심혈관 바이오마커 발견을 위한 혈장 유래 세포외 소포체의 분리, 특성화 및 단백질체 분석

바이오마커로서 순환하는 세포외 소포체는 바이오마커 연구에서 비교적 새로운 분야이며 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 당사의 프로토콜은 응급실 환경에서 세포외 소포체 결합 바이오마커 발견 및 검출을 구현하기 위한 실습 접근 방식을 제공하는 것을 목표로 합니다. 새로운 증거에 따르면 세포외 소포체와 순환계에서 발견되는 분자 화물에는 여러 질병 맥락에서 관심 있는 단백질과 RNA가 포함되어 있습니다.

몇 가지 새로운 세포외 소포, 밀폐형 바이오마커는 다양한 심혈관 질환 개체의 진단 및 예후와 관련이 있습니다. 순환 세포외 소포체 바이오마커 발견 분야의 주요 과제는 세포외 소포체의 보존과 EV 방출 역학에 의존하는 혈장 획득입니다. 따라서 특히 단백질체학(proteomics)과 같은 광범위한 분석 방법을 적용할 때 EV 성능 저하를 방지하고 재현 가능한 결과를 유지하기 위해 임상 루틴에 포함된 엄격한 프로토콜이 필요합니다.

순환 EV 내에 포함된 단백질 바이오마커의 발견은 증상 발현과 관련된 초기 채혈 시간과 자연적인 EV 분해로 인한 샘플 보관 기간에 크게 의존합니다. 이 프로토콜은 플라즈마 EV 분리 및 단백질체학 분석에 대한 도입을 위한 실습 프로토콜을 제공하여 응급실의 임상 워크플로우에 통합합니다. 향후 연구는 비대상성 심부전, 부정맥 또는 빈맥 심근병증 환자와 우회 수술을 받는 환자에 대한 종단 연구를 포함하여 다양한 환자 집단을 방법론에 통합하는 데 중점을 둘 것입니다.

이 프로토콜을 사용하여 앞서 언급한 병리학의 진단 및 예측에 기여하는 새로운 EV 결합 바이오마커를 식별하는 것을 목표로 합니다. 깨지지 않고 고정 각도 로터가 있는 초원심분리기를 사용하여 인간 혈장을 원심분리하기 시작합니다. 파편과 apoptotic 몸이 가라앉은 후에, 세포외 소포를 고립시키기 위하여 끊기 없이 100, 4 섭씨 온도에 2 시간 동안 000 G에 새로운 관 그리고 매우 분리기에 상등액을 옮기십시오.

초원심분리 후 튜브를 조심스럽게 제거하십시오. 전자 피펫을 사용하여 상층액을 부드럽게 흡인하여 약 1ml의 세포 외 소포체가 고갈된 혈장을 남깁니다. 1000 마이크로리터 피펫으로 전환하여 세포외 소포 펠릿을 방해하지 않고 나머지 혈장을 조심스럽게 피펫팅합니다.

피펫팅 중 튜브를 서서히 기울여 플라즈마가 남아 있지 않은지 확인하고 펠릿을 PBS에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 세포외 소포 스톡 용액을 얼음처럼 차가운 PBS로 다양한 비율로 희석하여 추적하는 동안 프레임당 10-100개의 나노 입자의 최종 계수 범위를 달성합니다. NTA 기기를 켜고 연결된 컴퓨터에서 해당 소프트웨어를 실행합니다.

챔버를 레이저 상자에 삽입하고 카메라 시작을 클릭하여 활성화합니다. PBS 1밀리리터를 주사기에 넣고 전면 튜브에 연결합니다. 튜빙 시스템을 철저히 세척하여 챔버에 기포가 남아 있지 않도록 합니다.

카메라를 모니터링하여 기포나 오염 입자를 감지합니다. 이제 준비된 세포외 소포 작업 희석액을 1ml 주사기에 넣고 챔버에 주입합니다. 캡처 및 프로세스 탭으로 이동하여 모니터의 밝기에 맞게 화면 게인을 조정합니다.

카메라 레벨을 수정하여 화면에서 나노 입자 차별화를 향상시킵니다. 프로세스 탭에서 적절한 감지 임계값을 설정하여 입자와 배경 소음을 구별합니다. 나노 입자가 화면에 선명하게 나타날 때까지 기기의 각 측면에 있는 초점 휠을 사용하여 카메라의 초점을 맞춥니다.

하드웨어 설정에서 모든 측정에 대해 섭씨 22도의 일정한 온도를 설정한 후 실행 버튼을 클릭하여 측정을 시작합니다. 모든 샘플 실행에 대해 각각 30초씩 비디오를 3개 이상 녹화합니다. change를 클릭하여 샘플 희석 계수를 입력하고 마지막으로 export를 클릭하여 결과를 저장합니다.

나노입자 추적 분석을 사용하여 브라우니와 움직임을 기반으로 세포외 소포체를 식별하고 시각화했습니다. 분석 결과, 건강한 사람의 혈장에서 밀리리터당 10 입자의 10배에 해당하는 평균 입자 농도가 나타났으며, 이는 세포외 소포체의 존재를 입증했습니다. 혈장 세포외 소포체의 평균 크기는 184.7나노미터로 측정되었으며, 이는 일반적인 세포외 소포체 치수와 일치합니다.