Name: 인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: 학습하세요 인간 iPSC에서 혈관 오가노이드를 생성하는 확장 가능한 방법을. 새로운 ROCK 억제제와 마이크로웰 구속을 사용하여 재현성을 높이고 배치 간 변이를 최소화합니다. 이 기법은 형태학적 분석과 질병 모델링에 적합합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위한 hiPSC 유래 혈관 오가노이드

<ol><li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 364 (6444), 960-965 (2019).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3d+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3d tissue physiology in vitro.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3d+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Koike, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+hepato-biliary-pancreatic+organogenesis+from+the+foregut-midgut+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary.</a> Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).</li>
<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li>
<li>Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+blood+vessel+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).</li>
<li>Wimmer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+vessel+organoids+as+a+model+of+diabetic+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy.</a> Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).</li>
<li>He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2021).</li>
<li>He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible%2C+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).</li>
<li>Hwang, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwell-mediated+control+of+embryoid+body+size+regulates+embryonic+stem+cell+fate+via+differential+expression+of+wnt5a+and+wnt11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11.</a> Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).</li>
<li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+aggrewell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates.</a> Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Star+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+pericyte-like+cells+induce+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties.</a> Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+vascular+and+neuronal+networks+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform.</a> Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).</li>
<li>Sakurai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+vascularized+bleeding+model+that+integrates+the+principal+components+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis.</a> Nat Commun. 9 (1), 509(2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+biomimetic+pericyte-covered+3d+microvascular+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).</li>
<li>Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKosyakova%2C+N+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2019).</li>
<li>Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+perfusable+microvascular+network+morphology+using+a+multiculture+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).</li>
<li>Haase, K., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+on-chip+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in on-chip vascularization.</a> Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).</li>
<li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+models+of+vascular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).</li>
<li>Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+vascular+growth+and+tissue+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nat Methods. 16 (3), 255(2019).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올 (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>711-546-152</td><td>0.25 mL 50% 글리세롤로 재구성,&nbsp; -20°C에서 보관; C 최대 1년, 사용을 위한 희석 비율: 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>705-606-147</td><td>은 0.25 mL 50% 글리세롤로 재구성하고, -20°C에서 보관; C 최대 1 년, 사용을위한 희석 비율 : 1 : 1000</td></tr><tr><td>B27 보충제에서 비타민 A를 뺀 (50x)</td> <td>Gibco</td><td>12587010</td><td>4 °C에서 해동; C, 부분 표본 및 -20 &deg에 저장; C, 동결-해동 주기</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>ProSpec</td><td>CYT-081</td>은 <td>100ng/&micro의 농도에서 멸균 ddH2O로 재구성하지 않습니다. L, 부분 표본 및 -20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>CD31 항체&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab28364</td><td>희석 비율: 1:400</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>022626001</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423/10</td>은 <td>DMSO로 12mM에서 원액을 만들고 -20°C에서 보관합니다. C는 최대 1 년.</td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Tocris</td><td>7163/10</td>은 <td>100 &micro에서 원액을 만듭니다. M을 DMSO로 설정하고 -20°C로 저장합니다. C는 최대 1 년.</td></tr><tr><td>콜라겐 I&nbsp;</td><td>코닝</td><td>40236</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>니콘</td><td>AXRMP/Ti2</td><td></td></tr><tr><td>코닝 엘플라시아 플레이트</td><td>코닝</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>백작 II FL 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, 분말</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>바이오 그레이드 ddH2O로 10x 스톡 용액을 만들고 0.2 &micro로 멸균합니다. M 필터. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Edi042A</td><td>Cedars Sinai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Medchemexpress LLC</td><td>는</td><td>DMSO로 1mM에서 재고 솔루션을 만들고 -20°C에서 저장할 HY1039610MG 있습니다. C는 최대 1 년.</td></tr><tr><td>ERG 항체</td><td>Cell Singali Technology</td><td>97249</td><td>희석 비율: 1:400</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 - 프리미엄</td><td>애틀랜타 생물학</td><td>S11150</td><td>4°C에서 해동; 씨&nbsp; 및 분취, 상점&nbsp; -20 > C 최대 5 년 동안 또는 4 &deg에 저장; 최대 한 달 동안</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>ProSpec</td><td>CYT557</td>은 <td>100ng/&micro의 농도에서 멸균 ddH2O로 재구성합니다. L, 부분 표본 및 -20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>Fluorodish 세포 배양 접시</td><td>세계 정밀 기기</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td>는 <td>12 mM의 농도에서 DMSO로 재구성하고 -20 °C에서 분취 및 저장합니다. C</td></tr><tr><td>겐타마이신(50mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제(100개)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>헤파린, 100kU</td><td>MilliporeSigma</td><td>375095100KU</td>는 4kU/mL HEPES (1M)<td>의 농도에서 멸균 ddH2O로 재구성</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>13998123</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>4°C에서 해동; C, 부분 표본 및 -20°C에 보관; C, 동결-해동 주기</td></tr><tr><td>Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>4°C에서 해동을 피하십시오. C, 부분 표본 및 -80°C에 저장; C, 동결-해동 주기</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액(NEAA, 100x)</td>을 피하십시오.<td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 물</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 플러스 키트</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001130</td><td>4°°에서 해동; C, 부분 표본 및 -20°C에 보관; C, 동결 - 해동 주기</td></tr><tr><td>N2 보충 (100x)</td> <td>Gibco</td><td>17502048</td><td>4°C에서 해동을 피하십시오. C, 부분 표본 및 -20°C에 보관; C, 동결-해동 주기 NaOH</td></tr><tr><td>용액 (1M)</td><td>을 피하십시오. HyClone</td><td>SH31088.01</td><td></td></tr><tr><td>NeuroBasal 배지</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements, ver 5.42</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>17000121</td><td>10mL 멸균 ddH2O로 재구성, 4°C에서 보관; 최대 2주 동안</td></tr><tr><td>C 파라포름알데히드, 20%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713S</td><td>PBST로 희석</td></tr><tr><td>, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28352</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta; 항체</td><td>R& D</td><td>AF385</td><td>희석 비율: 1:400</td></tr><tr><td>폴리아민 보충제(1000x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Rapiclear 투명화 시약, 1.49</td><td>SUNJIN LAB</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨(7.5%)</td><td>Gibco</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>데옥시콜레이트 나트륨 일수화물</td><td>Thermofisher</td><td>J6228822</td><td>1%(wt/v) 원액에 대해 ddH2O로 용해</td></tr><tr><td>TBST, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>trans-ISRIB</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5284/10</td><td>은 DMSO로 1 mM에서 재고 용액을 만들고 -20°C에서 보관합니다. C는 최대 1 년.</td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>ProSpec</td><td>CYT-116</td>은 <td>100ng/&micro의 농도에서 멸균 ddH2O로 재구성합니다. L, 부분 표본 및 -20°C에 저장; 씨</td></tr></tbody></table>

