Name: 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 리포터 생물학적 분석을 사용하여 암세포의 항체 의존성, 세포 매개 세포 독성 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: 배우세요 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC) 바이오어세이를 사용하여 암 면역요법 연구에서 치료용 항체의 효능을 신속하고 정확하게 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 하루 만에 결과를 얻을 수 있어 대규모 선별 분석에 유용합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>암 면역 요법을 위한 ADCC 생물학적 검정에서 효과기로서의 갑상선 암 세포

<ol><li>Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity%3A+a+strategy+for+improving+antibody-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antib+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy.</a> Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).</li>
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<li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+fucose+reducing+effects+in+a+humanized+antibody+on+Fcgamma+receptor+binding+and+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+activities%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcgamma receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities.</a> MAbs. 4 (3), 326-340 (2012).</li>
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<li>Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>PBS에서 10x를 희석하여 0.05 % Trypsin</td></tr><tr><td>1x Tris Buffer Saline (TBS)</td> <td>1st BASE</td><td>BUF-3030-1X1L</td><td>웨스턴 블로팅에서 멤브레인 세척</td></tr><tr><td>용 1.5 M Tris Buffer, pH 8.8</td><td>1st BASE</td><td>BUF-1419-1L-pH8.8</td><td>SDS 젤 준비</td></tr><tr><td>용 2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522-100ML</td><td>샘플 준비 웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>30% 아크릴아미드/비스 용액</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610158</td><td>SDS 겔 준비용</td></tr><tr><td>4x Laemmli 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610747</td> 투명하고 평평한 바닥이 있는 웨스턴 블로팅 96웰 백색 폴리스티렌 마이크로플레이트<td>의 샘플 준비용</td></tr><tr><td></td><td>Corning Incorporated</td><td>3610</td><td>ADCC 분석용</td></tr><tr><td>ADCC 생물학적 분석 이펙터 셀(0.65mL)</td><td>Promega</td><td>G7011</td><td>ADCC 리포터 바이오 분석 코어 키트(Promega G7010), 1 x 1 바이알</td></tr><tr><td>ADCC 리포터 바이오 분석 코어 키트</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>이 실험에서 ADCC 분석을 위한 ADCC 바이오 분석 키트로 언급</td></tr> 암<tr><td>모늄 과황산염</td><td>시그마 알드리치</td><td>A3678-25G</td><td>SDS 젤 제제용</td></tr><tr><td>베바시주맙(인간화 항 VEGF-항체)</td><td>MVASI-ADCC</td><td></td> <td>분석</td></tr><tr><td>에서 음성 대조 항체로 사용BHT-101</td><td>라이프니츠 연구소 DSMZ</td><td>ACC279</td><td>인간 역형성 유두 갑상선 암 세포주&nbsp;</td></tr><tr><td>Bio-Glo Luciferase 분석 버퍼</td><td>Promega</td><td>G7941</td><td>ADCC 리포터 바이오 분석 코어 키트(Promega G7010)에 포함, 1 x 10 mL</td></tr><tr><td>Bio-Glo Luciferase 분석 기질(동결건조)</td><td>Promega</td><td>G7941</td><td>ADCC 리포터 바이오 분석 코어 키트(Promega G7010)에 포함, 1 x 1 바이알</td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>GenFollower</td><td>GD00235</td><td>배양 플라스크에서 세포 제거</td></tr><tr><td>Cetuximab(키메라 항-EGFR 항체)</td><td>ERBITUX-ADCC</td><td></td> <td>분석에서 치료 항체로 사용</td></tr><tr><td>화학 발광 HRP 기질</td><td>Merck Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td>웨스턴 블로팅에서 단백질 검출</td></tr><tr><td>증류수</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td>SDS 젤 준비</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>iBright CL1500 이미징 시스템</td><td>Thermo Scientific</td><td>2462621100038</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>L-글루타민의 단백질 검출용, 200mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>저IgG 혈청</td><td>Promega</td><td>G7110</td><td>ADCC 리포터 생물학적 검정 코어 키트(Promega G7010)에 포함, 1 x 4mL</td></tr><tr><td>Megafuge 8R</td><td>Thermo Scientific</td><td>42876589</td><td>원심분리기</td></tr><tr><td>마우스 항-EGFR 단클론 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>610016</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>마우스 항 VEGFR 단클론 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>571194</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>비효소 세포 해리 버퍼</td>의 1 차 항체 <td>Sigma Aldrich</td><td>C5789-100ML</td><td>T75 플라스크에서 세포 수확</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토 마이신</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>항균 배양 배지</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2, 멸균 여과</td><td>1차 염기</td><td>CUS-2048-1x1L</td><td>세포 세척 용액으로 사용</td></tr><tr><td>Pierce BCA 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>단백질 농도 측정</td></tr><tr><td>프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td>웨스턴 블로팅 PVDF를 위한 시료 전처리 시 단백질 분해</td></tr><tr><td> 멤브레인 (Immobilin-P)</td> <td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>토끼 안티 마우스 IgG, Fc &gamma의 단백질 전달; HRP-conjugated secondary antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>315-035-046</td><td>Secondary antibody in western blotting</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 배지</td><td>Capricorn Scientific</td><td>RPMI-XA</td><td>세포 배양 매체</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Promega</td><td>G7080</td><td>ADCC 리포터 생물 검정 코어 키트(Promega G7010), 1 x 36 mL</td></tr><tr><td>탈지 분유</td><td>Merck Millipore</td><td>70166-500G</td><td>웨스턴 블로팅의 멤브레인 차단용</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>1st BASE</td><td>BIO-2050-500g</td><td>SDS 겔 제제</td></tr><tr><td>SW-1736</td><td>Cytion</td><td>300453</td><td>Human thyroid squamous cell cancer cell line</td></tr><tr><td>T75 culture plasks</td><td>SPL Lifesciences</td><td>70075</td><td>Cell culture flask</td></tr><tr><td>Tecan Multimode Reader model Spark 10M</td><td>Tecan</td><td>1607000294</td><td> 광도 정량화</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610801</td><td>SDS 겔 제제용</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega</td><td>H5151</td><td>웨스턴 블로팅의 멤브레인 세척용</td></tr><tr><td>Vi-cell XR 세포 생존율 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>AL15072</td><td>Cell counter</td></tr></tbody></table>

