Name: Zebra II: 제브라피시의 전기생리학적 신호를 기록하는 새로운 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 학습하세요 Zebra II 시스템을 이용한 제브라피시 장기간 다채널 심전도 기록법. 심장 유전자 연구와 약물 스크리닝에 활용하여 심장 병리학 및 약물 반응을 심층 분석할 수 있습니다.

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우리는 NIH SBIR Phase II #R44OD024874 to H.C. 및 M.P.H.L.의 지원에 감사드립니다. 저자는 또한 Beca CONAHCYT Para Estudios de Doctorado en el Extranjero라는 펠로우십을 통해 멕시코의 Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologias (CONAHCYT)가 제공한 재정적 지원에 감사를 표합니다.

윤리적 지침을 엄격하게 준수하면 실험에 참여한 제브라피시의 복지와 적절한 취급을 보장할 수 있습니다. 모든 실험 활동은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committees)에서 정한 기준에 따라 수행되었습니다. 여기에 자세히 설명된 실험 및 결과는 승인된 프로토콜 AUP-21-066에 따라 IACUC의 승인을 받아 실행되었습니다.
1. 재고 용액의 준비 및 보관
주의: 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 흄 후드에 트리카인 스톡 용액을 준비합니다.
<ol>
	<li>트리카인 분말 400mg을 측정하여 탈이온수(DI) 97.9mL에 용해시킵니다. 자석 교반기를 용기에 넣고 용액을 점차적으로 혼합합니다.</li>
	<li>17mL 미만의 NaOH 용액을 점진적으로 첨가하여 pH를 조정합니다. pH가 6.8.-7.2 범위에 도달할 때까지 NaOH 방울을 계속 추가합니다.</li>
	<li>pH를 조정하고 저장하는 데 필요한 첨가된 NaOH를 고려하여 트리카인 용액의 최종 농도를 결정하고 . 
	참고: 트리카인 용액은 빛에 민감하므로 사용하지 않을 때는 4°C의 호박색 용기에 보관해야 합니다.</li>
	<li>아미오다론 258.13mg을 측정하여 DI 물 1L에 용해시킵니다. 자석 교반기를 용기에 삽입하고 용액이 완전히 용해되고 분말이 제거될 때까지 몇 분 동안 저어줍니다. 사용하지 않을 때는 용액을 4°C의 냉장고에 보관하십시오. 
	알림: Amiodarone은 흄 후드 내부에 준비해야 하며 4°C의 냉장고 내부에 보관해야 합니다. 항상 적절한 PPE를 착용하십시오.</li>
</ol>
2. 양어장
<ol>
	<li>순환 수계에 연결된 개별 수조에 물고기를 보관하고 온도를 28-29°C 사이로 유지하십시오.</li>
	<li>수질을 지속적으로 모니터링하고 14시간/10시간 주야간 주기를 준수합니다.</li>
	<li>40마리의 물고기를 각각 10마리의 물고기로 구성된 4개의 그룹으로 나누고 별도의 수조에 수용합니다.</li>
</ol>
3. 장치 설정
참고: 3.2단계에서 설명한 절차는 장치의 각 챔버에 대해 수행해야 합니다(그림 1). 각 챔버를 다르게 설정할 수 있지만 실험의 일관성을 위해 모든 챔버에서 균일한 설정을 유지하는 것이 좋습니다.
<ol>
	<li>장치를 전원에 연결하고 전면 패널에 있는 빨간색 버튼을 눌러 작동을 시작합니다.</li>
	<li>장치의 터치 스크린을 탐색하여 구성할 챔버를 선택합니다.
	<ol>
		<li>저역 통과 필터 설정을 0.1Hz로 조정하고 고역 통과 필터 설정을 500Hz로 조정합니다. 게인 설정을 10,000으로 조정합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>전면 덮개를 들어 올려 4개의 챔버에 접근합니다. 실험을 시작하기 전에 각 챔버의 스폰지(표준 셀룰로오스 스폰지)를 트리카인 용액에 담근 다음 여분의 액체를 짜냅니다.</li>
	<li>물고기를 소개하기 전에 스폰지에 접근할 수 있는지 확인하기 위해 4전극 어레이를 회전합니다.</li>
</ol>
4. 아미오다론 치료
참고: 어항의 물(어류물)을 사용하여 Amiodarone과 Tricaine의 희석된 용액을 준비합니다. 4.3단계에서 준비한 각 용액에 대해 2.3단계에서 분리한 각 그룹에 대해 4.3 및 4.4 단계를 반복해야 합니다.
<ol>
