Name: 비율계량 형광 공명 에너지 전달에 의한 DNase 활성 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: 학습하세요 비율계량 FRET 분석법으로 DNase 활성을 정량 평가하는 방법을. pH와 온도 조건에 따른 약한 핵산분해효소 활성을 실시간 모니터링하여 효소학 연구에 활용할 수 있습니다.

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비율계량 형광 접근법은 단일 신호의 강도에만 의존하는 대신 형광 신호의 비율을 사용하는 분석 방법입니다 1,2. 비율을 사용하면 내부 교정을 제공하고 샘플 및 프로브 농도의 변화, 기기 매개변수 등과 같은 많은 무작위 요인을 보상할 수 있다는 장점이 있습니다. 이것은 형광 프로브의 정확성과 감도를 향상시킵니다.
FRET(Förster 공명 에너지 전달) 프로브의 특정 맥락에서 "비율계량"이라는 용어는 측정이 FRET 공여체 및 수용체 형광단 쌍의 두 방출 신호의 비율을 기반으로 한다는 사실을 나타냅니다. 표적 분석물의 활성을 정량화하기 위해 비율계량 FRET 프로브는 수용체/기증자 방출 강도의 비율(또는 경우에 따라 거꾸로 된 기증체/수용체 비율)을 사용합니다. 이 비율은 FRET 효율과 직접적인 관련이 있습니다. 배경 소음을 최소화하고 조명 조건 및 프로브 농도의 변화를 설명하는 자체 정규화 메커니즘을 제공합니다3.
비율계량 방법의 최근 흥미로운 응용 분야에는 순환 종양 DNA(ctDNA)4,5의 검출을 위한 비율계량 전기화학적 바이오센서, 세포사멸의 식세포 단계의 FRET를 위한 브라운 동작 구동 바이오 나노 기계에서의 사용이 포함됩니다6, 식세포청소율의 표현 FRET 표지 및 분석 7. 이 작업에서 설명한 비율계량 FRET 접근 방식은 DNase 활성의 정량적 평가에 유용합니다. 분석 측정은 FRET 쌍 방출 비율을 기반으로 합니다. 미미하고 느린 DNA 절단도 검출할 수 있기 때문에 이 분석은 더 긴 관찰 기간이 필요한 약한 핵분해 활성을 조사하고 다양한 pH 수준에서 실험하는 데 특히 적합합니다.
여기서, 비율계량 FRET 분석의 몇 가지 특정 이점은 약한 뉴클레아제-백혈구 엘라스타제 억제제(LEI)의 DNase 활성을 연구하기 위한 적용으로 설명됩니다. 이 보고서에는 단계별 지침과 비율 측정 데이터 분석에 대한 설명이 포함된 자세한 프로토콜이 포함되어 있습니다.
비율계 FRET 프로브 설명
비율계량 FRET 프로브는 FAM-TAM(Fluorescein-Tetramethylrhodamine)의 기증자-수용체 FRET 쌍을 운반하는 자기 상보형 38-mer DNA 올리고입니다. 그 서열은 5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3'입니다. 자가 혼성화 38-mer는 23 및 15 뉴클레오티드로 구성된 두 개의 연결된 헤어핀으로 구성된 스테이플 모양의 형태를 가정하며, 이는 서로 23.8 Å 떨어진 두 개의 형광단을 배치합니다. 이것은 이 쌍의 Förster 반지름인 R0 = 55 Å8보다 훨씬 가깝습니다. 이러한 위치 지정은 공여자에서 수용체로의 에너지 전달 효율이 매우 높음에 해당합니다7: EFRET = 0.993477. 그 결과, FAM 여기 파장(488nm)에서 조명되면 FRET 프로브는 수용체 TAM(580nm)의 방출 파장에서 형광을 방출하는 반면 FAM 방출(525nm)은 억제됩니다.
그림 1A 는 UNAFold가 예측한 프로브의 2차 구조를 보여주며, 좁은 곡률로 인한 입체 장애로 인해 양쪽 헤어핀 정점에 작은 루프가 있습니다. FRET 프로브에 의한 DNA 절단 검출의 개략도는 그림 1B에 나와 있습니다. 이는 DNase에 의한 올리고프로브의 파손이 FRET 쌍을 분리한다는 것을 보여줍니다. 이 분리는 프로브에 있는 두 형광단의 방출 스펙트럼에 급격한 변화를 일으킵니다. 그림 1C 는 절단 전후의 프로브 방출 스펙트럼을 나타내고 DNase II 프로브 절단 후 FRET 쌍의 분할이 525 nm(ID 525 nm)에서 공여체 방출을 증가시키고 동시에 580 nm(IA 580 nm)에서 수용체 방출을 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 그림 1D 는 방출 스펙트럼에 해당하는 PAGE 겔 및 FRET 비율을 보여줍니다. DNase II 프로브 절단은 12-16-mer FAM(녹색) 및 20-24-mer TAM(빨간색) 단편에 해당하는 두 개의 넓은 밴드를 생성했으며, 이는 헤어핀 사이의 연결 영역 근처에서 T23 의 양쪽에서 38-mer의 무작위 절단을 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5.jpg"> 
