Name: Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 배우세요 마우스 망막 전체 마운트 면역염색 및 AI 기반 자동 계수 기술을 활용한 망막 신경절 세포 정량화 방법을. 이 기술은 녹내장 연구에서 세포 손실을 신속하고 정확하게 평가하여 치료 효능 분석에 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Immunostaining and AI-based Counting of RGCs in mouse whole-mount retina(마우스 전체 장착 망막에서 망막 신경절 세포의 면역염색 및 AI 기반 계수 분석)

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial-ethnic+disparities+in+concurrent+rates+of+peripapillary+%26+macular+OCT+parameters+among+a+large+glaucomatous+clinical+population%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population.</a> Eye. , (2024).</li>
<li>Atkinson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+measure+of+patient+satisfaction+with+ocular+hypotensive+medications%3A+the+Treatment+Satisfaction+Survey+for+Intraocular+Pressure+%28TSS-IOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Qual+Life+Outcomes%22%5BJournal%5D)">A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP).</a> Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse-fixation+device+for+IOP+measurement+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice.</a> Vision Res. 219, 108397(2024).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+counting+of+retinal+ganglion+cells+in+the+entire+mouse+retina+based+on+improved+YOLOv5%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Res%22%5BJournal%5D)">Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5.</a> Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).</li>
<li>Al-Khindi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Tbx5+regulates+direction-selective+retinal+ganglion+cell+development+and+image+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization.</a> Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).</li>
<li>Claes, M., Moons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells%3A+Global+number%2C+density+and+vulnerability+to+glaucomatous+injury+in+common+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice.</a> Cells. 11 (17), 2689(2022).</li>
<li>Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-based+whole-mount+preparation+for+the+investigation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (194), e65222(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1&시간; PBS</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG&nbsp; (H+엘)</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BRN3A 항체 [EPR23257-285]</td><td>Abcam</td><td>ab245230</td><td></td></tr><tr><td>AutoCount 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs</td></tr><tr><td>클라우드 디스크</td><td>Google 드라이브 링크</td><td></td><td>https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6&nbsp;</td></tr><tr><td>클라우드 디스크</td><td>Baidu 링크</td><td>추출 코드: g44k</td><td>https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg&nbsp;</td></tr><tr><td>마커</td><td>샤피</td><td></td><td></td></tr><tr><td>노멀 당나귀 세럼</td><td>Biosharp, Labgic</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>맥클린</td><td>P804536</td><td></td></tr><tr><td>ProClean 300</td><td>Beyotime</td><td>ST853</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>BBI, 상곤</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>BioFroxx, 네오프록</td><td>1139ML100</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-mount immunostaining and automatic counting of mouse retinal ganglion cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells

