Name: 완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 학습하세요 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석을 사용하여 CMG 헬리케이스의 DNA 상에서의 운동 역학을 정량화하는 방법을. 이 기법은 고단백 농도 문제를 해결하고 진핵세포 DNA 복제 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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저자는 라벨링되지 않은 단백질의 과발현을 위한 효모 균주를 제공한 Anne Early, Lucy Drury 및 Max Douglas와 로딩 팩터 및 DDK를 정제하는 데 도움을 준 N.D. 실험실 구성원인 Anuj Kumar, Katinka Ligthart 및 Julien Gros에게 감사를 표합니다. 저자들은 또한 유용한 과학적 토론을 해준 Kaley McCluskey, Dorian Mikolajczak, Joseph Yeeles, Jacob Lewis, Alessandro Costa, Hasan Yardimci, Taekjip Ha에게 감사를 표한다. DRM은 Boehringer Ingelheim Fonds PhD Fellowship의 자금 지원을 인정합니다.  ND는 Top Grant 714.017.002를 통해 네덜란드 과학 연구 기구(NWO)로부터, Advanced Grant(REPLICHROMA, 보조금 번호 789267)를 통해 European Research Council으로부터 자금을 지원받은 것을 인정합니다.

1. 이중 기능화된 선형 DNA 기질의 합성 및 자성 비드에 결합
<ol><li>desthiobiotin 및 digoxigenin moieties를 가진 DNA 기질의 이중 기능화<ol><li>20 μL의 1x 완충액(50 mM 아세트산 칼륨, 20 mM 트리스 아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트)의 최종 부피에서 37 °C에서 16시간 동안 200 단위의 제한 효소 AflII와 함께 23.6 kb plasmid pGL50-ARS1 (복제의 천연 ARS1 기원 포함, 사내에서 복제 및 요청 시 사용 가능)을 선형화합니다. 100 μg/ml BSA, pH 7.9). 알림: 이 단계는 더 편리한 경우 수율을 줄이지 않고 4시간으로 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>65°C에서 20분 동안 반응을 배양하여 AflII를 비활성화합니다. 생성된 4-뉴클레오티드 TTAA는 200μL 선형화 반응에 60단위의 Klenow Fragment(3' to 5' exo-) 중합효소, 17μL의 10x 완충액(500mM NaCl, 100mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 10mM DTT, pH 7.9), 33μM D-Desthiobiotin-7-dATP, 33μM Digoxigenin-11-dUTP, 33μM dCTP, 33μM dGTP, 및 최종 부피 370μM의 초순수. 37°C에서 30분 동안 반응을 배양합니다. 참고: 이 단계에서 Klenow Fragment는 각 말단에 2개의 D-Desthiobiotin-7-dATP 및 2개의 Digoxigenin-11-dUTP 뉴클레오티드를 통합하여 선형화된 DNA의 양쪽 말단에 있는 돌출부를 무디게 합니다.</li>
		<li>반응에 10mM EDTA를 보충하고 75°C에서 20분 동안 반응을 배양하여 Klenow Fragment를 비활성화합니다. 초순수로 반응 부피를 400μL로 가져옵니다.</li>
		<li>4개의 S-400 스핀 컬럼을 가져와서 최소 30초 동안 소용돌이쳐 수지를 재현탁한 다음 735 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 저장 버퍼를 제거합니다. 컬럼을 옮겨 1.5mL 튜브를 세척합니다.</li>
		<li>즉시 각 컬럼에 100μL의 DNA 용액을 추가하고 735 x g에서 2분 동안 원심분리합니다. DNA는 이제 플로우 스루(flow-through)에 있으며 컬럼은 폐기될 수 있습니다.</li>
		<li>4개 컬럼의 플로우스루를 함께 모으고, 피펫으로 부피를 측정하고, 분광 광도계로 DNA 농도를 측정합니다. 이것은 구슬에 결합된 DNA의 양을 계산하는 데 사용됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이중 기능성 선형 DNA를 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드에 결합<ol><li>Vortex M-280은 30초 동안 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드를 재현탁합니다.</li>
		<li>재현탁 M-280 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드 4mg을 깨끗한 1.5mL 튜브에 옮깁니다. 튜브를 마그네틱 랙에 넣고 비드가 수집될 때까지 1분 동안 기다린 다음 저장 버퍼를 제거합니다.</li>
		<li>1x 버퍼 A (5mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5mM EDTA 및 1M NaCl) 1mL를 비드에 추가하고 5 초 동안 와류하여 재현탁합니다. 비드를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 참고: 모든 완충액은 멸균 여과되어야 합니다. 시간을 절약하기 위해 미리 2x 버퍼 A, 1x 버퍼 B(아래 참조) 및 1x 버퍼 C(아래 참조)를 대량으로 만드십시오. 이 완충액은 마그네틱 비드 제조업체에서 권장하는 완충액이며 -20°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>튜브를 마그네틱 홀더에 넣고 비드가 수집될 때까지 1분 동안 기다린 다음 버퍼 A를 제거합니다.</li>
		<li>피펫팅을 통해 400μL의 2x 버퍼 A에 비드를 재현탁시킨 다음 400μL의 기능화된 DNA 용액을 추가합니다(이렇게 하면 2x 버퍼 A가 비드에 대한 DNA 결합에 최적인 최종 농도인 1x로 희석됨). 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다.</li>
		<li>기능화된 DNA가 비드에 결합할 수 있도록 4°C에서 하룻밤 동안 종단 회전으로 배양합니다.</li>