	<li>아래 설명된 단계에 따라 Amiodarone 원액을 희석하십시오.
	<ol>
		<li>8.75mL의 원액을 41.25mL의 어수에 희석하여 70μM 농도를 얻습니다.</li>
		<li>12.5mL의 원액을 37.5mL의 어류수에 희석하여 100μM 농도를 얻습니다.</li>
		<li>25mL의 원액을 25mL의 어류수에 희석하여 200μM 농도를 얻습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>트리카인 원액 4mL를 어류 물 100mL에 희석하여 트리카인 농도를 0.16mg/mL로 만들어 마취액을 준비</li>합니다.
	<li>준비된 아미오다론 용액에 각 물고기를 개별적으로 5분 동안 담그고 타이머를 사용하여 침수 시간을 정확하게 모니터링합니다.</li>
	<li>마취를 위해 물고기를 트리카인 용액에 2-3분 동안 옮깁니다. 처리가 물고기의 죽음을 초래하지 않는지 확인하십시오. 물고기가 색을 잃거나 아가미의 움직임을 현저히 줄이는 등의 비정상적인 행동을 보이면 즉시 용액에서 제거하고 깨끗한 물고기 물에 다시 넣으십시오.</li>
</ol>
5. 심전도 데이터 수집
참고: 4.4단계를 완료한 후 즉시 다음 지침을 따르십시오. 장치를 밀봉하기 전에 각 챔버에 대해 이 과정을 반복합니다. 챔버는 너비 4-10mm, 길이 25-50mm의 물고기를 수용하도록 설계되었습니다.
<ol>
	<li>트리카인 용액에서 생선을 들어 올려 스펀지 위에 올려 놓고 복부 쪽이 위를 향하도록 합니다.</li>
	<li>전극 어레이를 물고기의 가슴 부위에 마름모 모양으로 배치하여 4개의 서로 다른 지점에서 동시에 ECG 신호를 캡처합니다(그림 2A,B). 모든 핀이 물고기의 피부에 닿도록 각 전극을 조심스럽게 조정하십시오.
	<ol>
		<li>각 전극을 회전하여 물고기의 아래쪽에 닿을 때까지 핀을 내립니다. 핀이 너무 높으면 해당 나비 나사를 시계 방향으로 돌려 물고기에 닿을 때까지 내립니다.</li>
		<li>모든 챔버의 전극에 대해 위에서 설명한 조정을 수행합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>모든 전극 어레이가 작동 챔버의 물고기 위에 올바르게 배치되면 챔버의 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>터치스크린에서 각 챔버를 선택하여 녹화를 표시한 다음 화면에서 녹화 버튼을 클릭하여 녹화를 시작합니다.</li>
	<li>2분 후에 중지 버튼을 클릭한 다음 중지 후 화면에 팝업되는 프롬프트 창에서 저장 버튼을 클릭합니다. 특정 연구 요구 사항에 따라 디스크 또는 클라우드에 정보를 저장합니다.</li>
</ol>
6. 4전극 어레이 포지셔닝 시스템 문제 해결
참고: 때때로 하나 또는 여러 전극이 명확한 ECG 신호를 포착하지 못하여 위치를 변경해야 할 수 있습니다. 필요한 경우 다음 단계를 사용하여 전극 어레이 문제를 해결하십시오.
<ol>
	<li>장치 인터페이스의 중지 버튼을 눌러 녹음 프로세스를 중지하고 신호가 일치하지 않는 채널을 식별합니다.</li>
	<li>전극 챔버에 접근하기 위해 전면 덮개를 들어 올립니다. 어떤 챔버와 특정 전극이 문제를 일으키는지 식별합니다.</li>
	<li>상단 나비 나사를 시계 방향으로 돌려 물고기에 대한 전극의 근접성을 조정합니다. 이 동작은 전극을 물고기에 더 가깝게 낮춥니다.</li>
	<li>필요에 따라 6.3단계를 반복합니다. 단순히 가까이 다가가는 것만으로는 문제가 해결되지 않으면 만족스러운 신호가 나올 때까지 전극을 물고기의 다른 지점으로 돌립니다.</li>
</ol>
7. 데이터 추출 및 분석
참고: 이 백서에 제시된 모든 기본 데이터 분석은 Wavelet 기법21을 사용하여 다양한 유형의 노이즈와 SDNN(Normal Sinus Beats)의 표준 편차를 줄여 1분 세그먼트에서 HR의 박동 간 분산을 계산합니다.
<ol>
	<li>데이터가 디스크 또는 클라우드에 저장되면 분석을 위해 검색하거나 추가 처리를 위해 클라우드 서버로 직접 보낼</li> 수 있습니다.
	<li>화면에서 찾아보기 버튼을 클릭하여 저장된 데이터로 이동하고 사용할 데이터 세트를 선택합니다.</li>
	<li>화면의 옵션에서 추출 버튼을 선택하고 USB 드라이브를 장치 뒷면에 연결하여 데이터를 추출합니다.</li>
	<li>장치 프롬프트에 따라 후속 검색 및 분석을 위해 선택한 데이터 세트를 외장 드라이브에 저장합니다.</li>
</ol>