항체 의존성 세포 매개 세포 독성 리포터 생물학적 분석을 사용하여 암세포의 항체 의존성, 세포 매개 세포 독성 평가

Assessing Antibody-dependent, Cell-mediated Cytotoxicity in Cancer Cells using Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Reporter Bioassay

타겟 BHT-101 및 SW-1736 세포에서 EGFR 및 VEGFR의 발현은 웨스턴 블로팅을 사용하여 검출되었습니다. EGFR 발현은 BHT-101 및 SW-1736 세포 모두에서 검출되었지만 VEGFR 발현은 검출되지 않았습니다(그림 3).
ADCC bioassay kit를 사용하여 EGFR 양성 세포주인 BHT-101 및 SW-1736을 타겟 세포로 사용하여 항 EGFR 항체인 cetuximab의 ADCC 반응을 검출했습니다. VEGF 비활성화제인 베바시주맙(Bevacizumab)이 음성 대조 항체로 사용되었습니다. 서로 다른 농도의 항체 및 효과기 세포를 표적 세포와 함께 배양했습니다. 발광 신호는 플레이트 리더를 사용하여 감지되었습니다(그림 2). 세툭시맙(항-EGFR 항체) 그룹에서 ADCC 활성 유도의 더 높은 폴드가 발견되었지만, 두 세포주 모두에 대해 베바시주맙(VEGF 길항제)에서 ADCC 활성은 관찰되지 않았다. 이는 두 세포주 모두에 대해 EGFR 세포외막 항원을 표적으로 하는 ADCC 효과를 입증했습니다. 이 방법을 사용하여 ADCC 반응은 두 개의 역형성 갑상선암 세포주(BHT101 및 SW1736)에서 Cetuximab이 존재할 때 검증되었습니다(그림 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig01.jpg"> 
그림 1: ADCC 생물 검정 키트를 사용한 ADCC 반응을 보여주는 개략도. 치료용 항체의 항원 결합 부위는 표적 세포의 표면 항원에 결합합니다. 이 결합은 항체의 Fc 부분이 NFAT-RE luc로 유전적으로 조작된 이펙터 세포의 FcƳRIIIa 수용체에 결합하여 이펙터 세포에서 발광 신호를 생성하도록 합니다. 이 그림은 ADCC Reporter Bioassay Core kit 설명서에서 permission12에 따라 수정되었습니다. 약어: ADCC = 항체 의존성 세포 매개 세포 독성; Fc = 단편 결정화 영역; NFAT = 활성화된 T 세포의 핵 인자; RE = 응답 요소; luc = 루시퍼라아제. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig02.jpg"> 
그림 2: ADCC 공동 배양 시스템의 96웰 플레이트 설계에 대한 발광 판독 및 실험 다이어그램. 발광 신호는 발광 판독기에 의해 판독됩니다. 행 A: 1st-9 th wells에는 ADCC Bioassay Buffer가 포함되어 있습니다. 행 B:3rd-8 웰 에는 BHT101의 ADCC 반응 시스템(표적 세포 + 항체 + 효과기 세포)이 포함되어 있습니다. 2번째 웰은 항체가 없습니다. 9번째 웰에는 ADCC Bioassay 버퍼만 포함되어 있습니다. C 행:3rd-8 웰 에는 SW-1736의 ADCC 반응 시스템(표적 세포 + 항체 + 효과기 세포)이 포함되어 있습니다. 2번째 웰은 항체가 없습니다. 9번째 웰에는 ADCC Bioassay 버퍼만 포함되어 있습니다. 행 D: 1st-9 번째 우물에는 분석 버퍼가 포함되어 있습니다. 약어: ADCC = 항체 의존성 세포 매개 세포 독성; AB = ADCC 생물검정 완충액; VEGFR = 혈관 상피 성장 인자 수용체; EGFR = 표피 성장 인자 수용체; mAb = 단클론 항체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig03.jpg"> 
그림 3: 웨스턴 블로팅을 사용한 BHT-101 및 SW-1736 갑상선 암종에서 EGFR 및 VEGFR 발현 검출. VEGFR이 아닌 EGFR의 발현은 두 세포주 모두에서 검출되었습니다. B-actin은 적재 제어로 사용되었습니다. 약어: EGFR = 표피 성장 인자 수용체; VEGFR = 혈관 표피 성장 인자. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig04.jpg"> 
그림 4: ADCC 활성의 접힘 유도. (A) 갑상선암 세포주 BHT-101은 항-EGFR 항체 세툭시맙(Cetuximab)이 존재할 때 ADCC 효과를 나타냅니다. (B) 갑상선암 세포주 SW-1736은 항-EGFR 항체 세툭시맙(Cetuximab)이 존재할 때 ADCC 효과를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