		<li>마그네틱 랙을 사용하여 상층액을 제거하고(피펫으로 부피를 측정하고 분광 광도계로 결합되지 않은 DNA의 농도를 측정하기 전에 버리지 마십시오) 500μL의 완충액 B(10mM HEPES-KOH pH 7.6, 1mM EDTA 및 1M KOAc)로 비드를 2번 세척하여 비특이적으로 결합되지 않은 DNA를 제거합니다. 제조업체에서 권장하는 저장 버퍼인 500μL의 완충액 C(10mM HEPES-KOH pH 7.6 및 1mM EDTA)로 비드를 2배 세척합니다.<ol><li>비드에 첨가된 DNA의 총량과 상층액에 남아 있는 DNA의 양을 비교하여 자기 비드에 결합된 DNA의 총량을 계산합니다. 수율은 마그네틱 비드 mg당 2.3-2.9mg의 DNA(~150-190fmol) 범위여야 합니다. 더 낮은 수율을 얻으면 사용하기 전에 S400 컬럼이 건조되지 않았는지 확인하십시오. 겔 전기영동을 통해 DNA 무결성을 지속적으로 모니터링하여 초기 플라스미드 DNA 기질이 저하되지 않도록 합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>비드를 300μL의 완충액 C에 재현탁시키고 4°C에서 보관합니다. 흠집을 방지하려면 1mg의 마그네틱 비드를 4회 분취하고 DNA를 2주 이상 보관하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 상관 이중 빔 광학 핀셋 및 컨포칼 현미경을 사용하여 완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하고 정량화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석
<ol><li>자성 비드 결합 DNA(magnetic-bead-bound DNA)에 형광 표지된 CMG의 앙상블 조립 및 활성화(그림 1C). 참고: CMG 조립 및 활성화 반응은 MCM2-7 로딩 및 인산화, CMG 조립 및 활성화의 두 단계로 수행되었습니다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 완충액 교환 단계는 마그네틱 랙의 도움으로 비드가 1분 동안 자석에 의해 수집되도록 한 다음 상층액을 제거함으로써 수행되었습니다. 모든 배양은 형광 단백질의 광표백을 방지하기 위해 뚜껑이 있는 온도 제어 열 블록에서 수행되었습니다. 뚜껑을 사용할 수 없는 경우 튜브를 은박지로 덮어야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 단백질의 정제 및 형광 라벨링은 앞서 설명한 바와 같이 수행되었습니다10,11,28.<ol style="margin-left: 40px;"><li>MCM2-7 로딩 및 인산화<ol><li>DNA 결합 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드 1mg을 취하고 저장 버퍼(버퍼 C)를 제거합니다.</li>
			<li>200μL의 로딩 버퍼(25mM HEPES-KOH pH 7.6, 100mM K 글루타메이트, 10mM MgOAc, 0.02% NP40 대체물, 10% 글리세롤, 2mM DTT, 100μg/mL BSA 및 5mM ATP)로 비드를 세척합니다.</li>
			<li>로딩 버퍼를 제거하고 비드를 75μL의 로딩 버퍼에 재현탁시킵니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다.</li>
			<li>최종 농도 37.5nM의 ORC를 비드 결합 DNA에 추가하고 800rpm 교반으로 30°C에서 5분 동안 반응을 배양합니다.</li>
			<li>최종 농도 50nM에서 Cdc6을 첨가하고 800rpm 교반으로 30°C에서 5분 동안 반응을 배양합니다.</li>
			<li>최종 농도 100nM에서 Mcm2-7/Cdt1(또는 형광 라벨링된 Mcm2-7JF646-Halo-Mcm3/Cdt1)을 첨가하고 800rpm 교반으로 30°C에서 20분 동안 반응을 배양합니다.</li>
			<li>최종 농도 100nM에서 DDK를 첨가하고 800rpm 교반으로 30°C에서 30분 동안 반응을 배양합니다.</li>
			<li>상층액을 제거하고 200μL의 고염 세척(HSW) 완충액(25mM HEPES-KOH pH 7.6, 300mM KCl, 10mM MgOAc, 0.02% NP40 대체물, 10% 글리세롤, 1mM DTT 및 400μg/mL BSA)으로 비드 결합 DNA(현재 인산화된 Mcm2-7 헥사머 포함)를 세척합니다. 피펫팅으로 혼합하여 비드가 완충액에 완전히 재현되고 덩어리가 보이지 않도록 합니다.</li>
			<li>HSW 버퍼를 제거하고 200μL의 CMG 버퍼(25mM HEPES-KOH pH 7.6, 250mM K 글루타메이트, 10mM MgOAc, 0.02% NP40 대체물, 10% 글리세롤, 1mM DTT 및 400μg/mL BSA)로 비드를 한 번 세척합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>형광 표지된 CMG의 조립 및 활성화<ol><li>CMG 완충액을 제거하고 5mM ATP가 보충된 50μL의 CMG 완충액에 DNA 결합 비드를 재현탁시킵니다.</li>
			<li>비드 결합 DNA에 50nM Dpb11, 200nM 진, 30nM Polɛ, 20nM S-CDK, 50nM Cdc45LD555, 30nM Sld3/7, 55nM Sld2 및 10nM Mcm10을 추가합니다. 이 단계에서는 DNA에 추가하기 직전에 하나의 튜브에 있는 모든 단백질을 혼합하고 얼음 위에 놓습니다. 재현탁된 비드 결합 DNA를 단백질 혼합물에 추가합니다. 30°C에서 800rpm 교반으로 15분 동안 반응을 배양합니다.</li>
			<li>200 μL의 HSW 완충액으로 비드를 3번 세척합니다. 200μL의 CMG 완충액으로 비드를 한 번 세척합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>원형 DNA 용리: 마그네틱 비드에서 CMG 복합체(그림 1D)<ol><li>200 μL의 용출 완충액(10 mM 비오틴이 보충된 CMG 완충액)에 CMG 함유 DNA 결합 마그네틱 비드를 재현탁하여 CMG 완충액을 제거하고 DNA:CMG 복합체를 자기 비드에서 용리합니다. 800 rpm 교반으로 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
			<li>튜브를 마그네틱 랙에 놓고 비드를 5분 동안 수집합니다. 침전된 비드를 방해하지 않고 상층액(이제 용리된 DNA:CMG 복합체 포함)을 조심스럽게 수집하여 새 튜브로 옮깁니다.</li>
			<li>용액에 비드가 남아 있지 않도록 하려면(용액에 남아 있는 자성 비드는 분석의 광학 트래핑 부분을 방해할 수 있음) 수집된 상층액을 마그네틱 랙에 다시 넣고 나머지 비드를 5분 더 수집하도록 합니다. 상층액을 조심스럽게 모아 새 튜브로 옮깁니다.</li>