Zebra II: Advanced ECG System for Multichannel Zebrafish Cardiovascular Studies

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<li>Kouzehgar, K., Eslamian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2+-+Application+of+experimental+data+and+soft+computing+techniques+in+determining+the+outflow+and+breach+characteristics+in+embankments+and+landslide+dams%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+Hydroinfo%22%5BJournal%5D)">Chapter 2 - Application of experimental data and soft computing techniques in determining the outflow and breach characteristics in embankments and landslide dams.</a> Handbook Hydroinfo. 3, 11-31 (2023).</li>
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</ol>

Hung Cao와 Michael Lau는 Sensoriis, Inc.의 창립자입니다. Sensoriis의 시스템 Zebra II는 NIH 지원, SBIR Phase II 보조금 #R44OD024874 하에 개발되었습니다. University of California, Irvine은 이해 상충 정책에 따라 Hung Cao와 Sensoriis, Inc.의 관계를 검토하고 승인했습니다. 다른 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

현재 단계는 우리 팀20에서 수행한 이전 연구의 이 새로운 장치 버전에 따라 수정 및 개선되었습니다. 여기에는 장치의 레이블이 지정된 CAD(Computer-Aided Design)도 포함됩니다.
프로토콜의 문제 해결 가이드에서 강조한 바와 같이 장치는 ECG 신호의 품질에 결정적인 영향을 미치기 때문에 사용자가 부지런하고 정확하게 특정 중요한 단계를 실행해야 합니다. 이전 연구20의 결과와 일치하게, 전극의 위치는 제브라피쉬 샘플에서 고품질의 선명한 ECG 판독값을 얻는 데 중요한 역할을 합니다. 이 방법은 작동 전극의 수를 1개에서 4개로 확장하고 추가 자유도를 도입하기 때문에 최적의 결과를 얻으려면 추가적인 문제 해결 단계와 물고기의 복부 부위에 정교한 전극 배치가 필요합니다.
이 장치의 장점과 새로운 기능은 한 시간 동안의 연구로 제한되는 다단계 실험을 위한 확장된 측정, 여러 제브라피쉬를 통한 높은 처리량 스크리닝(4개의 동시 연구), 고도로 제어 가능한 실험 설정, 샘플당 추가 전기생리학 기록(최대 4개) 및 자동화된 클라우드 기반 분석 및 데이터 저장에 있습니다. 이로부터 우리는 전통적인 방법이 충분한 정보를 수집하기 위해 하나씩 스크리닝과 여러 시험이 필요하기 때문에 해결되고 있는 주요 문제는 제브라피쉬에서 약물 스크리닝 및 심장 연구를 수행하는 데 필요한 시간이라는 점을 강조하고 싶습니다22. 이것은 또한 다중 채널 어레이를 사용하여 미세 전극 어레이(MEA) 또는 유연한 인쇄 회로 기판(FPCB)18 을 사용하는 것과 비교하여 더 간단한 방식으로 ECG를 기록하는 새로운 방법을 제공하며, 언급된 전극의 제조에 추가 단계와 표면 접촉에 의존하지만 덜 침습적인 방식으로 제안된 방법에 비해 물고기에 부착하는 데 필요한 절차가 필요했습니다.
시스템의 한계는 전통적인 방법(19,20)에서 제시된 것과 다르지 않지만 연구에 필요한 기록 시도 횟수를 줄이기 위해 다중 채널 어레이가 사용되기 때문에 덜 집약적입니다. 이러한 제한 사항은 그림 2B에 제시된 제안된 위치 지정을 따르는 것이 좋으므로 전극 위치 지정에 따라 달라집니다. 또한 물고기의 해부학적 차이와 샘플의 전처리(스케일링 제거, 가슴 개방 절차 등)가 테스트의 품질과 성공에 직접적인 영향을 미치기 때문에 사용자가 4개의 채널에서 첫 번째 시도 동안 완벽한 기록을 기대할 수 없다는 점을 분명히 해야 합니다.