인간 유도 만능 줄기 세포(human-induced pluripotent stem cells)에서 혈관 오가노이드 생성

Vascular Organoid Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

그림 1A는 각 단계에서 사용되는 주요 구성 요소를 포함하여 이 프로토콜의 체계를 보여줍니다. 분화는 EB 형성으로 시작하여 중배엽 유도 및 혈관 계통 사양이 뒤따랐습니다(그림 1B-D). 응집체는 시간이 지남에 따라 더 커지고 구형이 줄어들었습니다. 오가노이드는 5일째에 거친 가장자리를 보이기 시작했습니다. 콜라겐 I-기저막 매트릭스 혼합물에 매립된 후 혈관 내피 세포와 주위 세포가 싹을 틔우고 성장하여 빠르면 7일째에 복잡한 혈관 네트워크를 형성했습니다(그림 1E). 이 수정된 방법의 주요 목적은 서로 다른 세대 배치 간의 변동을 최소화하는 것이므로 두 개의 독립적인 배치에서 EB 크기를 측정했으며 크기 측정과 통계 분석 모두 이 방법과의 일관성과 균일성을 확인했습니다(그림 1F).
혈관 분화를 검증하기 위해 CD31, ERG1 및 PDGFRβ를 포함한 혈관 마커로 염색하고 임베딩하기 전에 5일차에 오가노이드를 수집했습니다. 오가노이드는 CD31, ERG1 및 PDGFRβ를 발현했으며(그림 2), 이는 혈관 내피 세포와 주위 세포의 존재를 나타냅니다.
조직 제거 후, 혈관 네트워크는 전체 장착 면역형광 현미경으로 분석되었습니다(그림 3A). 성숙한 오가노이드는 17일째(그림 3B, 겔 블록의 샘플) 및 28일째(그림 3C, 겔 블록에서 샘플을 채취하여 96웰 플레이트에서 개별적으로 배양했습니다. 가장자리의 혈관 네트워크는 겔 블록에서 회수한 후 방사상으로 팽창하는 대신 스페로이드를 감쌌습니다).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig01.jpg"> 그림 1: 혈관 오가노이드 생성. (A) 혈관 오가노이드 생성을 위한 단계 및 타임라인 계획. (B-E) 다양한 단계에서 혈관 오가노이드의 대표적인 명시야 이미지. 스케일 바: 100 μm. (F) 이 연구에서 제시된 마이크로웰 방법을 사용하여 두 개의 서로 다른 EB 생성 배치에서 EB 크기의 통계 분석. EB 생성의 경우 마이크로웰당 1,000개의 셀이 사용되었으며 배치 1 및 2의 경우 각각 n = 42 및 n = 40이었습니다. 유의성은 유의하지 않고 ns로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig02.jpg"> 그림 2: 겔 임베딩 전 혈관 오가노이드의 면역염색. 내피 마커 (A) CD31(녹색) 및 (B) ERG1(녹색)과 (C) pericyte 마커 PDGFRβ(녹색)로 각각 염색된 오가노이드의 대표적인 형광 이미지. 핵을 DAPI(파란색)로 대조염색하였다. 스케일 바: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig03.jpg"> 그림 3: 혈관 오가노이드의 혈관 네트워크에 대한 면역형광 특성화. (A) 대표적인 이미지는 조직 투명화 후 유리 접시에 겔이 내장된 혈관 오가노이드를 보여줍니다. 오가노이드는 투명했지만 385nm 자외선 아래에서 볼 수 있었습니다. (B) 17일째 혈관 오가노이드의 대표적인 3D 전체 마운트 이미지. 혈관 오가노이드는 DAPI(파란색), 혈관 내피 세포 마커인 CD31(녹색) 및 주세포 마커인 PDGFRβ(자홍색)로 염색되었습니다. (C) 내피 마커 CD31(빨간색) 및 ERG1(녹색)로 염색된 28일에 회수된 혈관 오가노이드의 대표적인 전체 마운트 3D 이미징. 스케일 바: 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>hiPSC 확장 매체</td>
			<td>500mL</td>
		</tr><tr><td>mTeSR Plus 기초 배지</td>
			<td>400mL</td>
		</tr><tr><td>mTeSR Plus 보충제</td>
			<td>100mL</td>
		</tr><tr><td>겐타마이신(50mg/mL)</td>
			<td>1mL</td>
		</tr></tbody></table>표 1: hiPSC 팽창 매체의 구성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>hiPSC 파종 배지</td>
			<td>20mL</td>
		</tr><tr><td>PSC 확장 매체</td>
			<td>20mL</td>
		</tr><tr><td>크로만 1 (100 μM)</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>엠리카산(1mM)</td>
			<td>30 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>폴리아민 서플리먼트(×1000)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>트랜스-ISRIB (1 mM)</td>
			<td>14 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 2: hiPSC 파종 매체의 조성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>N2B27 매체</td>
			<td>100mL</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제</td>
			<td>48.6 mL</td>
		</tr><tr><td>NeuroBasal 배지</td>
			<td>48.6 mL</td>