			<li>1400μL의 CMG 완충액을 200μL의 상층액에 추가합니다. 이제 샘플은 단일 분자 이미징을 위한 준비가 되었습니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>상관 이중 빔 광학 핀셋 및 공초점 현미경을 사용한 완전히 재구성된 CMG의 단일 분자 이미징(그림 1E-지). 참고: 분석의 단일 분자 부분은 이중 빔 광학 핀셋과 공초점 현미경 및 미세유체역학을 결합한 상업적 설정에서 수행됩니다45,46 (그림 1E-지), 그러나 집에서 만든 설정으로 수행될 수도 있습니다. 여기에 사용된 상용 설정에는 5개의 입구(각각 채널 1-5라고 함)와 1개의 출구(그림 1E). 아래 단계에서 모든 버튼 및/또는 패널 이름은 이 상용 설정과 함께 제공되는 소프트웨어에 따라 다릅니다.<ol><li>다음과 같이 상용 설정에서 5개의 주입구를 사용합니다. 왼쪽에서 채널 1-3을 주입하고 비드 트래핑(채널 1), DNA-단백질 복합체 결합(채널 2) 및 CMG(채널 3)의 존재 여부를 확인하는 데 사용합니다. 채널 4와 5를 단백질 저장소 및 완충액 교환 위치로 사용합니다. 각 실험 전에 1mg/mL 소 혈청 알부민으로 최소 30분 동안 미세유체 플로우 셀을 부동태화한 다음 초순수에 용해된 0.5% Pluronic F-127을 사용합니다.<ol><li>각 실험에서 각 채널의 콘텐츠가 설명된 것과 같은지 확인합니다(그림 1E). 채널 1: PBS에서 1:50으로 희석된 안티-디곡시게닌 코팅 폴리스티렌 비드(직경 2.06μm); 채널 2 : DNA : 자성 비드에서 용출 된 CMG 복합체; 채널 3: 이미징 완충액(2mM 1,3,5,7 사이클로옥타테트라엔, 2mM 4-니트로벤질알코홀 및 2mM Trolox로 보충된 CMG 완충액); 채널 4 및 5: 25 nM RPA, 10 nM Mcm10 및 5 mM ATP, 5 mM ATPγS 또는 뉴클레오타이드가 없는 이미징 버퍼.</li>
		</ol></li>
		<li>실험하기 전에 소프트웨어의 Power Controls 패널에서 Re-calibrate 버튼을 클릭하여 두 트랩33,46에서 0.3pN/nm의 강성을 달성하도록 트래핑 레이저 출력을 조정합니다. 소프트웨어의 이미지 스캔 패널에서 컨포칼 픽셀 크기를 50 x 50 nm로, 이미지 크기를 160 x 18 픽셀로, 픽셀당 조명 시간을 0.2 ms로, 프레임 속도를 5 s로 설정합니다. 온도 패널에서 온도 제어를 30°C로 설정합니다. 참고: 또한 항력에 의한 DNA의 CMG 해리를 최소화하기 위해 최대 스테이지 속도(채널 간 이동에 사용됨)를 0.2mm/s로 설정하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>주입 포트에서 0.5bar의 일정한 압력으로 모든 용액을 플로우 셀로 흘립니다(소프트웨어의 압력 표시줄 패널에서 설정할 수 있음). 그런 다음 채널 4와 5의 흐름을 끕니다. 처음에 모든 용액을 흘린 후 압력을 0.2bar로 줄입니다.</li>
		<li>각 optical trap에 하나의 bead가 걸릴 때까지 트래핑 레이저를 채널 1로 이동합니다. 방아쇠를 누르는 동안 조이스틱을 움직여 갇힌 구슬을 채널 2로 이동합니다. 그런 다음 트리거를 누르지 않고 조이스틱을 사용하여 오른쪽 비드를 왼쪽 비드 쪽으로 움직이거나 왼쪽 비드에서 멀어지게 하여 DNA 테더가 갇힐 때까지 DNA:CMG 복합체를 피싱합니다(소프트웨어의 FD 뷰어 패널에서 갇힌 DNA47 의 힘-확장 곡선을 모니터링하여 알 수 있음).<ol><li>DNA 테더링의 경우 참조 모델 패널에 DNA 길이와 올바른 온도 값을 입력해야 하며, 이렇게 하면 FD Viewer 패널에 DNA 구조의 이론적으로 확장 가능한 웜 같은 사슬 모델이 자동으로 플롯됩니다. 단일 DNA 분자가 두 개의 비드 사이에 끼어 있는 경우, DNA의 힘 확장 거동은 플롯된 확장 가능한 웜 같은 사슬 모델과 밀접하게 일치해야 합니다. 실험적 힘-확장 곡선을 모니터링하여 이것이 사실인지 확인하면 소프트웨어가 이론적 곡선 위에 자동으로 플롯됩니다. 참고: 이론적 모델과의 편차는 비드 사이에 결합된 여러 DNA 분자의 존재 및/또는 DNA에 결합되어 압축되는 단백질 응집체의 존재를 나타낼 수 있습니다. DNA에서 단백질의 힘 매개 해리를 방지하려면 이 초기 테스트 중에 10pN의 장력을 초과하지 마십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>비드를 채널 3으로 이동하고 모든 채널의 흐름을 즉시 중지합니다. 채널 3에서 단일 프레임 테스트 스캔을 수행하여 대물렌즈에서 측정된 4μW의 출력에서 561nm 레이저로 비추는 CMG의 존재를 확인합니다. Excitation lasers 패널에서 이미징 레이저 출력을 조정합니다. CMG가 있는 경우 그림 1G 및 그림 2A와 같이 2차원 회절 제한 점으로 나타납니다.<ol><li>DNA를 포착할 수 없는 경우 채널 2의 흐름을 늦출 수 있는 채널 2에 기포가 있는지 확인합니다(채널 1 및 3에 비해). 기포가 있는 경우 채널 2의 압력을 1bar로 높여 기포를 씻어내십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>CMG가 있는 경우 이미징을 위해 DNA 테더를 채널 4 또는 5로 이동합니다. 그렇지 않으면 흐름을 다시 켜고 비드를 버리고 2.2.4단계로 돌아갑니다.</li>
		<li>채널 4 또는 5에서 비드 사이의 거리를 조정하여 DNA 테더에서 초기 장력 2pN을 달성합니다. 이를 위해 Force Spectroscopy 패널에 2 pN을 입력하고 Enable 버튼을 클릭하여 force clamp를 시작합니다. 초기 장력이 2pN에 도달하면 Force Spectroscopy 패널에서 Enable 버튼을 클릭하여 이미징하기 전에 force clamp를 비활성화합니다.</li>
		<li>대물렌즈에서 측정한 4μW 출력에서 561nm 레이저로 5초마다 CMGCdc45-LD555 를 이미지합니다(그림 1F). 이를 위해 이미지 스캔 패널에서 스캔 시작 버튼을 클릭합니다. 이러한 스캔에서 CMG는 그림 1G의 예와 같이 2차원 회절 제한 점으로 표시됩니다.<ol><li>CMG가 관찰되었지만 표백 전에 움직이지 않는 것 같으면 DNA에 흠집이 생기면 CMG가 DNA41에서 해리되어 겉보기 진행성이 심각하게 감소하므로 뉴클레아제 활성에 사용되는 모든 단백질을 테스트하십시오. 참고: 여기에 사용된 상업용 현미경을 사용하는 경우 4μW의 레이저 출력으로 일관된 결과를 제공해야 합니다. 홈 빌드 설정을 사용하는 경우 최적의 레이저 출력을 경험적으로 추정하는 것이 좋습니다. 최적의 레이저 출력은 형광단에서 원하는 정밀도로 국소화할 수 있는 충분한 신호를 제공해야 하며, 형광단 수명은 원하는 실험 시간 범위에 가까워야 합니다. 참고: 이 간행물은 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석에 초점을 맞추고 있지만, 우리는 이전에 이 분석으로 생성된 데이터 분석에 대한 포괄적인 설명을 발표했습니다48.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