심혈관 질환(CVD)은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 2024년 AHA 업데이트 보고서에 따르면 미국에서 매일 약 2,552명이 CVD로 사망하고 있으며, 2017-2018년 CVD의 평균 직간접 비용은 3,780억 달러로 추산되었습니다1. 심방세동(AF)은 미국에서 가장 흔한 심장 부정맥 중 하나입니다.2 및 좋지 않은 예후와 관련이 있으며, CVD 및 비심혈관 질환 시나리오 모두에서 뇌졸중 및 사망 위험을 증가시켜 부정적인 결과의 위험을 증가시킵니다3. 이러한 유형의 부정맥은 심방에서 빠르고 불규칙한 전기 활동으로 구별되며, 이는 일반적으로 빠르고 불규칙한 심실 리듬을 초래합니다4. 또한, 최근 COVID-19의 사건을 감안할 때, COVID-19와 관련하여 부정맥의 출현이 증가했음을 보여주는 연구와 증거의 수가 증가하고 있으며, 대부분 부비동 서맥5. 심방세동과 반대편에 있는 부비동 서맥은 심장 박동이 감소하고 느려지며 심박수가 분당 60회(bpm) 미만입니다. 이 진단을 위해서는 60bpm 미만의 속도로 정상적인 부비동 리듬을 보여주는 심전도(ECG)가 필요합니다.
제브라피쉬인 다니오 레리오는 형태학, 생리학, 유전학 모두에서 인간과의 상동성으로 인해 심혈관 및 약물 개발 연구에 이상적인 모델임이 입증되었습니다.6,7. 인간의 4개 방이 있는 심장에 비해 식별할 수 있는 챔버가 2개뿐임에도 불구하고 제브라피쉬는 유사한 전도 시스템인 유사한 수축 구조를 가지고 있습니다8,9. 따라서 제브라피시 모델은 심장 부정맥을 연구하고 ECG 분석을 통해 관련 유전 경로와 전기생리학적 특성 간의 연관성을 탐색하는 데 적합합니다. 제브라피쉬의 ECG 기록을 위한 센서 설계와 관련하여 기존 바늘 전극이 일반적으로 사용됩니다10. 다른 연구에서는 기록된 데이터의 품질을 평가하기 위해 텅스텐 필라멘트, 스테인리스강 및 은선과 같은 재료를 통합한 다양한 재료11로 만든 다른 유형의 바늘을 설계하여 기존 바늘에 대한 대안을 제시했습니다. 휴대용 ECG 키트와 함께 그들은 연구 및 교육 실험실 모두를 위한 범용 플랫폼을 구축하고자 했습니다.
바늘 시스템은 생물학적 및/또는 약물 유발 효과에 대한 연구를 수행하기 위해 다른 연구에도 배치되었습니다11,12,13,14 생물학적 및/또는 약물 유발 효과에 대한 연구를 수행하여 고무적인 결과를 보여주었습니다. 그러나 최적의 신호를 얻으려면 제브라피쉬의 진피를 통해 바늘을 조심스럽게 삽입해야 했습니다. 이 침습적 절차는 바늘의 날카로움으로 인해 물고기의 심장에 부상을 입힐 수 있으며, 따라서 신호 형태학13이 변경될 수 있습니다. 또한 명확한 ECG 캡처를 보장하기 위해 해를 끼치지 않고 작은 심장에 전극을 정확하게 배치하는 것은 상당한 학습 곡선을 제공합니다. 그 결과, 미세전극배열(MEA) 및 3D 프린팅 센서와 같은 다양한 대체 프로브 시스템이 도입되었습니다. 우리 팀과 다른 연구원 모두 데이터 수집을 위해 MEA를 성공적으로 활용하여 높은 공간 및 시간 해상도와 함께 우수한 신호 대 잡음비(SNR)를 제공하는 데이터를 달성했습니다15,16,17. 예를 들어, 물고기의 심장을 감싸는 MEA를 도입하여 부위별 ECG 신호를 캡처할 수 있습니다15,16. 이와는 대조적으로, 또 다른 팀은 간질 연구를 위해 다중 뇌파(EEG)를 기록하기 위해 폴리이미드 필름으로 제작된 FPCB(Flexible Printed Circuit Board)를 기반으로 다른 종류의 MEA를 개발했습니다18. MEA를 사용하면 수많은 신호를 기록할 수 있지만 전극 채널 수가 제한되어 있기 때문에 한 번에 하나의 물고기만 평가할 수 있는 용량에 의해 제한됩니다. 