Name: 일차 T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 학습하세요 형광 현미경을 이용한 일차 T 세포의 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징 방법을 통해 면역 세포 내 칼슘 신호 전달 경로를 연구하고 적응 면역 반응의 분자 메커니즘을 규명하는 기술을 습득하세요.

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<meta charset="utf8"></head><body>T 세포에서 Ca2+ 마이크로도메인을 검출하기 위한 고분해능 이미징 기법

<ol><li>Wolf, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontrunners+of+T+cell+activation%3A+Initial%2C+localized+Ca2%2B+signals+mediated+by+NAADP+and+the+type+1+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Frontrunners of T cell activation: Initial, localized Ca2+ signals mediated by NAADP and the type 1 ryanodine receptor.</a> Sci Signal. 8 (398), 102(2015).</li>
<li>Taguchi, T., Mukai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+signalling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity signalling and membrane trafficking.</a> Curr Opin Cell Biol. 59, 1-7 (2019).</li>
<li>Trebak, M., Kinet, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in T cells.</a> Nat Rev Immunol. 19 (3), 154-169 (2019).</li>
<li>Diercks, B. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1%2C+STIM1%2F2%2C+and+RYR1+shape+subsecond+Ca2%2B+microdomains+upon+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">ORAI1, STIM1/2, and RYR1 shape subsecond Ca2+ microdomains upon T cell activation.</a> Sci Signal. 11, 0358(2018).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks%3A+Elementary+events+underlying+excitation-contraction+coupling+in+heart+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle.</a> Science. 262 (5134), 740-744 (1993).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Kummerow, C., Junker, C., Kruse, K., Rieger, H., Quintana, A., Hoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse+controls+local+and+global+calcium+signals+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse controls local and global calcium signals in T lymphocytes.</a> Immunol Rev. 231 (1), 132-147 (2009).</li>
<li>Brock, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X4+and+P2X7+are+essential+players+in+basal+T+cell+activity+and+Ca2%2B+signaling+milliseconds+after+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">P2X4 and P2X7 are essential players in basal T cell activity and Ca2+ signaling milliseconds after T cell activation.</a> Sci Adv. 8 (5), 9770(2022).</li>
<li>Weiß, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+laminin-1+and+collagen+IV+induces+the+formation+of+Ca2%2B+microdomains+that+sensitize+mouse+T+cells+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Adhesion to laminin-1 and collagen IV induces the formation of Ca2+ microdomains that sensitize mouse T cells for activation.</a> Sci Signal. 16 (790), 9405(2023).</li>
<li>Diercks, B. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B+microdomains+for+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+ microdomains for the adaptive immune response.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1871 (5), 119710(2024).</li>
<li>Woelk, L. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DARTS%3A+an+open-source+Python+pipeline+for+Ca2%2B+microdomain+analysis+in+live+cell+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">DARTS: an open-source Python pipeline for Ca2+ microdomain analysis in live cell imaging data.</a> Front Immunol. 14, 1299435(2024).</li>
<li>Diercks, B. -P., Werner, R., Schetelig, D., Wolf, I. M. A., Guse, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+calcium+imaging+method+for+local+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution calcium imaging method for local calcium signaling.</a> Methods Mol Biol. 1929, 27-39 (2019).</li>
<li>Python. Python. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.python.org/downloads/">https://www.python.org/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Anaconda. Anaconda. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html">https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html</a> (2024).</li>
<li>git. git. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git">https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS">https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS GitHub Repository. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/">https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/</a> (2024).</li>
<li>Oracle. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/">https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Time-Dependent Entropy Deconvolution. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters">https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</a> (2024).</li>
<li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+NADPH+oxidases+DUOX1+and+DUOX2+synthesize+NAADP+and+are+necessary+for+Ca2%2B+signaling+during+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Dual NADPH oxidases DUOX1 and DUOX2 synthesize NAADP and are necessary for Ca2+ signaling during T cell activation.</a> Sci Signal. 14 (709), 3800(2021).</li>
<li>Roggenkamp, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HN1L%2FJPT2%3A+A+signaling+protein+that+connects+NAADP+generation+to+Ca2%2B+microdomain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">HN1L/JPT2: A signaling protein that connects NAADP generation to Ca2+ microdomain formation.</a> Sci Signal. 14 (675), 5647(2021).</li>
<li>Heßling, L. D., Troost-Kind, B., Weiß, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAADP-binding+proteins+-+Linking+NAADP+signaling+to+cancer+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophy.+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">NAADP-binding proteins - Linking NAADP signaling to cancer and immunity.</a> Biochim Biophy. Acta Mol Cell Res. 1870 (7), 119531(2023).</li>
<li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (2), 440-445 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&alpha; -CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; -CD28</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>아나콘다</td><td>아나콘다</td><td>https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기</td><td>Biofil</td><td>CSS-013-070</td><td>70 &micro; m 직경</td></tr><tr><td>백작 자동 세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td>A49865</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>101202</td><td></td></tr><tr><td>DARTS</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s 인산염 완충 식염수</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep CD4+ T 세포 분리 키트</td><td>, 스템셀</td><td>19852</td><td></td></tr>, <tr><td>EasySep 마그네틱 멀티스탠드</td><td>스템셀</td><td>18010</td><td></td></tr>, <tr><td>플루오 4-AM</td><td>인비트로겐</td><td>F14201</td><td></td></tr>, <tr><td>Fura Red-AM</td><td>인비트로겐</td><td>F3020</td><td></td></tr>, <tr><td>Gibco RPMI 1640 배지</td>, <td>Gibco, Thermo Fisher</td><td></td><td></td>11875093</tr><tr><td>Git</td><td>GitHub</td><td>https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</td><td></td></tr><tr><td>이멀젼 오일</td><td>라이카</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>신생아 송아지 세럼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4637</td><td></td></tr><tr><td>Oracle</td><td>Oracle</td><td>https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙타마이신</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>단백질 G 마그네틱 비드</td><td>Merck</td><td>LSKMAGG02</td><td>10 &micro; M 지름</td></tr><tr><td>파이썬</td><td></td><td>파이썬 https://www.python.org/downloads/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 그리스(바실론)</td><td>Bayer</td><td>291-1220</td><td></td></tr><tr><td>Time-Dependent Entropy Deconvolution</td><td>GitHub</td><td>https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>q-biogene</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr></tbody></table>