완전히 재구성된 Cdc45/MCM2-7/GIN(CMG)의 모션 이미징

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<li>Coster, G., Frigola, J., Beuron, F., Morris, E. P., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+licensing+requires+ATP+binding+and+hydrolysis+by+the+MCM+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Origin licensing requires ATP binding and hydrolysis by the MCM replicative helicase.</a> Mol Cell. 55 (5), 666-677 (2014).</li>
<li>Coster, G., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+eukaryotic+DNA+replication+is+established+by+quasi-symmetrical+helicase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional eukaryotic DNA replication is established by quasi-symmetrical helicase loading.</a> Science. 357 (6348), 314-318 (2017).</li>
<li>Miller, T. C. R., Locke, J., Greiwe, J. F., Diffley, J. F. X., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+head-to-head+MCM+double-hexamer+formation+revealed+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of head-to-head MCM double-hexamer formation revealed by cryo-EM.</a> Nature. 575 (7784), 704-710 (2019).</li>
<li>Abid Ali, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+licensed+DNA+replication+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a licensed DNA replication origin.</a> Nat Commun. 8 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Sánchez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origins+retain+mobile+licensing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA replication origins retain mobile licensing proteins.</a> Nat Commun. 12 (1), 1908(2021).</li>
<li>Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MCM2-7+helicase+by+association+with+Cdc45+and+GINS+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins.</a> Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).</li>
<li>Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Cdc45%2FMcm2-7%2FGINS+%28CMG%29+complex%2C+a+candidate+for+the+eukaryotic+DNA+replication+fork+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).</li>
<li>Langston, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMG+helicase+and+DNA+polymerase+%CE%B5+form+a+functional+15-subunit+holoenzyme+for+eukaryotic+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">CMG helicase and DNA polymerase ε form a functional 15-subunit holoenzyme for eukaryotic leading-strand DNA replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (43), 15390-15395 (2014).</li>
<li>Sheu, Y. J., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc7-Dbf4+phosphorylates+MCM+proteins+via+a+docking+site-mediated+mechanism+to+promote+S+phase+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc7-Dbf4 phosphorylates MCM proteins via a docking site-mediated mechanism to promote S phase progression.</a> Mol Cell. 24 (1), 101-113 (2006).</li>
<li>Sheu, Y. J., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dbf4-Cdc7+kinase+promotes+S+phase+by+alleviating+an+inhibitory+activity+in+Mcm4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Dbf4-Cdc7 kinase promotes S phase by alleviating an inhibitory activity in Mcm4.</a> Nature. 463 (7277), 113-117 (2010).</li>
<li>Randell, J. C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mec1+is+one+of+multiple+kinases+that+prime+the+Mcm2-7+helicase+for+phosphorylation+by+Cdc7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mec1 is one of multiple kinases that prime the Mcm2-7 helicase for phosphorylation by Cdc7.</a> Mol Cell. 40 (3), 353-363 (2010).</li>
<li>Greiwe, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+for+the+selective+phosphorylation+of+DNA-loaded+MCM+double+hexamers+by+the+Dbf4-dependent+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Str+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism for the selective phosphorylation of DNA-loaded MCM double hexamers by the Dbf4-dependent kinase.</a> Nat Str Mol Biol. 29 (1), 10-20 (2021).</li>
<li>de Jesús-Kim, L., Friedman, L. J., Ramsoomair, C., Gelles, J., Bell, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDK+regulates+replication+initiation+by+controlling+the+multiplicity+of+Cdc45-GINS+binding+to+Mcm2-7%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">DDK regulates replication initiation by controlling the multiplicity of Cdc45-GINS binding to Mcm2-7.</a> eLife. 10, 65471(2021).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+replication+origin+melting+nucleated+by+CMG+helicase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly.</a> Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).</li>
<li>Ramírez Montero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+binding+halts+diffusion+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+during+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nucleotide binding halts diffusion of the eukaryotic replicative helicase during activation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2082(2023).</li>
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<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+visualization+of+Saccharomyces+cerevisiae+leading-strand+synthesis+reveals+dynamic+interaction+between+MTC+and+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule visualization of Saccharomyces cerevisiae leading-strand synthesis reveals dynamic interaction between MTC and the replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), 10630-10635 (2017).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77, 1-9 (2020).</li>
<li>Schauer, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+bypass+of+a+protein-based+R-loop+block+by+Pif1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replisome bypass of a protein-based R-loop block by Pif1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (48), 30354-30361 (2020).</li>
<li>Wasserman, M. R., Schauer, G. D., O'Donnell, M. E., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+activation+is+enabled+by+a+single-stranded+DNA+gate+in+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication fork activation is enabled by a single-stranded DNA gate in CMG helicase.</a> Cell. 178 (3), 600-611 (2019).</li>
<li>Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+DNA+engagement+and+RPA+oppositely+regulate+the+DNA-unwinding+rate+of+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase.</a> Nat Commun. 11 (1), 1-15 (2020).</li>
<li>White, D. S., Smith, M. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+overcoming+the+single-molecule+concentration+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Meas+Sci+Au%22%5BJournal%5D)">Strategies for overcoming the single-molecule concentration barrier.</a> ACS Meas Sci Au. 3 (4), 239-257 (2023).</li>
<li>Liachko, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+genome-wide+map+of+autonomously+replicating+sequences+in+a+naive+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A comprehensive genome-wide map of autonomously replicating sequences in a naive genome.</a> PLoS Genet. 6 (5), 22(2010).</li>
<li>Kapadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+activity+of+replicative+DNA+polymerases+in+the+replisome+of+live+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Processive activity of replicative DNA polymerases in the replisome of live eukaryotic cells.</a> Mol Cell. 80 (1), 114-126 (2020).</li>
<li>Claussin, C., Vazquez, J., Whitehouse, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mapping+of+replisome+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mapping of replisome progression.</a> Mol Cell. 82 (7), 1372-1382 (2022).</li>
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<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CMG+helicase+bypasses+DNA-protein+cross-links+to+facilitate+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair.</a> Cell. 176 (1-2), 167-181 (2019).</li>
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<li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+Uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Anal Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
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저자는 밝힐 것이 없습니다.