이러한 제한에 대응하여 최근에는 여러 fish19에서 동시 ECG 기록이 가능한 고급 시스템을 선보였습니다. 이 시스템은 각각 125μm 두께의 폴리이미드로 만들어진 두 개의 전극을 사용하며, 하우징 하단에 골드 스퍼터링 전극이 배치되어 데이터 수집을 용이하게 합니다. 그러나 물 순환 펌프가 포함됨에 따라 잡음이 발생하여 ECG 신호의 신호 대 잡음비(SNR) 품질에 영향을 미쳤습니다. 또한 컴퓨터에 유선으로 연결해야 하는 부피가 크고 값비싼 데이터 수집 도구를 사용해야 했습니다. 시중에 나와 있는 iWORX와 같은 시스템은 소형 앰프를 통해 향상된 휴대성을 제공하지만, 해결되지 않은 문제에 직면해 있습니다: (i) 급성 약물 효과와 같은 더 긴 시간이 필요한 실험에 비해 녹음 시간이 너무 짧습니다(3-5분). (ii) 동물에게 스트레스를 주고 선천성 심장 전기생리학적 데이터를 왜곡할 수 있는 마취 요구 사항; (iii) 수동적이고 순차적인 측정은 많은 수의 물고기를 대상으로 한 연구를 방해합니다. (iv) 오프라인의 노동 집약적인 ECG 데이터 처리의 필요성. 중요한 것은 돌연변이 표현형을 분석하기 위해 마이크로일렉트로닉스를 통합한 고처리량 시스템이 아직 등장하지 않았다는 것입니다. 따라서 확장된 ECG 기록을 가능하게 하는 고처리량 시스템을 만드는 것은 부정맥 표현형과 돌연변이 유전자형 간의 연관성을 밝히고, 단일 돌연변이 유전자형과 관련된 여러 부정맥 표현형을 식별하고, 제브라피시 모델을 사용하여 심장 약물의 효과를 테스트하는 데 매우 중요합니다. 그 결과, 2022년에 Zebra II 시스템의 획기적인 프로토타입을 출시했습니다. 이 새로운 시스템은 한 번에 여러 물고기의 확장된 ECG 기록을 수행할 수 있습니다. 이를 위해 무선 데이터 전송을 위해 사물 인터넷(IoT) 기술을 활용하고 모바일 애플리케이션을 통한 데이터 분석을 가능하게 하는 사내 전자 시스템이 구축되었습니다. IoT 기술이 포함됨에 따라 시스템의 유연성과 휴대성이 향상되었을 뿐만 아니라 제브라피시 모델 연구를 위한 원격 협업이 촉진되었습니다. 이전 연구에서 우리는 광범위한 테스트를 통해 시스템의 효능을 검증했으며, 1) 4마리의 물고기에서 동시에 ECG 데이터를 획득하는 능력을 보여주었습니다. 2) 최대 1시간 동안 연속 ECG 기록을 수행하며, 이는 몇 분만 캡처하는 기존 시스템의 용량을 크게 초과합니다. 3) 50% 감소된 농도의 트리카인을 사용하여 마취의 혼란스러운 영향을 최소화합니다. 또한, 이 시스템은 통제된 실험 조건에서 Tg(SCN5A-D1275N) 돌연변이 및 야생형 어류 모두에서 나트륨 유도 동방방(SA) 차단, 온도 유도 심박수 변화 및 약물 유발 부정맥과 관련된 것과 같은 다양한 실험에서 긴 ECG 기록에 대한 강력한 기능을 보여주었습니다. 확장된 ECG 기록을 위해 시스템이 여러 전극 채널을 채택하면 무작위 대조 시험을 실행할 수 있으므로 실험 그룹당 두 마리의 물고기를 동일한 조건에서 연구할 수 있습니다20. 이 백서에서는 4점 전극을 특징으로 하는 업그레이드된 버전의 시스템을 소개합니다. 이 향상된 기능을 통해 사용자는 물고기의 다양한 위치에서 ECG 판독값을 캡처할 수 있으므로 저품질 ECG 신호를 얻을 가능성을 크게 줄일 수 있습니다. 또한 이 반복은 이전 연구19에서 설명한 대부분의 기능을 기반으로 하고 개선합니다. 이 진화된 ECG 시스템은 기존의 한계를 해결하는 데 큰 가능성을 보여주며, 이를 통해 부정맥 표현형 분석과 제브라피시의 약물 스크리닝을 실질적으로 촉진할 수 있습니다. 4점 전극의 혁신적인 추가는 야생형 제브라피시의 약물 유발 부정맥에 대한 간단한 연구를 통해 엄격하게 테스트되어 그 효과를 더욱 입증했습니다.