일차 t 세포에서 초기 ca2+ 마이크로도메인 이미징

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

이 프로토콜에서는 그룹 1,13의 이전 연구를 기반으로 1차 마우스 T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인을 이미지화하고 분석하는 업데이트된 방법을 설명했습니다. 이 접근법은 ORAI1, STIM1 및 STIM2와 같은 CRAC 채널뿐만 아니라 초기 Ca2+ 신호 이벤트에서 RyR1과 같은 세포 내 Ca2+ 방출 채널의 관여를 밝히는 데 중요한 역할을 했습니다4.
이를 위해 비자극 1차 마우스 Orai1-/-, Stim1-/-, Stim2-/-, Ryr1-/-를 이미징하여 자발적인 Ca2+ 마이크로도메인 형성을 조사하고 이를 WT 1차 마우스 T 세포와 비교했습니다. Ca2 + 마이크로 도메인 형성 분석에는 신호 시작 속도, Ca2 + 진폭 및 공초점 평면당 신호 수가 포함되었습니다. 특히, Stim2-/- T 세포를 제외하고, 모든 KO T 세포는 WT 세포에 비해 국소 Ca2+ 신호가 유의하게 감소하고 기저 유리 세포질 Ca2+ 농도가 감소한 것으로 나타났습니다. 이를 통해 Ca2+ 마이크로도메인의 형성이 ORAI1, STIM1 및 RyR14의 상호 작용과 복잡하게 연결되어 있다는 결론을 내렸습니다. 또한, 원형질막에서 자발적인 Ca2+ 마이크로도메인을 성공적으로 식별하고 특성화했습니다. 이러한 Ca2 + 마이크로 도메인은 290 nm ± 12 nm의 Ca2 + 진폭으로 특징 지어졌습니다. Ca2 + 신호에 대해 색상으로 구분 된 접근 방식을 사용하면 셀 전체에서 Ca2 + 마이크로 도메인을 시각화 할 수 있습니다. 그 결과, 밀리초 내에 볼 수 있는 Ca2+ 마이크로도메인의 빠른 시작과 이 방법이 몇 밀리초의 수명으로 Ca2+ 신호를 검출할 수 있는 능력이 더욱 강조되었다4. 이러한 자발적인 Ca2+ 마이크로도메인은 나중에 SOCE뿐만 아니라 FAK/PLC-γ/IP3 신호 캐스케이드10 및 P2X49의 관여를 통해 작용하는 접착 의존성 Ca2+ 마이크로도메인(ADCM)으로 확인되었습니다. 또한, 이 기술은 NAADP 생성 효소21인 이중 산화효소 1 및 2(DUOX1/2)와 새로 발견된 NAADP 결합 단백질23 중 하나인 HN1L/JPT22를 확인하는 데 기본이 되었습니다.
그림 2는 P2x4-/- 및 P2x7-/- 마우스뿐만 아니라 WT의 비드 접촉 시 일차 CD4+ T 세포에서 Ca2+ 마이크로도메인의 대표적인 예를 보여줍니다. 세포에 Ca2+ 염료 Fluo-4 AM 및 Fura Red AM을 로드하고 25ms(40프레임/초)의 획득 속도로 이미징했습니다. T 세포 시냅스 형성을 모방하기 위해 anti-CD3/anti-CD28 코팅 비드로 세포를 자극했습니다. 초기 Ca2+ 마이크로도메인 형성은 DARTS 파이프라인을 사용하여 비드 접촉 1초 전과 최대 15초 후에 분석되었습니다. 비드 접촉 시 WT 세포는 비드 접촉 부위에서 자극 후 첫 번째 초 내에 Ca2+ 마이크로도메인의 빠른 형성을 보여주었습니다(그림 2A). 이러한 Ca2+ 마이크로도메인은 비드 접촉 후 15초 동안 세포 전체로 더욱 확장되었습니다. WT 세포와 대조적으로, P2x4-/- 및 P2x7-/- 세포(그림 2B)는 비드 자극 시 Ca2+ 마이크로도메인 형성이 감소한 것으로 나타났으며, 비드 접촉 전 P2x4-/-a 낮은 기저 수준에 대해서도 감소한 것으로 나타났습니다. 