이 프로토콜은 마우스 망막의 전체 마운트 면역염색을 위한 방법론을 자세히 설명하여 세심한 조직 준비, 정확한 항체 배양 및 신뢰할 수 있는 자동 세포 계수를 보장합니다. 이 절차는 망막 신경절 세포(RGC)의 강력한 라벨링 및 정량화를 용이하게 하여 다양한 실험 상황에서 세포 집단을 정확하게 평가할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 야생형 및 녹내장 모델링 마우스에서 망막 신경절 세포를 계수하여 일관된 결과를 얻었습니다. 대표적인 결과는 생후 2개월된 정상적인 성체 쥐의 망막 신경절 세포의 수가 약 45,000개임을 보여줍니다(그림 6).
AI 소프트웨어가 정상 및 질병 모델에서 BRN3a 표지 망막 신경절 세포를 정확하게 정량화할 수 있는지 평가하기 위해 녹내장7의 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA) 유도 마우스 모델을 생성했습니다. 이 모델의 전체 산지 망막은 항-BRN3A로 면역염색되었고, 망막 신경절 세포는 자동 계수 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다. 그 결과 상대적으로 높은 배경 염색이 나타났습니다(그림 7). 그럼에도 불구하고 이 소프트웨어는 거의 모든 망막 신경절 세포를 정확하게 식별할 수 있었습니다. 이 망막에서는 총 15,231개의 망막 신경절 세포가 확인되었는데, 이는 정상 마우스 망막에서 약 45,000-50,000개의 망막 신경절 세포가 확인된 것으로, 심각한 퇴행을 나타냅니다. 따라서 AI 소프트웨어는 최적의 염색 품질이 떨어지는 망막의 망막 신경절 세포를 계수하는 데에도 효과적으로 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig01.jpg"> 그림 1: 망막 신경절 세포 준비를 위한 개략도. (A) 안구를 제거하고 1x PBS에 넣습니다. (B) 안구를 얼음에 4 % PFA로 3 시간 동안 고정합니다. (C) 각막 제거. (D) 렌즈의 추출. (E) 아이컵은 가위를 사용하여 4개의 플랩으로 나뉩니다. (F) 공막을 벗겨내고 부드러운 브러시로 망막 표면의 이물질을 부드럽게 제거합니다. (G) 망막은 항-BRN3A로 면역 표지되어 있습니다. (H) 형광 신호는 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지화됩니다. (I) 망막 신경절 세포의 자동 계수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig02v3.jpg"> 그림 2: 전체 마운트 마우스 망막의 분리. (A) 마우스는 자궁 경부 탈구에 의해 안락사되었습니다. (B) 마우스는 평평한 표면에 놓입니다. (C) 안구를 가위로 조심스럽게 제거합니다. (D) 안구를 1x PBS에 부드럽게 배치합니다. (E) 안구는 각막의 가장자리에 겸자로 고정됩니다. (F) 바늘로 각막 가장자리를 작게 절개합니다. (G) 각막을 제거한 후 그릇 모양의 구조를 제거합니다. (H) 렌즈는 집게로 조심스럽게 제거됩니다. (I) 각막의 가장자리를 따라 공막의 시신경 쪽으로 작은 절개를 하여 망막의 손상을 방지합니다. (J) 공막은 집게로 절개 부위를 따라 찢어집니다. (K) 망막을 평평하게 펴고 붓으로 청소합니다. (L) 망막은 평평해지고 얼음처럼 차가운 메탄올로 빠르게 고정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig03.jpg"> 그림 3: 전체 마운트 마우스 망막의 면역염색. (A) 1x PBS로 세척한 후 차단 완충액으로 망막을 차단합니다. (B) 망막은 4 °C에서 하룻밤 동안 1 차 항체로 배양됩니다. (C) 망막은 1x PBS로 세 번 세척합니다. (D) 망막을 실온에서 2시간 동안 2차 항체와 함께 배양합니다. (E) 망막은 망막 신경절 세포가 위쪽을 향하도록 하는 유리 슬라이드에 장착됩니다. (F) 이미지는 레이저 컨포칼 현미경을 사용하여 획득합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig04.jpg"> 그림 4: 자동 계산 소프트웨어 설치. (A) 1 단계는 파일 경로를 "yolov5_cpu"디렉토리로 업데이트하는 것입니다. (B) 그래픽 인터페이스가 시작됩니다. (C) 모델 파일이 C 드라이브의 루트 디렉토리에 있는지 확인 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig05.jpg"> 그림 5: 자동 망막 신경절 계수 소프트웨어의 작동. (A) 계수 소프트웨어가 열립니다. (B) OPEN IMAGE 버튼을 클릭하여 이미지를 가져옵니다. (C) RUN 버튼을 클릭하면 자동 계산이 시작됩니다. (D) 계산 된 셀은 빨간색 사각형 상자로 표시되고 셀 번호는 오른쪽 상단 모서리에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig06.jpg"> 그림 6: 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수. 상단 패널(왼쪽)은 anti-BRN3A로 면역염색된 평판 장착 망막의 대표적인 결과를 보여줍니다. 상단 패널(오른쪽)은 이전에 개발된 소프트웨어를 사용한 망막 신경절 세포의 자동 계수를 보여줍니다. 눈금자: 100 μm. 위쪽 패널의 삽입이 각각 확대되어 아래쪽 패널에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig07.jpg"> 그림 7: NMDA 유도 녹내장 마우스 모델에서 계산한 망막 신경절 세포. 왼쪽 패널: AI 소프트웨어가 인식하는 망막 신경절 세포를 보여주는 전체 산장 망막의 개요. 오른쪽 패널: 망막의 일부 영역을 확대한 모습. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