중요한 단계 및 중요한 시약 품질 검사 분석의 중요한 단계와 생물학적 시약 품질 검사가 여기에 강조되어 있습니다. 첫째, 단백질 샘플에서 작은 뉴클레아제 오염 물질로 인한 DNA 분해도 데이터에 부정적인 영향을 미치기 때문에 사용되는 단백질의 순도가 중요합니다. 이는 온전한(또는 부분적으로 흠집이 있는) DNA 분자만 이중 빔 광학 핀셋에 갇힐 수 있기 때문입니다. 더 중요한 것은, DNA에 흠집이 생기면 CMG가41을 해리하게 되어 CMG의 장거리 운동 관찰이 복잡해진다는 것이다. 정제된 각 단백질의 뉴클레아제 활성을 테스트하고 시작 플라스미드 기질의 무결성을 지속적으로 모니터링하여 흠집이 최소화되도록 하는 것이 좋습니다. 두 번째 중요한 단계는 DNA:CMG 복합체를 용출한 후 자성 비드를 조심스럽게 제거하는 것입니다. 이 단계에서 상층액 제거는 수집된 비드를 방해하지 않도록 천천히 수행해야 합니다. 광학 핀셋으로 날아간 샘플에 자성 비드가 남아 있으면 광학적으로 포집된 폴리스티렌 비드에 부딪혀 광학 트랩을 빠져나가고 데이터 수집이 복잡해집니다. 마지막으로, DNA:CMG 복합체는 광학 핀셋에서 조심스럽게 다루어야 합니다. 이를 위해 힘을 가하면 DNA에서 CMG가 분리될 수 있으므로 DNA의 장력을 10pN 이상으로 높이지 않는 것이 좋습니다. 또한, 미세유체 플로우 셀의 채널 간 이동은 결과적으로 발생하는 항력으로 인해 DNA에서 CMG가 해리되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 천천히(~ 0.2mm/s) 수행되어야 합니다.
방법의 수정 수정할 수 있는 분석에는 여러 단계가 있습니다. 예를 들어, 용리 수율에 큰 영향을 주지 않고 용출 시간을 60분에서 30분으로 줄일 수 있음을 보여주었습니다. 또한 CMG가 DNA 말단에서 확산되는 것을 방지하고 일반적으로 CMG28을 안정화하기 위해 ATP 또는 ATPγS의 낮은(1mM 미만) 농도로 용리 버퍼를 보충하는 것이 좋습니다. 또한, 여기에서 보고하는 완충액 조성 및 단백질 농도는 이전의 앙상블 생화학 및 단일 분자 작업11,18에서 사용된 것을 기반으로 하지만, 우리가 설명하는 분석은 CMG26,27을 조립하기 위한 다른 프로토콜과 완전히 호환됩니다. 따라서 CMG 조립 또는 활성화의 효율성을 증가시키는 것으로 보고된 모든 생화학적 발전은 수율을 높이기 위해 분석의 벌크 부분에서 구현될 수 있고 구현되어야 합니다. 마지막으로, 프레임 사이의 시간을 늘리면 CMG를 이미징할 수 있는 총 시간이 증가하여 형광단 표백 전에 장거리 CMG 움직임을 쉽게 관찰할 수 있습니다.
방법의 한계 우리가 설명하는 하이브리드 방법은 대량으로 활성화된 CMG만 이미지화할 수 있다는 점에서 제한적입니다. CMG의 활성화를 실시간으로 관찰하려면 추가 작업이 필요합니다. 또 다른 중요한 제한 사항은 CMG가 쌍 17,26,27로 조립될 것으로 예상하지만, 우리가 관찰하는 DNA당 CMG 복합체의 총 수는 대부분 1개(28)이며, 이는 CMG 또는 적어도 Cdc45가 민감한 DNA:CMG 복합체를 처리하는 동안 DNA에서 해리되고 있음을 시사합니다. 단일 분자 이미징 전에 처리 단계 수를 줄이고 미세유체 플로우 셀의 플라스틱 튜브 및 유리에 대한 더 나은 패시베이션 전략을 개발하면 이러한 수율을 높일 수 있습니다.
이 방법의 의의 CMG의 단일 분자 움직임 연구는 지금까지 세포에서 복합체로 정제된 사전 활성화된 CMG를 사용했습니다. 상대적으로 더 간단하지만 이 미리 활성화된 CMG 접근 방식은 CMG 활성화로 이어지는 단계와 CMG 및 의존성 동작의 양방향 특성을 놓친다는 점에서 제한적입니다. 반면에 CMG 어셈블리 및 활성화의 전체 재구성은 모든 사전 활성화 단계를 연구할 수 있을 뿐만 아니라 양방향 방식으로 CMG 동작을 연구할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 접근법은 벌크 생화학 수준에서 단일 분자 수준으로 변환하기가 더 어렵습니다., 훨씬 더 많은 정제된 단백질 요인과 단계를 포함하기 때문입니다. 여기에서 설명하는 분석은 단일 분자 수준에서 완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화할 수 있게 함으로써 이러한 문제를 극복하는 데 도움이 되었으며, 이를 통해 이전에 놓쳤던 일부 사전 활성화 역학28에 액세스할 수 있습니다. 또한 대부분 DNA당 하나의 CMG를 볼 수 있지만 두 개의 CMG 복합체가 반대 방향으로 이동하는 여러 인스턴스를 관찰할 수 있었고 자매 CMG가 서로28에서 처음 분리되는 것을 캡처할 수도 있어 양방향 복제 설정에 대한 몇 가지 통찰력을 제공할 수 있었습니다.
이전 CMG motion과 비교했을 때 이 분석의 또 다른 장점은 우리가 사용하는 DNA 기질의 완전한 이중 가닥 특성에 있습니다(그림 1A). 이전의 사전 활성화된 CMG 작업에서 CMG를 DNA 기질에 결합하는 가장 일반적인 방법은 3' ssDNA 플랩을 통하는 것입니다. 이로 인해 비틀림으로 쉽게 제약될 수 없는 DNA 구조가 생성되며, 따라서 replisome progression에서 supercoiling의 역할에 대한 연구를 금지합니다. 반대로, 여기에서 설명하는 새로운 접근 방식은 사용된 DNA 기질이 완전히 이중 가닥이기 때문에 이 과정에서 토크의 역할을 연구하는 데 적용할 수 있는 잠재력을 가질 수 있습니다.
이 방법의 광범위한 응용 프로그램 설명된 하이브리드 분석은 완전한 진핵생물 replisome의 완전한 재구성을 향한 길을 열어 당사와 다른 사람들이 replisome이 모든 다른 작업에서 성공할 수 있도록 하는 중요한 역학을 관찰하고 정량화할 수 있도록 합니다. DNA 복제는 제쳐두고, 우리가 보고하는 분석은 복잡한 생화학 반응을 벌크 생화학에서 단일 분자 수준으로 변환하는 데 중요한 발전을 나타냅니다. 우리는 이 분석법이 다른 DNA 처리 기계장치에서 연루된 유사한 복잡한 DNA:단백질 상호 작용을 공부하기 위하여 쉽게 수정될 수 있을 것으로 예상합니다.