이러한 대표적인 결과는 Brock et al.9가 이전에 발표한 결과와 일치하며, 15초 이상 비드 접촉 직후 WT T 세포에서 Ca2+ 마이크로도메인 형성이 나타나고 P2x4-/- 및 P2x7-/- 세포에서 프레임당 신호가 더 낮다는 것을 나타냅니다. 또한, P2x4-/-셀의 진폭이 크게 감소하여 접착 의존성 Ca2+ 마이크로도메인에서 퓨린성 신호전달의 역할을 더욱 확립했습니다.
또한 이 방법은 1차 인간 CD4+ T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인을 시각화하는 데에도 사용할 수 있습니다(그림 3). 일차 쥐 T 세포와 마찬가지로 초기 Ca2+ 마이크로도메인이 비드 접촉 부위에서 유발됩니다. 그러나, 전체적인 Ca2+ 반응은 쥐 CD4+ T 세포와 비교하여 다른 시간 척도에서 발생하는 것으로 보인다.
수동 방식으로 로컬 Ca2+ 신호를 분석하는 것은 개별 조사자에게 매우 힘들고 주관적이기 때문에 실현 가능하지 않습니다. 따라서 우리는 이전에 MATLAB Simulink에서 로컬 Ca2+ 마이크로도메인을 분석하기 위한 후처리13을 위한 이미지 처리 및 최적화 도구 상자를 사용하여 알고리즘을 개발했습니다.
최근에는 소프트웨어 플랫폼 Python12를 사용하여 고해상도 라이브 셀 이미징에서 Ca2+ 마이크로도메인 분석을 위한 DARTS라는 새로운 오픈 소스 후처리 파이프라인을 개발했습니다. 여기에서 사용자의 선호도에 따라 다양한 디콘볼루션 알고리즘을 선택할 수 있으며, 형태학적 세포 형태 변화를 보상하기 위해 수행된 세포 형상 정규화, 정의된 현미경 및 측정 특정 매개변수(예: 스케일, 프레임 속도, 측정 시간)에 따라 선택할 수 있습니다(그림 4).
Ca2+ 마이크로도메인 분석을 위한 파라미터를 선택하면 각 개별 측정에 대해 두 번째 팝업 창이 열려 비드 접촉을 정의합니다(그림 5). 비드 접촉을 정의하기 위해 사용자는 슬라이더를 사용하여 tiff 파일을 수동으로 스크롤하고 비드 접촉 프레임을 개별적으로 선택할 수 있습니다. 비드 접촉은 비드 접촉 부위(그림 5, 노란색 링과 화살표로 표시된 비드 및 비드 접촉)를 클릭하고 셀을 선택하여 선택합니다. 관심 있는 각 셀에 대해 이 단계를 반복해야 합니다. 마지막으로 자동화된 이미지 후처리가 적용되고 결과 데이터가 요약되어 스프레드시트에 저장됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig01.jpg"> 그림 1: 이미징을 위한 슬라이드 준비 작업 흐름. (A) 두 번째 유리 커버 슬립을 사용하여 슬라이드에 BSA와 PLL을 모두 추가하고 펴 바릅니다. (나,씨) 챔버를 만들려면 실리콘 그리스를 사용하여 고무 O-링을 슬라이드에 붙입니다. 