<table><tbody><tr><td>아미오다론 하이드로클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>PHR1164-1G</td><td>아미오다론 분말</td></tr><tr><td>벤치탑 pH/mV 미터</td><td>Sper Scientific</td><td>10500308</td><td></td></tr><tr><td>에틸3-아미노벤조에이트, 메탄설폰산 염, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC118002500</td><td>트리카인 분말</td></tr><tr><td>Isotemp 핫 플레이트 교반기</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88854200</td><td></td></tr><tr><td>Zebra II 시스템</td><td>Sensoriis</td><td>N/A</td><td>상업용 제브라피쉬 ECG 기록 시스템</td></tr><tr><td>제브라피쉬 ECG 시스템</td><td>iWorx</td><td>ZS-200</td><td>상업용 제브라피쉬 ECG 기록 시스템</td></tr></tbody></table>

zebra ii: 제브라피시의 전기생리학적 신호를 기록하는 새로운 시스템

Zebra II as A Novel System to Record Electrophysiological Signals in Zebrafish

제브라피시와 그들의 돌연변이 계통은 생물 의학 조사, 심혈관 연구 및 약물 검사에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 현재 연구에서는 새로운 시스템인 Zebra II의 상용 버전이 제시됩니다. 이 프로토콜은 제어 가능한 작업 환경 내에서 여러 제브라피시로부터 심전도(ECG) 수집 및 분석을 보여줍니다. 이 장치는 외부의 독립적인 관류 시스템, 4점 전극, 온도 센서 및 임베디드 전자 시스템으로 구성됩니다. 이전 연구에서 장치 프로토타입은 여러 테스트를 통해 확립된 iWORX 시스템에 대한 검증을 거쳐 약물 개입에 대한 유사한 데이터 품질 및 ECG 반응을 입증했습니다. 그 후, 이 연구는 마취제와 온도 변화가 제브라피시 ECG에 미치는 영향을 조사하는 데 집중하여 즉각적인 데이터 평가가 필요했습니다. 마취제와 약물을 지속적으로 전달할 수 있는 장치의 용량 덕분에 ECG 데이터 수집을 최대 1시간까지 연장할 수 있었는데, 이는 현재 시스템에서 지원하는 5분 시간보다 현저히 긴 시간입니다. 이 백서에서는 4마리의 제브라피시 데이터를 활용하는 선구적인 클라우드 기반 자동 분석을 소개하여 조합 실험을 수행하고 시간과 노력을 크게 줄일 수 있는 효율적인 방법을 제공합니다. 이 시스템은 ECG를 포착하고 분석하는 데 효과적인 것으로 입증되었으며, 특히 야생형 제브라피시에서 약물 유발 부정맥을 감지하는 데 효과적임이 입증되었습니다. 또한 여러 채널에서 데이터를 수집할 수 있는 기능을 통해 제브라피시 모델을 사용한 무작위 대조 시험을 쉽게 실행할 수 있었습니다. 개발된 ECG 시스템은 기존의 한계를 극복하여 제브라피시와 관련된 약물 발견 및 심혈관 연구를 크게 촉진할 수 있는 잠재력을 보여줍니다.