The method for antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity (ADCC) represents an important tool to assess the efficacy of therapeutic antibodies in ...

assessing-antibody-dependent-cell-mediated-cytotoxicity-cancer-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

크롬 출시 분석, 세포 독성 T 세포의 활동을 검출하기위한 일반적인 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 문서에서, 항원 특이 CD8 T 세포와 인간의 유방암 종양 라인 SKBR3를 사용하여 임피던스 기반의 접근 방식은 세포의 살해를 감지하는 기능에 대해 조사 하였다.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

이 비디오는 T 세포 효과기 기능의 항체 매개 활성화를 측정하는 분석을 보여줍니다. HA를 발현하는 형질주입된 포유류 세포에 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 특이적 단일클론 항체를 추가하면 HA와 함께 면역 복합체가 형성됩니다. Fc 수용체를 발현하는 조작된 T 세포와 루시페라제 리포터를 도입하면 T 세포는 항체-HA 복합체에 의해 활성화되며, 이러한 활성화는 루시페라제 기질을 추가하고 생성된 생물 발광을 측정하여 검출됩니다.

HA 항체에 의한 Fc 매개 효과기 기능의 활성화 측정

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 형광 현미경 및 자동화 된 화상 처리와 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발 된 세포 독성 분석이다. 여기서, 우리는 항 CD20 항체로 처리 림프종 세포가 세포 독성 정량적 분석을 제공하는 인간 전혈에서 실시간 분석 할 수있는 방법을 설명한다.

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

이 프로토콜은 치료용 항-HER-2 항체가 있는 상태에서 자연 살해 세포 매개 유방암 세포 사멸을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 자동화된 이미지 기반 고처리량 기술을 제시합니다.

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

사이토카인 방출 분석 참조 시약을 사용하면 면역 치료용 단클론 항체의 재현성 및 표준화된 체외 안전성 프로파일을 얻을 수 있습니다. 여기에서는 사이토카인 방출 분석을 참조 시약 패널과 함께 사용하여 일부 치료용 단클론 항체의 안전성을 예측하는 방법을 설명합니다.

reference reagent를 사용하여 단클론 항체 안전성 예측을 위한 cytokine 방출 분석의 견고성 확인

여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

여기에서는 단일 세포 수준에서 세포 사멸을 조사하기 위해 하나의 T 세포와 암 표적 세포를 캡슐화하는 이중 에멀젼 방울을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 T 세포 집단 내에서 세포독성 분자와 표적 세포 사멸을 모두 이중 정량화할 수 있습니다.

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

배우세요 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC) 바이오어세이를 사용하여 암 면역요법 연구에서 치료용 항체의 효능을 신속하고 정확하게 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 하루 만에 결과를 얻을 수 있어 대규모 선별 분석에 유용합니다.

항체 의존성 세포 매개 세포 독성 리포터 생물학적 분석을 사용하여 암세포의 항체 의존성, 세포 매개 세포 독성 평가

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