		</tr><tr><td>GlutaMAX 보충제 (×100)</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액(NEAA, 100x)</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(×1000)</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr><tr><td>겐타마이신(50mg/mL)</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr><tr><td>N2 서플리먼트(×100)</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td>B27 보충제 마이너스 비타민 A (50×)</td>
			<td>1mL</td>
		</tr><tr><td>헤파린, 4kU/mL</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr></tbody></table>표 3: N2B27 매체의 조성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>중배엽 유도 매체(MIM)</td>
			<td>3mL</td>
		</tr><tr><td>N2B27 매체</td>
			<td>3mL</td>
		</tr><tr><td>BMP4 (100ng/μL)</td>
			<td>0.9 μL</td>
		</tr><tr><td>CHIR99021 (12 mM)</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 4: 중배엽 유도 매체(MIM)의 조성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>혈관 분화 배지 1(VDM1)</td>
			<td>3mL</td>
		</tr><tr><td>N2B27 매체</td>
			<td>3mL</td>
		</tr><tr><td>포스클린 (12 mM)</td>
			<td>0.5 μL</td>
		</tr><tr><td>VEGFA(100ng/μL)</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 5: 혈관 분화 배지 1(VDM1)의 조성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>콜라겐 I 혼합물</td>
			<td>5mL</td>
		</tr><tr><td>콜라겐 I (3.61g/mL)</td>
			<td>2.77mL</td>
		</tr><tr><td>10x DMEM/F12 매체</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td>중탄산 나트륨, 7.5 %</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td>헤페스, 1m</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td>H2O (에이치오)</td>
			<td>0.73 mL</td>
		</tr><tr><td>나오, 1M</td>
			<td>75 마이크로리터</td>
		</tr></tbody></table>표 6: 콜라겐 I 혼합물의 조성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>콜라겐 I - 기저막 매트릭스 혼합물</td>
			<td>6.5 mL</td>
		</tr><tr><td>콜라주 I 믹스</td>
			<td>5mL</td>
		</tr><tr><td>마트리겔(10mg/mL)</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr></tbody></table>표 7: 콜라겐 I-기저막 매트릭스 혼합물의 조성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>혈관 분화 배지 2(VDM2)</td>
			<td>5mL</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX™ 보충제</td>
			<td>3.67 mL</td>
		</tr><tr><td>겐타마이신(50mg/mL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액(NEAA, 100X)</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(×1000)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>헤파린, 4kU/mL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Knockout 세럼 교체</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td>VEGFA(100ng/μL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>FGF2 (100 ng/μL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 8: 혈관 분화 배지 2(VDM2)의 조성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>블로킹 버퍼</td>
			<td>50mL</td>
		</tr><tr><td>당나귀 세럼</td>
			<td>2.5mL</td>
		</tr><tr><td>트윈 20</td>
			<td>0.25 mL</td>
		</tr><tr><td>트리톤 X-100</td>
			<td>0.25 mL</td>
		</tr><tr><td>데옥시콜산나트륨 용액(1%, wt/v)</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td>46.5 mL</td>
		</tr></tbody></table>표 9: 면역염색을 위한 차단 완충액의 조성물.