그림 1: 비율계량 FRET 프로브의 구조 및 작동. (A) UNAFold에 의해 생성된 FRET 프로브의 예측된 2차 구조. (B) 작동하는 FRET 프로브의 개략도. 비율계량 FRET 프로브는 23.8Å의 유효 FRET 거리에서 FRET 기증체(FAM) 및 수용체(TAM)로 표지된 스테이플 모양의 38mer 올리고뉴클레오티드로 &gt;99% FRET 효율을 보장합니다. DNase에 의한 올리고프로브의 절단은 FRET 쌍을 분리하여 FRET를 제거합니다. (C) DNase II 매개 절단 전후의 FRET 프로브의 방출 스펙트럼. 절단 전에 FAM 방출이 억제되고 TAM 방출이 두드러집니다. DNase 매개 절단은 FAM과 TAM을 분리하여 FAM 방출(525nm 피크)을 복원하고 TAM 방출(580nm 드롭)을 제거합니다. λ여기 = 488nm. (D) DNase II 절단 전후의 FRET 프로브의 비율 측정 및 전기 영동 평가. 상단 패널: 프로브 상태의 정량적 측정을 나타내는 FRET 비율(RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm). 빨간색: 절단되지 않음; 녹색: DNase II 절단. 하단 패널: 형광 측정 데이터에 해당하는 변성 PAGE 겔. DNase II 절단은 FAM 표지 단편(12-16 nt, 녹색) 및 TAM 표지 단편(20-24 nt, 빨간색)을 생성하며, 이는 T23 옆에 있는 헤어핀 사이의 연결 부근에서 절단을 나타냅니다. 절단되지 않은 대조군은 노란색 형광을 나타냅니다. 사다리: 38-mer 프로브의 5' 및 3' 세그먼트에 해당하는 FAM 및 TAM 표지 올리고뉴클레오티드, 원래 위치에 형광 표지가 있습니다. 반응 조건: 10mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.2), 1pmol/μL FRET 프로브, 0.0033U/μL DNase II, 37°C에서 24시간. RD/A = ID 525 nm/IA 580 nm; λ여기 = 488nm. UNAFold 조건: 1 μM FRET 프로브, 10 mM Na+, 0 mM Mg2+, 37 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
개별 테스트 방출 스펙트럼의 변화는 분명하지만 많은 수의 방출 스펙트럼 간의 정량적 비교에는 보다 사용자 친화적이고 컴팩트한 정량적 매개변수가 필요합니다. 이 역할은 FRET 비율에 의해 수행됩니다. 제시된 형광 방법은 정량적 평가를 위해 FRET 쌍 구성원의 형광 방출의 직접(2채널) 비율에 의존하는 비율계량 접근법 그룹에 속합니다 2,9.
이 접근법은 FRET 효율과 관련된 공여자/수용체 방출 비율(RD/A = ID 525nm / IA 580nm)을 사용하며 38-mer(파손 또는 손상되지 않음)의 상태를 정량적으로 특성화합니다. ID/IA 비율은 프로브 농도, 여기 강도 및 광표백과 같은 요인의 변화를 본질적으로 설명하는 자체 정규화 메커니즘을 제공합니다3. 이 접근 방식은 동일한 프로브 내에 기증자와 수용체가 연결되어 있는 FRET 프로브에만 적합하며, 이들의 비율이 알려져 있고 일정합니다. 이러한 이유로, 접근법은 수용체 또는 기증자 누화의 직접 여기를 고려할 필요가 없다2. 프로브의 고정된 기증자-수용체 화학량론은 기증자/수용체 방출 비율이 이러한 변화의 영향을 받지 않고 프로브의 상태를 직접적으로 반영하도록 합니다. 결과적으로, 기증자-수용체 방출의 비율은 신호 정규화 2,3이 내장된 정량적 DNA 절단 매개변수를 제공합니다.
이 분석은 프로브 절단 후 FRET가 중단되고 절단이 증가함에 따라 증가하는 DNase 활성과 동일한 방향으로 변화하기 때문에 ID / IA 비율(반대 IA / ID 비율이 아닌)을 사용합니다. 이는 그림 1C의 스펙트럼에 해당하는 DNase II에 의한 절단 전후의 비율 측정 프로브와 PAGE 전기영동을 보여주는 그림 1D에 의해 설명됩니다. 비율계량 FRET 분석의 편의성, 시간 절약 및 사용 편의성을 입증하기 위해 약한 뉴클레아제-백혈구 엘라스타제 억제제(LEI)의 DNase 활성을 발견하고 연구하는 데 적용되었습니다.
약한 뉴클레아제 LEI
프로테아제 억제제 LEI는 자연적으로 준안정, 즉 위상학적으로 불균형합니다. 이 기능은 억제 메커니즘에 필수적입니다. 표적 프로테아제가 LEI 반응성 부위 루프(RSL)를 절단할 때, 프로테아제 억제제 분자는 급격한 형태 변화를 겪어 프로테아제를 비활성 형태로 기계적으로 늘립니다10,11. 놀랍게도, 이것은 또한 LEI 분자 자체를 파괴 및 팽창시키고 천연 접힘으로 덮인 비밀스러운 DNase 부위를 밝혀 LEI를 활성 엔도뉴클레아제 L-DNase II(LEI 유래 DNase II)로 전환합니다11,12. 비밀스러운 DNase 부위는 황산에서 pH 2에서 하룻밤 배양하여 발생하는 LEI의 변성 및 파손에 의해 노출될 수도 있습니다10,13. LEI를 연구하기 위해 이 FRET 분석을 활용한 결과, LEI의 잠재 핵분해 활성을 밝히기 위해 가혹한 화학적 변성 처리와 표적 효소 절단이 엄격하게 필요하지 않음을 입증했습니다.
제시된 비율 측정 FRET 접근 방식의 응용 프로그램 및 프로토콜은 정상적인 비변성 LEI에 본질적으로 존재하는 약한 DNase 활성의 발견을 설명합니다. 절단되지 않은 LEI의 고유한 핵분해 능력의 발견과 그 분석은 다양한 산성 pH 수준에서 장기간 관찰할 수 있는 분석의 적합성으로 인해 가능했습니다.