진핵생물의 DNA 복제는 리플리솜1로 알려진 동적 단백질 복합체에 의해 수행됩니다. 이 복합체의 핵심 구성 요소는 진핵 복제 헬리케이스 Cdc45/MCM2-7/GINS(CMG)로, 복제 포크 1,2의 전면에 앞장서서 레플리솜을 구동하고 중앙에서 조직합니다. 따라서 CMG의 동역학에 대한 심층적인 정량적 이해를 얻는 것은 리플리솜의 동역학을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이러한 이해는 타의 추종을 불허하는 공간 및 시간 해상도로 인해 CMG와 같은 분자 모터를 연구하는 데 특히 적합한 단일 분자 기술을 통해 얻을 수 있으며 기능, 확률 및 역학 2,3,4,5,6,7,8,9에 대한 비할 데 없는 정량적 이해를 제공할 수 있습니다.
생체 내에서 CMG는 복제가 세포 주기 1,10,11당 한 번만 발생하도록 하기 위해 시간적으로 분리된 방식으로 로드되고 활성화됩니다. 첫째, 세포 주기의 G1 단계에서 로딩 인자로 알려진 단백질 세트는 CMG의 첫 번째 구성 요소인 MCM2-7 헥사메릭 복합체를 일대일 구성15,17,18을 가진 이중 헥사머 형태로 dsDNA 12,13,14,15,16에 로드합니다. 효모의 특정 경우, 이 초기 과정은 복제의 기원(origins of replication)1으로 알려진 특정 DNA 염기서열에서 발생한다. Mcm2-7이 복제 헬리카제의 모터 코어이지만, 완전히 활성화된 CMG 11,19,20,21을 생성하기 위해 로드된 MCM2-7에 모집되어야 하는 두 개의 헬리카제 활성화 인자 Cdc45 및 GINS 없이는 그 자체로 DNA 19를 풀 수 없습니다. helicase 활성화 과정은 세포주기의 S 단계에서 발생하며 세포주기 조절 키나아제 DDK 22,23,24에 의한 Mcm2-7 이중 헥사머의 선택적 인산화로 시작됩니다. 이러한 인산화 이벤트는 발화 인자10,11,26으로 알려진 두 번째 단백질 세트에 의해 Cdc45 및 GINS가 MCM2-7 이중 헥사머 10,22,23,24,25,26에 모집되는 것을 용이하게 합니다. Cdc45 및 GINS의 결합은 두 개의 자매 CMG 헬리케이스를 생성하며, 이들은 처음에는 부모 DNA의 두 가닥을 모두 둘러싸고 여전히 일대일 구성(11,27)에 위치합니다. 최종 활성화 단계에서, 발화 인자 MCM10은 각 자매 CMG11로부터 하나의 DNA 가닥의 ATP 가수분해 의존성 압출을 촉매한다. 스트랜드 압출 후, 자매 CMG 헬리케이스는 ATP 가수분해 의존적 방식(11,20,21,28)으로 ssDNA를 따라 전위함으로써 서로 우회 및 분리되고, 비전위 스트랜드(29)를 입체적으로 배제함으로써 DNA를 풀었다. 이 전체 공정은 36개의 정제된 S. cerevisiae 폴리펩티드 10,11의 최소 세트로부터 시험관내에서 완전히 재구성되었습니다.
위에서 설명한 CMG 조립 및 활성화의 정교한 생체 내 조절에도 불구하고, CMG 2,30,31,32,33,34의 시험관 내 재구성 단일 분자 운동 연구는 지금까지 세포20,21에서 복합체로 정제된 사전 활성화된 CMG에 의존해 왔습니다, 활성화 이전의 모든 단계와 동작의 양방향 특성이 누락되었습니다. 이 사전 활성화된 CMG 접근법은 부분적으로 완전히 재구성된 CMG 조립 반응10,11의 생화학적 복잡성으로 인해 단일 분자 분야의 황금 표준이 되었습니다. 이 생화학 반응은 여러 가지 이유로 벌크 생화학 수준에서 단일 분자 수준으로 전환하기가 어려웠습니다. 첫째, 반응 효율을 극대화하기 위해 CMG 조립 및 활성화에 필요한 로딩 및 소성 인자는 10-200 nM10,11,27 범위의 농도에서 필요합니다. 이러한 농도 범위는 대부분의 단일분자 기술이 허용할 수 있는 것의 최고점에 해당하며, 특히 형광으로 표지된 성분(35)을 사용할 때 더욱 그러하다. 마지막으로, CMG는 셀 36,37,38,39에서 수천 개의 염기쌍을 순항하도록 진화했습니다. 따라서 생물학적으로 관련된 공간 규모에서 그 움직임을 연구하려면 긴 DNA 기질(일반적으로 수십 킬로베이스 정도의 길이)이 필요합니다.30,31,34,40,41,42. 이러한 긴 DNA 기질을 사용하는 것은 DNA 기질이 길수록 단백질 및 단백질 응집체에 대한 잠재적인 비특이적 결합 부위가 더 많아진다는 추가적인 문제를 제기합니다. CMG의 경우, 후자의 점이 특히 중요한데, CMG 조립 및 활성화에 관련된 여러 로딩 및 발화 인자는 본질적으로 무질서한 영역(43)을 포함하고 응집되기 쉽기 때문이다.
여기에서는 36개의 정제된 S. cerevisiae 폴리펩티드28에서 조립 및 활성화를 완전히 재구성한 후 CMG의 움직임을 관찰하고 정량화할 수 있는 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석을 보고합니다. 이 분석은 두 개의 직교 부착 부분인 desthiobiotin 및 digoxigenin2 가 있는 DNA 기질의 양쪽 말단의 이중 기능화에 의존합니다(그림 1A). 첫 번째 부분인 데스티오비오틴(desthiobiotin)은 DNA 기질을 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드(44 )에 가역적으로 결합하는 데 사용됩니다(그림 1B). 그런 다음 형광 표지된 CMG를 비드 결합 DNA에 조립하고 활성화하며, 마그네틱 랙을 사용하여 생성된 마그네틱 비드 결합 DNA:CMG 복합체를 정제하고 세척합니다(그림 1C). 그렇게 함으로써, 그렇지 않으면 DNA 기질에 응집될 과잉 단백질이 제거됩니다. 이는 사실상 응집체가 없는 DNA:CMG 복합체를 제공합니다. 그런 다음 원형(intact) 복합체는 데스티오비오틴(desthiobiotin)-스트렙타비딘(streptavidin) 상호작용을 능가할 수 있는 과도한 유리 비오틴(free biotin)을 몰 과도하게 첨가하여 마그네틱 비드에서 용리됩니다(그림 1D). 개별 DNA:CMG 복합체는 항-디곡시제닌 항체(anti-Dig)로 코팅된 두 개의 광학적으로 포획된 폴리스티렌 비드 사이에 결합됩니다. 이 단계에서는 DNA의 두 번째 부분인 디곡시제닌(digoxigenin)이 사용되는데, 이는 유리 비오틴이 과도하게 함유된 완충 용액에서도 anti-Dig에 결합할 수 있기 때문입니다(그림 1E). DNA:CMG 복합체가 광학 트랩에 고정되면 형광 표지된 CMG의 움직임을 컨포칼 스캐닝 레이저로 이미지화합니다(그림 1F). 우리는 이 분석법이 유사하게 복잡한 DNA:단백질 상호 작용의 단일 분자 수준에서 연구에 쉽게 적용할 수 있을 것으로 예상합니다.