여러 마리의 물고기로부터 심전도(ECG) 신호를 동시에 기록할 수 있는 능력은 이 장치의 중요한 차별점으로, 제브라피시나 다른 유사 종을 대상으로 하는 약물 또는 심장 연구에 소요되는 시간을 크게 단축하는 상당한 이점을 제공합니다(그림 1). 물고기 간의 해부학적 차이, 특히 전극 배치와 관련하여 정확한 ECG 신호를 기록하는 것은 까다로울 수 있습니다. 전통적으로 명확한 ECG 신호를 얻으려면 기계적 박동이나 움직임 아티팩트의 포착을 피하기 위해 능동 전극을 심장 위에 배치하고, 기준 전극은 하복부 쪽으로 배치해야 합니다. 하지만 심장이 조직 깊숙이 위치하거나 물고기의 표면이 고르지 않아 심장의 정확한 위치를 찾는 것이 어려울 수 있습니다. 때로는 정확한 배치를 위해 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 전극을 조작해야 하며, 양질의 신호를 포착하기까지 여러 번의 시도가 필요할 수 있습니다.
이러한 과제를 극복하기 위해, 본 시스템은 기존의 단일 작동 전극 대신 4개의 전극 구성을 사용하는 혁신적인 접근 방식을 도입했습니다. 각 전극은 독립적으로 작동하여 상하(heave), 전후 기울기(pitch), 수직축 중심 회전(roll)의 3차원 조정이 가능합니다. 이러한 유연성은 다양한 형태의 어류를 다룰 때 특히 유용하며, 최적의 ECG 신호를 획득하거나 어류의 접촉 지점에 따라 ECG 측정값이 어떻게 변하는지 탐색하기 위해 전극을 정밀하게 배치할 수 있게 해줍니다.
이 기능은 심장 및 약물 연구의 효율성을 높일 뿐만 아니라, ECG 및 ECG 기록 기술의 가능성을 확장합니다. 이러한 방법들은 아직 표준화되지 않았으며 실험 대상의 특정 조건에 맞게 맞춤화되는 경우가 많다는 점을 고려할 때, 이 장치는 더욱 유연하고 신뢰할 수 있는 데이터 수집 방법을 제공함으로써 연구의 새로운 방향을 제시합니다(그림 2).
이 시스템의 특징 중 하나는 네 마리의 개별 물고기에서 최대 네 가지의 서로 다른 약물을 동시에 평가하거나, 네 마리의 서로 다른 물고기에서 단일 약물의 최대 네 가지 서로 다른 용량 효과를 조사할 수 있다는 점입니다. 실험 설정은 짧은 급성 노출부터 1 h에 이르는 더 긴 세션까지 가능하며, 가변적인 약물 용량이나 온도 및 마취와 같은 환경 조건의 변화를 포함할 수 있습니다. 본 연구에서는 방법의 효능을 입증하기 위해 짧은 실험을 수행하였으며, 특히 4-전극 어레이의 기능을 강조하였습니다. 본 연구진은 이 장치의 첫 번째 프로토타입을 사용한 이전 연구20와 유사하게, 제브라피쉬에서 서맥을 유도하고 QT 간격을 연장하는 것으로 알려진 class-III 항부정맥제인 Amiodarone의 세 가지 서로 다른 용량을 5 min의 노출 기간 동안 테스트하였습니다.
이전 연구 결과와 일치하게, 물고기는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 QTc 간격의 연장과 심박수 감소를 모두 나타냈습니다. 1시간까지 지속되는 많은 유사 연구들보다 노출 시간이 짧았음에도 불구하고, ECG 신호와 심장 파라미터에서 유의미한 변화를 관찰할 수 있었습니다(그림 3).
Amiodarone 처리가 어떻게 ECG에서 관찰 가능한 변화를 유도하였으며, 이러한 변화가 용량 증가에 따라 어떻게 심화되었는지가 Figure 3A,B에 예시되어 있습니다. 특히, QTc 간격은 330 ms의 QTc 간격을 보인 대조군과 비교하여 용량이 단계적으로 증가함에 따라 연장되었습니다. 처리군들의 경우, QTc 간격은 Amiodarone 70 µM에서 365 ms, 100 µM에서 480 ms, 200 µM에서 546 ms로 측정되었습니다. 이에 상응하여, 다양한 Amiodarone 용량과 QTc 간격의 연장에 반응하여 심박수의 현저한 감소가 관찰되었습니다. 심박수는 대조군의 평균 120 ±5 BPM에서 Amiodarone 70 µM일 때 105 ±10 BPM, 100 µM일 때 90 ± 5 BPM, 200 µM일 때 84 ±5 BPM으로 유의미하게 감소하였습니다 (Figure 3C,D).
이러한 결과에 기반하여, 하나의 작업 전극과 하나의 기준 전극을 사용하는 2-전극 방식을 채택한 본 연구에서 새로 제안한 기술이 이전 연구17,18와 비교하여 대등한 품질을 보임을 확인할 수 있었습니다. 저희는 4개의 작업 전극으로부터 성공적으로 데이터를 수집하였으며, 그중 분석에 최적화된 전극을 선택하여 기대되는 심장 파라미터를 보고하였습니다. 선택 기준은 이전 방법들의 기준과 일치하며, 특히 ECG 신호에서 PQRST 복합파가 명확하게 시각화되고 기저선 노이즈가 낮아야 함을 강조하였습니다. 이를 통해 QT 및 QTc 간격을 계산하고 명확한 차이를 식별할 수 있었습니다. 또한, 본 방법론은 현재 장치 개발에 참여하지 않은 저희 연구팀의 추가 연구원 3명에 의한 테스트를 통해 추가 검증을 거쳤습니다. 이들은 먼저 설계자가 제안한 예비 방법론을 구현한 후, 피드백을 바탕으로 수정 사항을 제안하였으며, 이를 통해 현재 제시된 접근 방식의 개선이 이루어졌습니다. 이러한 반복적인 개선 과정은 외부 연구원의 통찰력을 활용하여 장치를 더욱 사용자 친화적으로 만들고 향후 응용 분야에서 효과적으로 사용할 수 있도록 하는 데 결정적인 역할을 하였습니다.
약물 반응에 관한 이 짧은 연구는 서로 다른 조건에 있는 4마리의 서로 다른 물고기에서 ECG를 동시에 기록할 뿐만 아니라, 물고기 한 마리당 여러 개(4개)의 ECG 신호를 캡처하는 장치의 능력을 강조합니다. 이러한 다각적 기능은 전극 배치에 필요한 시간과 노력을 크게 줄여주며, 선택 가능한 신호를 제공함으로써 인적 오류의 가능성을 최소화합니다. 이러한 선택을 통해 연구 목적에 따라 가장 정확한 신호를 선택하거나 여러 신호의 데이터를 통합할 수 있습니다. 하지만 4전극 설정을 사용한다고 해서 4개의 신호가 모두 깨끗하고 고품질임을 자동으로 보장하는 것은 아니라는 점을 분명히 하는 것이 중요합니다. 이 혁신적인 기능을 도입한 주요 목적은 순차적 기록 대신 4개의 동시 기록을 가능하게 하여 인적 오류를 줄이고 시간을 절약하는 것이며, 이는 물고기가 물 밖에서 견딜 수 있는 시간과 마취 상태에서의 내성이 제한적이라는 점을 고려할 때 시간 효율적이고 물고기의 스트레스를 덜어주는 방식입니다.
<img alt="Zebra II 시스템, 4-전극 홀더 및 다중 전극 어레이가 포함된 전기생리학 설정도." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67066/67066fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 1"> 
그림 1: Zebra II 시스템. (A) 구성 요소가 표시된 Zebra II 장치의 등각 투영도 (SolidWorks 모델). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67066/67066fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="물고기 심장 모니터링을 위한 다전극 ECG 설정 도식 및 결과; 채널 1-4 데이터 표시." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67066/67066fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 2"> 
그림 2: 제브라피쉬의 전극 배치. (A) 4점 전극 홀더의 자유도 (개념도). (B) 물고기 가슴 부위의 전극 배치. (C) 4점 전극 홀더에서 얻은 ECG 신호 (채널 1-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67066/67066fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="심전도 분석, QTc 간격, 아미오다론 투여 하의 ECG 분석, 심박수 차트." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67066/67066fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 3"> 
그림 3: 급성 아미오다론 노출의 효과 (ECG 신호). (A) 시스템에서 얻은 대표적인 ECG 데이터 및 아미오다론 농도 차이에 따른 ECG 파라미터의 변화. (B) 아미오다론 노출에 따른 ECG의 변화. (C) HR의 차이를 나타내는 막대 그래프. (D) 서로 다른 아미오다론 농도의 ECG 데이터에서 QTc 간격의 차이를 나타내는 막대 그래프. *p&lt;0.05 (Tukey 테스트를 이용한 일원 분산 분석). 오차 막대는 표준 편차를 나타냄. 이 그림은 20에서 수정됨. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67066/67066fig03large.jpg" target="_blank">여기 를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.</a>