<table><tbody><tr><td>96웰 플레이트</td><td>송골매</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>DNA FRET 프로브</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3'; FAM &ndash; 플루오레세인-dT; &nbsp; 탐 &ndash; 테트라메틸로다민-dT.&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>시그마 알드리치</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>EVOLT 디지털 SLR 카메라</td><td>올림푸스</td><td>E500</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치가 있는 젤 전기영동 장치</td><td>바이오 래드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이</td><td>노보프로틴</td><td>CJ01 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>LiCOR 겔 이미징 시스템</td><td>리코</td><td></td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>인비트로젠</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>프리캐스트 PAGE 젤</td><td>인비트로젠</td><td>EC68852</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨 완충액 pH 5.2</td><td>시그마 알드리치</td><td>S2899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>분광형광계</td><td>테칸</td><td></td><td>새파이어 2</td></tr></tbody></table>

비율계량 형광 공명 에너지 전달에 의한 dnase 활성 평가

Assessment of DNase Activity by Ratiometric Fluorescence Resonance Energy Transfer

이 대표적인 연구는 장기간의 관찰이 필요한 느린 효소 반응을 조사하기 위한 비율계량 FRET 접근법의 구체적인 이점을 강조합니다. 특히, 이 애플리케이션은 비율계량 FRET 시스템을 사용하여 LEI의 고유한 DNase 활성을 검출하고 분석하는 방법을 보여줍니다. 이 연구의 결과는 그림 2에 나와 있습니다.
이 접근 방식을 사용하여 LEI가 절단이나 가혹한 화학 처리에 대한 노출을 통한 효소 활성화 없이 약산성 조건에서 DNase 활성을 나타낸다는 것을 입증했습니다. 우리는 이러한 핵분해 활성이 pH 5.5의 용액에서 검출할 수 있는 LEI의 고유한 특성≤ 확인했습니다. 크기는 적당하지만 활성은 매우 안정적이었으며 pH는 4.8에서 5.2 사이로 DNase II 계열 구성원과 유사했습니다<sup ...

비율계량 형광 공명 에너지 전달에 의한 DNase 활성 평가

The present protocol describes a simple and sensitive ratiometric F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) assay for the detection and quantitative ...

assessment-dnase-activity-ratiometric-fluorescence-resonance-energy

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연구

JoVE Journal

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DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

여기에서는 리가아제(ligase), 뉴클레아제(nuclease) 및 중합효소(polymerase enzymes)의 예를 사용하여 핵산 대사 효소를 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 RNA 및/또는 DNA 손상 또는 경로 중간체를 모방하는 듀플렉스를 형성하기 위해 결합할 수 있는 형광 표지 및 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 효소 행동의 특성을 분석할 수 있습니다.

핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

학습하세요 비율계량 FRET 분석법으로 DNase 활성을 정량 평가하는 방법을. pH와 온도 조건에 따른 약한 핵산분해효소 활성을 실시간 모니터링하여 효소학 연구에 활용할 수 있습니다.

비율계량 형광 공명 에너지 전달에 의한 DNase 활성 평가

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