Name: 효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 학습하세요 효모 표면 디스플레이를 이용한 단백질 공학 방법으로, 항원 결합 단백질 변이체를 풍부화하고 세포치료제 개발에 활용하는 기술을 익히세요. 유세포 분석을 통한 실시간 선별이 가능합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>효모 표면 디스플레이 기법을 통한 단백질 기능 최적화

효모 표면 디스플레이는 단백질 공학 분야의 핵심 기술 중 하나입니다. 이를 통해 향상된 친화력 또는 안정성과 같은 원하는 특성을 가진 단백질 변형체를 선택할 수 있습니다. 19971 년에 처음 도입 된이 기술은 파지 디스플레이 2,3, 리보솜 디스플레이4 및 포유류 세포 디스플레이 5,6,7 외에 가장 일반적으로 사용되는 디스플레이 기술 중 하나입니다. 관심 단백질(POI)은 단백질을 고정하기 위해 융합하여 효모 세포 표면에 표시됩니다. 다양한 앵커 단백질을 사용할 수 있으며, 가장 일반적으로 POI는 효모 응집소 짝짓기 단백질 Aga2p 1,8의 C-말단에 융합됩니다. 또한 POI는 일반적으로 헤마글루티닌 태그(HA-tag) 및 c-myc 태그와 같은 두 개의 태그로 둘러싸여 있으며, 이를 통해 형광 표지된 항체 및 유세포 분석을 사용하여 디스플레이 수준을 검출할 수 있습니다(그림 1A). 일반적인 효모 선별 캠페인에는 magnetic bead selection과 flow cytometric sorting의 조합이 포함됩니다. 비드 선택은 큰 세포 수를 처리하고 표적 항원에 결합하는 단백질 변이체의 농축을 가능하게 하는데, 이는 항원이 로드된 비드와의 다가 상호 작용이 열성 효과를 유발하여 친화성이 낮은 변이체의 손실을 방지하기 때문입니다(그림 1B). 유세포 분석 및 선택은 표시된 POI 변이체와 표지된 항원의 결합을 시각화할 수 있는 이점을 제공합니다. 결과적으로, 결합 집단을 분류하고 배양할 수 있으며, 이는 여러 선별 라운드를 통해 원하는 특성을 가진 단백질 변이체를 농축할 수 있습니다. 또한, 무작위 돌연변이 유발의 추가 라운드를 수행하여 다양성을 더욱 증가시킬 수 있으며, 따라서 단백질의 친화성 및/또는 안정성에 기여하는 추가 돌연변이를 찾을 가능성을 높일 수 있습니다.
효모 표면 디스플레이는 (a) 진핵생물 발현 기계, 산화 단백질 접힘 및 진핵생물 번역 후 변형(예: N-글리코실화), (b) 단백질 옆에 있는 두 개의 펩타이드 태그 검출로 인한 발현 정규화, (c) 유세포 분석을 통한 선택 진행 상황의 육안 검사(예: 결합 세포의 비율 및 결합 강도) 및 (d) 개별 단백질 돌연변이를 분석할 수 있는 가능성과 같은 특정 이점을 제공합니다. 효모(예: 열안정성 및 친화도 분석)는 힘든 단백질 발현 및 정제에 대한 시간 절약형 대안을 제시합니다9. 실제로, 효모 표면에 표시된 단백질의 친화도(KD값)와 안정성(T50 값)은 모두 생물물리학적 방법 및 용해성 단백질을 사용하여 얻은 데이터와 좋은 상관관계를 보여주었습니다 9,10,11,12. 효모 표면 표시는 다양한 단백질, 예를 들어 항체 단편 13,14,15,16, 10번째 유형 III 피브로넥틴 도메인 17,18, rcSso7d19,20 또는 매듭21의 엔지니어링에 사용되었습니다. 유사하게, 아미노산 코돈 사용뿐만 아니라 무작위 위치를 변경하여 효모 라이브러리 설계를 최적화하기 위한 광범위한 연구가 수행되었습니다 17,22,23. 효모 표면 디스플레이는 안정성 14,15,24,25, 친화도18,26,27, 효소 활성 28,29,30,31 및 단백질 발현32의 엔지니어링에 대해 성공적인 것으로 입증되었습니다. 또한, 작은 분자의 존재 또는 부재 시 조건부 결합과 같은 보다 정교한 응용은 효모 표면 디스플레이20을 사용하여 수행되었습니다.