챔버를 적절하게 격리하기 위해 전체 링이 얇은 그리스 층으로 덮여 있는지 확인하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig02.jpg"> 그림 2: 원발성 쥐 야생형(WT)(A), P2x4-/- 또는 P2x7-/-(B) CD4+ T 세포에서 T 세포 수용체 의존성 Ca2+ 마이크로도메인의 대표 세포. CD4+ T 세포는 위에서 설명한 대로 음성으로 분리하고 Fluo-4 AM 및 Fura Red로 로드했습니다. T 세포는 DARTS 파이프라인을 사용하여 분석되었으며, 그 결과 이전에 발표된 결과와 유사한 세포 이미지가 생성되었습니다9. (A) anti-CD3/anti-CD28 코팅 비드로 자극하기 1초 전, 자극 후 최대 15초(스케일 바 5μm) 및 비드 접촉 영역(스케일 바 1μm)에서 0초에서 0.65초까지 확대하는 3D 표면 플롯. (B) 상부 레인: 대표 P2x4-/- 비드 자극 전 1초 및 비드 자극 후 최대 15초의 1차 T 세포. 하단 레인: 대표적인 P2x7-/- 1차 T 세포 비드 자극 1초 전과 후 최대 15초. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig03.jpg"> 그림 3: TCR 자극 후 대표적인 일차 인간 T 세포의 Ca2+ 마이크로도메인. 일차 인간 CD4+ T 세포는 버피 코트에서 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 분리하고 위에서 설명한 대로 Fluo-4 AM 및 Fura Red를 로딩했습니다. 이 그림은 anti-CD3 코팅 비드로 자극하기 1초 전과 자극 후 최대 15초(눈금 막대 5μm)의 원차 인간 T 세포와 비드 접촉 영역(눈금 막대 1μm)에서 6.25초에서 7.5초까지 확대한 3D 표면 플롯을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig04.jpg"> 그림 4: DARTS 그래픽 사용자 인터페이스(GUI). GUI는 네 가지 영역으로 나뉩니다. 입력/출력 영역에서 소스 디렉터리 및 이미지 구성(파일당 두 개의 채널 또는 별도의 채널)과 결과 디렉터리를 포함하여 원시 데이터에 대한 정보를 제공해야 합니다. Properties of Measurement(측정 속성) 영역에서 스케일(픽셀당 미크론), 프레임 속도, 나중에 결정된 시작 지점을 기준으로 한 측정 간격과 같은 모든 관련 정보와 함께 실험을 설명해야 합니다. 다음으로, 후처리 단계, 형상 정규화 및 실제 분석(마이크로도메인 감지 및 다트판 데이터 축적)으로 구성된 처리 파이프라인을 조립할 수 있습니다. 마지막으로 설정을 컴퓨터에 저장하거나 컴퓨터에서 로드할 수 있습니다. 분석이 설정되면 시작 을 클릭하여 계속 진행합니다. 설정에 대한 자세한 내용은 https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/General/Usage.html 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig05.jpg"> 그림 5: 비드 접촉의 수동 정의. 실험 중에 비드가 셀에 추가되면 관심 세포와의 초기 비드 접촉 시간과 접촉 위치를 수동으로 정의해야 합니다. 이것은 슬라이더로 프레임을 스크롤하고 시점 t에서 위치(x,y)를 찾아 수행됩니다. 비드 연락처 정보 필드를 자동으로 채우려면 사용자는 비드 접촉 위치에서 현미경 이미지의 왼쪽 절반을 클릭합니다. 다음으로, 셀을 비드 접촉과 연결하기 위해 사용자는 비드 접촉이 있는 셀 내의 위치를 클릭합니다. ADD bead를 선택하여 정보를 확인해야 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