이 연구에서는 제브라피시의 장시간 ECG 수집 및 분석을 위한 고급 시스템인 Zebra II를 소개합니다. 이 시스템은 통제된 환경에서 여러 물고기를 처리하기 위한 독립적인 관류 시스템과 다중 지점 전극을 갖추고 있습니다. Amiodarone의 급성 효과는 야생형 제브라피시로 평가 및 분석되었습니다.

Zebra II: 제브라피시의 전기생리학적 신호를 기록하는 새로운 시스템

Zebrafish and their mutant lines have been extensively used in biomedical investigations, cardiovascular studies, and drug screening. In the current ...

UC Irvine의 연구 그룹은 제브라피시에서 더 나은 성능과 더 긴 기간으로 전기생리학적 평가를 제공하는 새로운 도구를 개발합니다. 당사의 시스템은 제브라피시를 사용하여 심장 유전자를 연구하고 약물 스크리를 수행하는 데 사용되었습니다. 현재 전기생리학적 제브라피시 실험의 과제는 5분 미만의 짧은 녹음 시간에 의존하고 있습니다.이렇게 하면 실험 기간이 연장되어 표본 크기가 제한되고 실험 길이에 영향을 줍니다. 당사의 기술을 사용하면 다중 채널 ECG를 최대 한 시간까지 기록할 수 있으며 EEG로 확장할 수 있는 반면 다른 기술은 5분에 한 채널로 제한됩니다. 글쎄요, 제 생각에는 제브라피시 심장 광학 데이터를 활용하여 심전도와 상관 관계를 파악하여 심장 병리학과 발달 이상을 연구하는 방법, 특히 전임상 약물 개발의 맥락에서 연구하는 방법이라고 생각합니다.인공 지능과 함께 광학, 전기, 화학 감지 분야에서 개발한 전문 지식을 활용하여 제브라피시를 비용 효율적인 동물 모델로 사용하여 심혈관 의학, 신경학, 신경 심리학 및 통증 의학의 전임상 단계에서 약물을 개발하는 방법을 생각합니다. 시작하려면 40마리의 물고기를 4개의 그룹으로 균등하게 나누고 별도의 수조에 수용합니다. Zebra2 장치를 전원에 연결하고 전면 패널에 있는 빨간색 버튼으로 작업을 시작합니다.장치의 터치 스크린을 탐색하여 구성할 챔버를 선택합니다. 저역 통과 필터 설정을 0.1헤르츠로 조정하고 고역 통과 필터 설정을 500헤르츠로 조정하고 게인을 10, 000으로 설정합니다. 실험을 시작하기 전에 앞쪽 뚜껑을 들어올려 네 개의 챔버에 접근한다.각 챔버의 스펀지를 트리카인 용액에 담그고 여분의 액체를 짜냅니다. 물고기를 소개하기 전에 스폰지에 접근할 수 있는지 확인하기 위해 4전극 어레이를 회전합니다. 치료를 위해 258.13mg의 아미오다론을 탈이온수 1리터에 녹입니다.자석 교반기를 용기에 삽입하고 용액이 완전히 용해되어 투명해질 때까지 저어줍니다. 아미오다론 원액을 희석하여 어류에서 70, 100 및 200 마이크로몰 작업 용액을 준비합니다. 물고기를 각각의 아미오다론 용액에 정확히 5분 동안 개별적으로 담그십시오.먼저 적절한 농도의 아미오다론으로 물고기를 치료하십시오. 물고기를 마취한 후 배쪽이 위로 향하게 하여 스펀지 위에 놓습니다. 사전 설정된 전극 어레이를 물고기의 가슴 부위에 마름모 모양으로 배치하여 4개의 서로 다른 지점에서 동시에 신호를 캡처합니다.그런 다음 각 전극을 회전하여 물고기의 아래쪽에 닿을 때까지 핀을 내립니다. 핀이 너무 높으면 해당 나비 나사를 시계 방향으로 돌려 물고기에 닿을 때까지 내립니다. 모든 전극 어레이가 작동 챔버의 물고기 위에 올바르게 배치되면 챔버 덮개를 닫습니다.각 챔버를 녹음하도록 표시하려면 터치 스크린에서 챔버를 선택한 다음 화면의 녹음 버튼으로 녹음을 시작합니다. 2분 후 Stop(중지) 버튼을 클릭한 다음 팝업되는 프롬프트 창에서 Save(저장)를 클릭합니다. 특정 연구 요구 사항에 따라 정보를 디스크 또는 클라우드에 저장하십시오.시작하려면 아미오다론이 처리된 물고기의 심전도 또는 ECG 획득을 시작합니다. 문제 해결을 위해 장치 인터페이스의 중지 버튼을 눌러 녹음 프로세스를 중지하고 신호가 일치하지 않는 채널을 식별합니다. 전면 덮개를 들어 올려 전극 챔버에 접근하고 챔버와 문제를 일으키는 특정 전극을 식별합니다.상단 나비 나사를 시계 방향으로 돌려 전극과 물고기의 근접성을 조정하고 전극을 물고기에 더 가깝게 내립니다. 단순히 가까이 다가가는 것만으로는 문제가 해결되지 않으면 만족스러운 신호가 나올 때까지 전극을 물고기의 다른 지점으로 돌립니다. 대조군은 분당 약 120회의 일관된 심박수와 330밀리초의 QTc 간격을 보여 정상적인 ECG 패턴을 보였습니다.아미오다론 치료는 QTc 간격의 용량 의존적 증가를 가져왔는데, 70마이크로몰에서 365밀리초에서 200마이크로몰에서 546밀리초로 확장되었으며, 그에 따라 심박수는 70마이크로몰에서 분당 약 105회에서 200마이크로몰에서 분당 84회로 감소했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

여기서, 우리는 DEPDC5 유전자의 일시적인 억제로 인한 간질의 제브라피시 모델의 개발 및 특성화를 위한 프로토콜을 제시한다.

간질의 제브라피시 모델의 행동 및 생리학적 분석

여기, 선물이 애벌레 zebrafish에서 빛 갖는 electroretinogram 응답의 측정을 간소화 하는 프로토콜. 소설 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극에 electroretinogram를 사용 하 여 신뢰할 수 있는 결과 낮은 비용으로 달성 하기 쉽게 하는 애벌레 zebrafish에 시각적 개발의 연구를 만들기 위해 도울 수 있다.

스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

여기에서, 우리는 살아있는 마취된 성숙한 얼룩말어에 있는 심전도를 기록하고 해석하는 믿을 수 있고, 최소침습, 비용 효과적인 방법을 제시합니다.

성인 얼룩말 피시를위한 생체 내 표면 심전도

학습하세요 Zebra II 시스템을 이용한 제브라피시 장기간 다채널 심전도 기록법. 심장 유전자 연구와 약물 스크리닝에 활용하여 심장 병리학 및 약물 반응을 심층 분석할 수 있습니다.

Zebra II: 제브라피시의 전기생리학적 신호를 기록하는 새로운 시스템

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