이 프로토콜에서는 소분자 A112020의 존재 하에서 항원 인간 레티놀 결합 단백질 4(hRBP4)에 대해 선택된 G4 라이브러리(10번째 유형 III 피브로넥틴 도메인, Fn3 기반)의 예와 함께 효모 표면 표시를 사용한 선택 캠페인의 모든 필수 단계를 설명합니다. 이 선택은 분자 스위치로 사용될 수 있는 작은 분자에 의존하는 단백질-단백질 상호 작용을 생성하기 위해 수행되었습니다. 참고로, 효모 표면 표시를 통한 대체 접근법이 가능하지만, 일반적인 효모 선택은 일반적으로 이전의 결합 친화성 없이 표적 항원에 결합하는 것을 목표로 합니다. 당사는 효모 라이브러리 배양, 비드 선택, 유세포 분석 분류 및 오류가 발생하기 쉬운 PCR(epPCR)에 의한 친화성 성숙을 포함하는 효모 선별 캠페인의 모든 단계를 다룹니다. 따라서 이 프로토콜은 이전 효모 표면 표시 프로토콜33,34를 보완하며 주어진 효모 라이브러리 및 선택한 표적 항원과 함께 효모 표면 표시 선택(그림 1)의 기초로 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig1v5.jpg"> 
그림 1: 효모 표면 표시의 원리 및 효모 표면 표시 선택을 위한 일반적인 작업 흐름. (A) POI는 효모 표면 디스플레이 벡터로 복제되며 일반적으로 N-말단 HA- 및 C-말단 c-myc-tag가 측면에 있습니다. 이 구조체는 효모 짝짓기 단백질 Aga2p에 융합되어 표면에 표시됩니다. 묘사된 단백질은 PDB ID: 6QBA20의 엔지니어링된 바인더 "RS3"입니다. (B) 효모 표면 디스플레이 선택 캠페인의 일반적인 워크플로우를 보여주는 순서도로, 비드 선택 및 유세포 분석 분류를 통해 원하는 특성을 가진 단백질 변이체의 농축과 친화성 성숙을 위한 epPCR을 결합합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig1largev5.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>10-베타 전기 역량 E. coli&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>한천, Kobe I</td><td>Carl Roth</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>Carl Roth</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-myc 항체, 클론 9E10, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A488 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-myc 항체, 클론 9E10, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A647 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA 항체, 클론 16B12, AF488</td><td>BioLegend</td><td>901509 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA 항체, 클론 16B12, AF647</td><td>BioLegend</td><td>682404 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 차가운 에탄올 분획</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>구연산 일수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>D-Galactose</td><td>Carl Roth</td><td>4987.2</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Difco 효모 질소 기반</td><td>Becton Dickinson (BD)&nbsp;</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>디-소듐 수소 인산염 헵타하이드레이트</td><td>Carl Roth</td><td>X987.3</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>시그마-알드리치</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-소르비톨</td><td>Carl Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Thermo</td> <td>Scientific</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Biotin Binder</td><td>Invitrogen</td><td>11047 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EBY100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvette 1 mm (for E.coli)</td><td>VWR</td><td>732-1135</td><td></td></tr><tr><td>전기천공법 큐벳 2 mm (효모용)</td><td>VWR</td><td>732-1136</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 절대</td><td>MERCK</td><td>1070172511</td><td></td></tr><tr><td>GeneMorph II 랜덤 돌연변이 유발 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>200550</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Casamino Acids</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>223120</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>131339.1211</td><td></td></tr><tr><td>LE 아가로스& 