4.jpg"> 그림 1: live-cell imaging scratch wound migration assay. (A) scratch wound migration assay의 계획. (B) t = 0 h 및 t = 12 h에서 고품질 기술 복제를 보여주는 이미지. 세포는 25ng/mL VEGF로 자극되어 양성 대조군 역할을 합니다. (C) 부적절한 긁힘 또는 이중 긁힘으로 인해 t = 0 h에서 두 번의 저품질 기술 복제의 예. (D) 성공적인 긁힌 상처 이동 분석 결과. 25ng/mL VEGF로 자극된 양성 대조군과 기저 배지로 방금 처리한 음성 대조군의 올바른 분리는 t = 12h에서 바이올린 플롯에 의해 추가로 시각화되었습니다. 데이터에는 그룹당 7-8개의 기술 반복실험이 포함됩니다. (E) 실패한 Scratch Wound Migration Assay를 강조하는 예시적인 결과. 25ng/mL VEGF로 자극된 양성 대조군과 기저 배지로 방금 처리된 음성 대조군의 최적이 아닌 분리를 t = 12h에서 바이올린 플롯으로 시각화했습니다. 데이터에는 그룹당 7-8개의 기술 반복실험이 포함됩니다. (F) 커버슬립에 파종하고 DAPI, phalloidin 및 VEGF-R2에 대해 염색된 HUVEC의 예시적인 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66954/66954fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66954/66954fig02.jpg"> 그림 2: 스페로이드 발아 분석. (A) 스페로이드 발아 분석의 계획. (B) t = 24 h에서 이상적인 기술 분석의 음성 대조군(기저 매체 자극 스페로이드) 및 양성 대조군(VEGF 25 ng/mL 자극 스페로이드)을 보여주는 이미지. (C) t = 24 h에서 두 개의 저품질 스페로이드의 예. 왼쪽 이미지는 손상된 스페로이드가 플레이트 바닥으로 떨어지면 스페로이드 몸체가 헐거워지고 싹이 비정상적으로 빨라지는 것을 시각화합니다. 오른쪽 이미지는 눈에 띄는 색상 패치로 콜라겐을 시각화하여 분석의 품질을 크게 저하시키는 매우 이질적인 환경을 만듭니다. (D) 음성 대조군과 양성 대조군 사이의 양호한 동적 범위를 가진 성공적인 분석의 RSL(왼쪽 그래프) 및 새싹 수(오른쪽 그래프) 분석. 데이터는 바이올린 플롯을 사용하여 시각화되며 그룹당 10-25개의 스페로이드를 포함합니다. (E) negative control과 positive control 사이의 최적이 아닌 동적 범위를 가진 기술적 문제가 있는 분석의 RSL(왼쪽 그래프) 및 새싹 수(오른쪽 그래프) 분석. 데이터는 바이올린 플롯을 사용하여 시각화되며 그룹당 10-25개의 스페로이드를 포함합니다. (F) DAPI, phalloidin, VEGF-R2.c에 대해 염색된 스페로이드 발아 분석에서 얻은 HUVEC의 예시 이미지
보충 파일 1: 메토셀 원액 제조 지침. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66954/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: SpheroidCount.ijm 플러그인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66954/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A ...

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 암세포가 분비하는 인자 풀의 혈관 형성 가능성을 설명하기 위해 초음파와 내시경이라는 두 가지 상보적인 이미징 방식을 사용하여 마트리겔 플러그 분석을 설명합니다. 세포외 기질(ECM)-모방 겔인 마트리겔(matrigel)은 조건화된 배지(C.M.)로 분비되는 혈관 형성 인자를 숙주(마우스)에 도입하는 데 사용됩니다.

고속 성장하는 종양 생성 세포에 의해 분비 요인에 의해 보충 모니터링 기능 및 혈관의 형태학

이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

이 종이 여부를 평가 체 외에 고전적인 종양 신생 hemangioblastomas (HBs)와 HBs에서의 역할에 있는 포괄적인 절차를 제공 합니다. 결과 HB neovascularization의 복잡성을 강조 하 고는 것이 좋습니다이 일반적인 형태의 신생 HB neovascularization만 보완 메커니즘.

분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

이 프로토콜 선물 소설 체 외에서 구슬 시험을 더 적절 하 게 vivo에서 pericytes를 통합 하 여 신생을 돋 아의 프로세스 모델. 이 수정 구슬 분석 결과를 내 피 세포와 신생에 대 한 중요 한 벽화 셀 간의 heterotypic 세포 상호 작용을 더 충실 하 게 정리를 수 있습니다.

분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 Pericytes 통합

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

3차원 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석 시스템은 생리적 혈관신생을 모방하도록 설계된다. 공배양 스페로이드는 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, ECFC 및 MSC에 의해 형성되고, 콜라겐 겔에 내장된다. 새로운 시스템은 혈관 신생 변조기를 평가하는 데 효과적이며 생체 내 연구에 보다 관련성이 있는 정보를 제공합니다.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

발아 및 질병의 기본이 되는 발아 혈관 신생은 복잡한 분자 및 기계적 과정을 포함합니다. 우리는 돼지 경동맥에서 발아하는 세포를 분석하여 강성 의존적 혈관 신생과 뚜렷한 리더-추종자 세포 역학을 밝히는 다재다능한 2.5D 생체 외 모델을 제시합니다. 이 모델은 조직 공학 전략 및 암 치료 접근 방식을 발전시키는 데 도움이 됩니다.

2.5D 모델: 생체 조직에서 발아 혈관 형성의 생체 외 기계적 특성화를 위한 모델

배우세요 2D 스크래치 상처 이동 분석과 3D 스피로이드 발아 분석을 활용한 혈관신생 연구 방법을. 이 기법들은 분자 수준에서 혈관형성 메커니즘을 조사하고 적절한 분석법을 선택하는 데 필수적인 지침을 제공합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

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