<table><tbody><tr><td>아플리II&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0520L</td><td></td></tr><tr><td>안티-디곡시제닌 코팅 폴리스티렌 비즈&nbsp;</td><td>Spheroteck</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>ATP 솔루션</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>ATP&gamma; S</td><td>Roche</td><td>11162306001</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>C-Trap</td><td>Lumicks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>AflII</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Promega</td><td>U122B</td><td></td></tr><tr><td>D-Desthiobiotin-7-dATP</td><td>Jena Bioscience와 함께 제공됨&nbsp;</td><td>NU-835-Desthiobio</td><td></td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>10218014</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-DIGXL</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin magnetic beads</td><td>Invitrogen</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr; 5' 엑소-)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>Microspin S-400 HR 스핀 컬럼&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>GE27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>Klenow Fragment</td></tr><tr><td>Nonidet와 함께 제공됨&nbsp; P 40 대체</td><td>시그마</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>시그마</td><td>P2443</td><td></td></tr></tbody></table>

완전히 재구성된 cmg의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석

Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG

진핵생물은 CMG로 알려진 하나의 복제 헬리카제를 가지고 있으며, 이 헬리카제는 중앙에서 레플리솜을 조직하고 구동하며 복제 포크의 앞쪽에서 앞장섭니다. CMG의 역학에 대한 심층적인 기계론적 이해를 얻는 것은 세포가 세포 주기당 한 번씩 전체 게놈을 효율적이고 정확하게 복제하는 엄청난 작업을 어떻게 달성하는지 설명하는 데 중요합니다. 단일 분자 기술은 비교할 수 없는 시간적, 공간적 해상도로 인해 CMG의 역학을 정량화하는 데 매우 적합합니다. 그럼에도 불구하고, CMG 움직임에 대한 단일 분자 연구는 지금까지 복합체로 세포에서 정제된 미리 형성된 CMG에 의존해 왔으며, 이로 인해 CMG의 활성화에 이르는 단계에 대한 연구가 불가능했습니다. 여기에서는 36개의 서로 다른 정제된 S. cerevisiae 폴리펩타이드로부터 조립 및 활성화를 완전히 재구성한 후 형광 표지된 CMG의 단일 분자 수준에서 움직임의 단일 분자 수준에서 이미징을 가능하게 한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 두 개의 직교 부착 부분이 있는 선형 DNA 기질 말단의 이중 기능화에 의존하며, 단일 분자 수준에서 유사하게 복잡한 DNA 처리 메커니즘을 연구하도록 조정할 수 있습니다.