Glaucoma is a leading cause of blindness globally, characterized by a complex pathogenic mechanism that makes vision restoration challenging. Mice serve ...

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 유세포 분석을 사용하여 쥐의 원발성 망막 신경절 세포(RGC)를 분리하는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 신경퇴행성 질환에서 기능적 망막 신경절 세포의 상실로 인한 시력의 주요 저하를 더 잘 이해하는 것을 목표로 망막 신경절 세포에 대한 향후 연구를 가능하게 합니다.

형광 활성화 세포 분류를 사용한 쥐 망막 신경절 세포 분리

출처: Lani-Louzada, R., et al. 설치류에서 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 변지 혈관 신경총의 전원형 소작. J. Vis. 특급 (2022). 이 비디오는 윤부 혈관 신경총의 완전한 원형 소작술을 받은 화학적으로 고정된 쥐 망막에서 망막 신경절 세포의 정량화를 보여줍니다. 이 과정에는 투과화(pereabilization), 항체 염색(antibody staining), 핵 대조염색(nuclear counterstaining)이 포함되며, 이어서 상형(epifluorescence) 현미경으로 시각화하여 안압 상승이 망막 신경절 세포 생존력에 미치는 영향을 평가합니다.

Quantification of Retinal ganglion cell somas following cauterization-induced ocular hypertension(소작 유발 안구 고혈압에 따른 망막 신경절 세포 소마의 정량화) 

출처: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina.  J. Vis. 특급 (2021). 이 동영상은 이광자 현미경을 사용한 in vivo 망막 이미징 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스는 머리를 고정하고, 눈 윤활제를 바르고, 눈 위에 커버슬립을 놓아 이미징을 준비합니다. 형광 단백질을 발현하는 망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 정렬을 위해 상피형광(epifluorescence)을 사용하여 먼저 시각화됩니다. 마지막으로, 이광자 이미징이 사용되어 망막 신경절의 고해상도 시각화가 가능합니다.

마우스 망막의 Two-Photon In Vivo 이미징

출처: Laboissonniere, et. al입니다. 망막 신경절 세포의 정의된 부분 집합의 단일 세포 RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).   이 비디오는 형질전환 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC) 아형을 식별하는 형광 추적 기술을 보여줍니다. 이 프로세스에는 기록 챔버에 분리된 망막을 고정하고, 산소 관류로 세포 생존력을 유지하고, 추적자가 있는 피펫을 사용하여 형광 표지된 망막 신경절 세포를 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 수지상 형태 및 성층화를 분석함으로써 별개의 망막 신경절 세포 아형을 분류할 수 있습니다.

Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.

비증식 및 증식 망막증을 가진 마우스의 전체 산 망막에 있는 혈관 매개변수의 정량화

이 원고는 설치류 안구에서 슬라이드의 조직학적 준비를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제안된 방법을 사용하면 광학 현미경으로 내부 망막을 쉽게 시각화하고 평가할 수 있습니다. 절차는 생쥐와 쥐의 안구에 대해 제시됩니다.

망막을 평가하기 위한 쥐와 쥐 안구의 조직학적 슬라이드의 준비 및 분석

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

배우세요 마우스 망막 전체 마운트 면역염색 및 AI 기반 자동 계수 기술을 활용한 망막 신경절 세포 정량화 방법을. 이 기술은 녹내장 연구에서 세포 손실을 신속하고 정확하게 평가하여 치료 효능 분석에 활용됩니다.

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

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