인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

Vascular organoids derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) recapitulate the cell type diversity and complex architecture of human ...

vascular-organoid-generation-from-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 유도 만능 줄기 세포에서 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 신경권이 어떻게 다른 세균층의 형성을 억제하는 신경외배엽층을 형성하는지 보여줍니다. 신경구는 3D 젤 매트릭스에 내장되어 신경 상피 새싹을 형성합니다. 오가노이드 배지로 배양하면 이러한 신경 상피 새싹은 특정 뇌 영역으로 분화되어 성숙한 뇌 오가노이드를 형성합니다.

인간 뇌 오가노이드를 생성하는 체외 방법

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 전뇌형 오가노이드를 생성하는 과정을 간략하게 설명하며, 줄기 세포 응집체에서 뇌 피질을 모방하고 다양한 뉴런 유형으로 분화하는 복잡한 구조로 진행되는 과정을 보여줍니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 전뇌형 대뇌 오가노이드 생성

대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

여기에서 우리는 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 두뇌 유기체를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 다량의 뇌 오르가노이드와 고품질의 뇌 오르가노이드를 얻기 위해, 우리는 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용합니다.

집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

여기서, 우리는 자기 조직에 의하여 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 발달적으로 관련있는 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 만드는 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 발달 단서의 순차적 활성화에 의존하고 매우 복잡하고 기능적으로 관련된 인간 심장 조직을 생성합니다.

다능성 줄기 세포에서 파생된 자가 조립 인간 심장 오르가노이드 생성

이 프로토콜은 인간 만능 및 유도 만능 줄기 세포로부터 자가 조직화 혈관의 생성을 설명합니다. 이러한 혈관 네트워크는 혈관주위세포, 평활근 액틴 및 연속적인 기저막으로 둘러싸인 광범위하고 연결된 내피 네트워크를 나타냅니다.

만능줄기세포(Pluripotent Stem Cells)에서 인간 혈관 오가노이드(Human Blood Vessel Organoids)의 생성

이 프로토콜은 빠르고 재현 가능한 내배엽 간 오가노이드(eHEPO)의 생성을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 eHEPO를 2주 이내에 생산할 수 있으며 차별화와 기능을 잃지 않고 장기(1년 이상)로 확장할 수 있습니다.

기능성 내배엽 간 오가노이드(endodermal hepatic organoids)의 생성

이 프로토콜은 현탁 배양 조건을 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)에서 신장 오가노이드를 생산하기 위한 포괄적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 연구의 주요 초점은 초기 세포 밀도와 WNT 작용제 농도의 결정에 있어 신장 오가노이드 연구에 관심이 있는 연구자에게 도움이 됩니다.

유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells)에서 현탁액의 신장 오가노이드 생성

이 프로토콜의 개발, 확대, hESCs에와 유도 만능에서 파생 된 NK 세포의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

학습하세요 인간 iPSC에서 혈관 오가노이드를 생성하는 확장 가능한 방법을. 새로운 ROCK 억제제와 마이크로웰 구속을 사용하여 재현성을 높이고 배치 간 변이를 최소화합니다. 이 기법은 형태학적 분석과 질병 모델링에 적합합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

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