일차 T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인 이미징

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

imaging-initial-ca2-microdomains-in-primary-t-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

적응 면역은 T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 역동적인 '면역학적 시냅스'에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜은 연구가 부족한 생리학적 APC이자 새로운 유형의 '평면 세포 APC 모델'로서 내피 세포를 조사하는 방법을 설명합니다.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

T 세포 면역학적 시냅스에서 필라멘트 액틴의 유속과 방향성을 조사하기 위해 라이브 셀 초해상도 이미징을 내부 전반사 형광과 결합하고 시공간 이미지 상관 분광법으로 정량화합니다.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

이 문서는 하나 이상의 플라즈마 포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 (GSD) 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 여 세포 막 단백질의 검출에 대 한 프로토콜을 설명. 여기, 우리 토론 혜택과 시각화 및 세포 단백질의 정량화에 대 한 이러한 접근을 사용 하 여 고려 사항.

포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

프로토콜 평면 지질 bilayers를 사용 하 여 시 냅 스 인터페이스를 형성 하는 기본 polyclonal 인간 T 세포의 기능을 연구 하는 기법을 설명 합니다. 우리 림프절과 주변 혈액에서 파생 하는 인간의 기본 T 세포의 차별 시 냅 스 형성 기능을이 기법을 사용 합니다.

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

이 프로토콜의 목표는 살아있는 세포에 있는 표면 수용체 역학을 4 차원으로 가시화하기 위하여 격자 빛 시트 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 여기서CD4+ 원발성 T 세포상에 T 세포 수용체가 도시된다.

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

T 세포 신호 전달의 척도인 칼슘 유입은 T 세포 수용체 자극에 대한 반응을 분석하는 효과적인 방법입니다. Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화하기 위한 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용합니다.

Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석

학습하세요 형광 현미경을 이용한 일차 T 세포의 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징 방법을 통해 면역 세포 내 칼슘 신호 전달 경로를 연구하고 적응 면역 반응의 분자 메커니즘을 규명하는 기술을 습득하세요.

일차 T 세포에서 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징

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