주의;</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이트 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>모나크 DNA 겔 추출 키트</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td></td></tr><tr><td>모나크 PCR & DNA 클린업 키트</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td></td></tr><tr><td>멀티퓨지 1S-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>성장 매체</td><td>NEB</td><td>B9035S</td><td></td></tr><tr><td>pCTCON2</td><td>Addgene</td><td>#41843</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His 항체, AF488</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His 항체, AF647</td><td>Qiagen</td><td>35370</td><td></td></tr><tr><td>Peptone ex casein tryptically digested</td><td>Carl Roth</td><td>8986.3</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>SaII-HF</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr> 인<tr><td>산이수소나트륨 일수화물</td><td>Carl Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 나사산 병 상단 필터</td><td>MERCK</td><td>S2GPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>S32354 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신 설페이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Sodium citrate dihydrate</td><td>Carl Roth</td><td>4088.1</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 분광 광도계</td><td>Agilent</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물, 미세 과립</td><td>Carl Roth</td><td>2904.4</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep 효모 플라스미드 Miniprep II</td><td>Zymo Research</td><td>D2004&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

Protein Engineering by Yeast Surface Display

G4 라이브러리는 소분자 약물 A1120에 결합된 항원 hRBP4에 대해 선택되었습니다. 유세포 분석을 위한 라이브러리의 염색은 Method 6에 설명된 대로 수행되었으며 적용된 게이팅 전략은 그림 2A에 나와 있습니다. 첫 번째 게이트에는 세포 형태에 따른 모든 세포가 포함되었고, 두 번째 게이트(FSC-Width의 히스토그램)는 단일 세포를 선택하고 세포 응집체를 제거하기 위해 적용된 엄격한 게이팅 전략을 보여주었습니다. 세 번째이자 마지막 게이트는 단백질 변이체(x축) 대 항원 결합(y축)의 표시를 보여주었습니다. 디스플레이 신호와 결합 신호를 모두 보여주는 효모 세포를 분류했습니다. 중요한 것은 sorting gate가 높은 결합 신호로 결합 도메인을 풍부하게 하여 높은 친화력을 갖도록 엄격한 방식으로 설정되었다는 것입니다. 이 엄격한 선택은 선택 캠페인 전반에 걸쳐 표적 항원에 특이적으로 결합하는 효모 세포를 표시하는 농축을 산출했습니다(그림 2B). 이후의 유세포 분석 분류 라운드에서 항원 농도는 10배 감소했습니다(100nM에서 10nM으로). 따라서 전체 결합 신호가 감소하고 친화도가 높은 바인더만 여전히 검출 및 분류되었습니다(그림 2C).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig2v5.jpg"> 
그림 2: 항원(A1120이 있는 경우 hRBP4)에 결합하기 위한 Fn3 기반 G4 라이브러리의 효모 표면 디스플레이 선택의 대표적인 결과. (A) 효모 라이브러리의 분류를 위한 일반적인 게이팅 전략. 첫 번째 게이트(FSC 대 SSC)는 모든 효모 세포를 선택하고 산란 이벤트를 제외하는 것입니다. 두 번째 게이트(FSC-W의 히스토그램)는 세포 응집체를 제거하고 단일 효모 세포만 선택하는 것을 목표로 합니다. 세 번째 게이트는 표면 표시 수준(HA- 또는 c-myc-태그의 검출) 대 항원에 대한 결합(여기서는 항-His 항체에 의해 검출된 5μM A1120의 존재 하에서 hRBP4)을 플롯합니다. 라이브러리는 항원 결합이 예상되지 않는 2차 항체(항원 없음)로만 추가로 염색되었습니다. 정렬된 셀은 파란색으로 강조 표시됩니다. (B) 3 라운드의 유세포 분석 분류를 통한 G4 라이브러리의 진화. 결합 개체군의 농축은 각 선택 라운드에서 관찰할 수 있습니다. (C) 더 낮은 항원 농도를 사용하면 표적 항원에 대한 친화도가 더 높은 단백질 변이체를 선택할 수 있습니다. 항원 농도(여기서는 hRBP4)가 10배 감소하면 서로 다른 대각선이 나타나며, 이는 친화도가 높거나(정렬된 세포, 파란색) 친화도가 낮은(분류된 세포, 파란색) 클론의 존재를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig2largev5.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

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