올바르게 수행될 경우, 여기에 설명된 프로토콜은 사실상 응집체가 없는 DNA:CMG 복합체를 생성해야 합니다. 응집체가 없는 반응은 미세유체 플로우 셀의 채널을 막지 않아야 하며, DNA를 손상시키지 않고 포획된 DNA 분자를 윤곽 길이의 10% 이내로 종단 간 확장으로 늘릴 수 있어야 합니다. 반대로, 반응에 응집이 있는 경우 DNA 분자가 때때로 응집체에 의해 압축될 수 있으며, 늘어나면 종종 DNA 파손을 유발할 수 있습니다. 단백질 응집체를 인식하는 좋은 방법은 DNA의 2D 스캔을 보는 것입니다. 응집체가 없는 반응에서 CMG는 그림 2A에 표시된 스캔과 같이 DNA를 드문드문 밀집하는 불연속적이고 대칭적인 회절 제한 반점으로 나타납니다. 반대로, 응집체는 덜 불연속적이며, 때로는 그림 2B에 표시된 스캔에서와 같이 더 긴 길이의 DNA를 차지하는 비대칭 블롭입니다. 또한 분석이 성공적으로 수행되고 정제된 단백질의 고순도가 달성되면 그림 2C의 카이모그래프에서 볼 수 있듯이 ATP가 있는 상태에서 CMG의 장거리 움직임을 볼 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig01v2.jpg"> 그림 1: 완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하고 정량화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석에 대한 그림 설명. (A) 자연적으로 발생하는 ARS1 복제 기원을 포함하는 23.6kb 선형 DNA는 데스티오비오틴 및 디곡시게닌 부분으로 양쪽 끝에서 이중 기능화됩니다. (B) 이중으로 기능화된 DNA는 데스티오비틴(desthiobiotin) 부분을 통해 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된 자성 비드(magnetic beads)에 결합되어 있습니다. (C) CMG는 과도하게 결합되지 않은 단백질 및 단백질 응집체를 제거하기 위해 다양한 세척 단계를 포함하여 마그네틱 비드 결합 DNA에서 단계적으로 조립 및 활성화됩니다. (D) 원형(intact) DNA: CMG 복합체는 데스티오비오틴(desthiobiotin)-스트렙타비딘(streptavidin) 상호작용을 능가하는 과도한 유리 비오틴(free biotin)을 첨가하여 마그네틱 비드에서 용리됩니다. (E) 개별 DNA: CMG 복합체는 미세유체 플로우 셀의 도움으로 광학적으로 포집된 두 개의 안티 디곡시게닌 코팅된 폴리스티렌 비드 사이에 결합됩니다. Dig-anti-Dig 상호 작용은 비오틴-아비딘 상호 작용과 직교하므로 자유 비오틴의 존재에 영향을 받지 않습니다. (F) 광학 핀셋에 의해 제자리에 고정되면 DNA:CMG 복합체는 다른 완충액 조건으로 전달되며, 여기서 DNA 평면을 컨포칼 스캐닝 레이저로 스캔하여 시간 경과에 따른 DNA를 따라 CMG의 움직임을 이미지화합니다. (G) 상단 패널은 컨포칼 스캐닝 레이저로 스캔하는 두 개의 광학적으로 포집된 디그 방지 코팅 폴리스티렌 비드 사이에 유지된 DNA:CMG 복합체의 다이어그램을 보여줍니다. 하단 패널은 광학 트랩으로 제자리에 고정된 DNA에 결합된 CMG의 2D 스캔 예를 보여줍니다. 이 실험에서 DNA는 표지되지 않았지만 이미지 중앙을 가로지르는 수평선으로 생각할 수 있습니다. 이 수치는28에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig02.jpg"> 그림 2: 성공한 실험과 실패한 실험의 데이터 예. (A) 응집체가 없는 샘플에서 CMG 함유 DNA의 2D 스캔 예. 두 스캔 모두에서 CMG는 DNA를 따라 드문드문 분포된 대칭 및 이산 회절 제한 반점을 보여줍니다. (B) 응집체를 포함하는 샘플에서 CMG 함유 DNA의 2D 스캔 예. 두 스캔 모두에서 CMG는 DNA를 붐비는 덜 대칭적인 얼룩을 형성합니다. (C) ATP가 있는 상태에서 시간 경과에 따른 CMG 회절 제한 지점의 DNA 위치를 보여주는 Kymograph로, CMG 복합체의 장거리 운동을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

당사는 광학 트랩에 고정된 선형 DNA 분자에서 형광 라벨링되고 완전히 재구성된 Cdc45/Mcm2-7/GINS(CMG) 헬리카제의 움직임을 직접 이미지화하고 정량화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석을 보고합니다.

완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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3D 단일 분자 국소화 현미경 검사법은 살아있는 세균 세포에서 형광표지된 단백질의 공간 위치 및 운동 궤적을 조사하는 데 사용됩니다. 본원에 기재된 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 풀화된 단일 분자 궤적에 기초하여 세포성 단백질의 널리 퍼진 확산 거동을 결정한다.

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체외 형광 현미경 검사법 기반 운동성 검사의 Myosin 특이적 적응

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S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

이 프로토콜은 CMG helicase에 의한 DNA 풀림의 실시간 시각화를 위한 단일 분자 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. (1) DNA 기질 준비, (2) 형광 표지된 Drosophila melanogaster CMG helicase를 정제하는 방법, (3) 전반사 형광(TIRF) 현미경 검사를 위한 미세유체 플로우 셀을 준비하는 방법, (4) 단일 분자 DNA 풀기 분석에 대해 설명합니다.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

학습하세요 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석을 사용하여 CMG 헬리케이스의 DNA 상에서의 운동 역학을 정량화하는 방법을. 이 기법은 고단백 농도 문제를 해결하고 진핵세포 DNA 복제 메커니즘 연구에 활용됩니다.

완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석

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