Name: 소뇌 유기형 배양을 사용한 Purkinje 세포의 DNA 손상 반응 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 배우세요 소뇌 유기형 배양을 사용한 Purkinje 세포의 DNA 손상 반응 분석 방법을. ATM 결핍 마우스 모델에서 세포 망상 및 단백질 상관 분석을 통해 소뇌 퇴행성 질환의 분자 기전을 규명합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>소뇌 Purkinje 세포: 유기형 배양에서의 DNA 손상 반응

<table><tbody><tr><td>시약 및 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 x 30cm 페트리 접시</td><td>Corning Inc.</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10mm 페트리 접시</td><td>코닝</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>접착 현미경 슬라이드</td><td>Marienfeld</td><td>48187</td><td>76 x 26 x 1 mm</td></tr><tr><td>헬리콥터용 블레이드</td><td>TED PELLA</td><td>모델 TC752-1</td><td>&nbsp; 스타일 면도날</td></tr><tr><td>BME</td><td>GIBCO</td><td>41010-026 500ml.&nbsp;</td><td>L-Glut 없음</td></tr><tr><td>세포 배양은</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Biological Indo</td>를 삽입합니다.<td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS w/o 페놀 레드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138-500L</td><td>No Ca+,No Mg+</td></tr><tr><td>HBSS with 페놀 레드</td><td>Sartorius</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>말 세럼&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>26050088</td><td>열 비활성화</td></tr><tr><td>아이리스 펜치</td><td>CellPath</td><td>GZX-0100-00A</td><td>130mm 무딘 톱니 모양의</td></tr><tr><td>아이리스 스파튤라</td><td>F.S.T</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322412-1L</td><td></td></tr><tr><td>메탄올&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>GRIGENE</td>이 없는 Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>장착 매체</td><td>. Ltd, 이스라엘</td><td>K239320A</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177-250MG</td><td>Paraquat dichloride (Methyl viologen)</td></tr><tr><td>PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor</td><td>Tocris Bioscience, United Kingdom</td><td>PDD 00017273</td><td>light sensitive&nbsp;</td></tr><tr><td>인산염 완충액</td><td>생물학적 인도.</td><td>02-018-1A</td><td></td></tr><tr><td>가위, 피부 조직</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>여섯 웰 플레이트</td><td>Corning 통합</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>예비 절단 디스크&nbsp;</td><td>TED PELLA</td><td>모델 10180-01</td><td></td></tr><tr><td>조직 초퍼</td><td>McIlwain</td><td>모델 TC752</td><td>10180-220</td></tr><tr><td>핀셋, 뾰족한</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>요로 컵</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 당나귀 안티 토끼 IgG</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:500; 이차 ab; 2차 희석 완충액; &nbsp; 실온에서 2 시간 동안 배양</td></tr><tr><td>Anti glial fibrillary acidic protien</td><td>Milliphore</td><td>MAB3402</td><td>1:1500; 1 차 ab; 차단; 호스트 : 마우스</td></tr><tr><td>안티 칼빈딘 - D-28K</td><td>Swant&nbsp;</td><td>CB300</td><td>1:2000; 기본 ab; 블로킹; 호스트: rabbit&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-칼빈딘-D-28K</td><td>스완트</td><td>CB-38a</td><td>1:2000; 기본 ab; 차단&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-pan-ADP-ribose 시약</td><td>Milliphore</td><td>MABE1016</td><td>1:800; 1차 ab; 차단; 실온에서 2시간 동안 배양</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Cell signaling</td><td>4084</td><td>1:1000; 2차 희석 완충액; 실온에서 20분 동안 배양</td></tr></tbody></table>

소뇌 유기형 배양을 사용한 purkinje 세포의 dna 손상 반응 시각화

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

그림 1은 소뇌 기관형 배양(cerebellar organotypic cultures)의 일반적인 모습을 보여줍니다. 그림 1A 의 맨 윗줄은 배양 상태에서 유지되는 소뇌 박리를 보여주고, 맨 아래 줄은 Calbindin D-28k(녹색)에 대해 염색된 PC와 NeuN(빨간색)에 대해 염색된 신경 세포핵을 보여줍니다. 그림 1B에서 PC의 성상교세포(빨간색)는 중간 필라멘트 유형 III 단백질인 GFAP(녹색)에 대해 염색됩니다. 그림 2 와 그림 3 은 강력한 산화제인 두 가지 DNA 손상 물질인 브롬산칼륨(12시간 동안 10mM의 최종 농도)과 파라콰트로 이러한 배양물을 처리한 후 관찰된 PAR 염색을 보여줍니다. PAR 반응은 대조군과 비교하여 소뇌 folium의 처리된 PC에서 표시되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig01.jpg"> 그림 1: murine cerebellar organotypic culture의 개요. (A) 맨 윗줄은 배양 중에 유지되는 소뇌 잎을 보여줍니다. 맨 아래 줄은 PC 계층에 초점을 맞춥니다. PC는 Calbindin D-28k(녹색)로 강조 표시됩니다. NeuN 염색(빨간색)은 층에서 신경 세포핵을 식별합니다. (B) PC 자세히 보기(빨간색). GFAP(녹색), 성상세포를 강조하는 중간 필라멘트 유형 III 단백질. 스케일 바 = 968.8 μm (A, 상단 열), 42.1 μm (A, 두 번째 열), 72.7 μm (B, 상단 행), 18.2 μm (B, 두 번째 줄). 약어: PC = Purkinje cells; GFAP = 신경교세포(glial fibrillary acidic protein); DAPI = 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig02.jpg"> 그림 2: 브롬산칼륨으로 처리된 소뇌 절편의 PAR 염색. 소뇌 절편을 강력한 산화제인 브롬산칼륨(KBrO3)으로 12시간 동안 10mM의 최종 농도로 처리했습니다. 스케일 바 = 775 μm. 약어: PAR = poly(ADP-ribose); DAPI = 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig03.jpg"> 그림 3: 과산화물 음이온의 강력한 생산자인 파라콰트에 노출된 소뇌 절편의 PAR 반응. (A) 소뇌 엽에 대한 일반적인 견해. 특히 PC에서 강력한 PAR 응답은 컨트롤과 비교됩니다. (B) 면밀한 검사는 PC 및 기타 세포 유형에서 PAR 반응을 보여줍니다. 스케일 바 = 193.8 μm(A), 18.2 μm(B). 약어: PAR = poly(ADP-ribose); DAPI = 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:border="1.5pt solid">용액 및 버퍼</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid"></td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">용액  </td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">재료</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">해부 매체</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.5% D-포도당을 함유한 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS). Mg2+ 및 Ca2+가 없는 HBSS 50mL에 50% D-포도당 용액 0.5mL를 추가합니다.</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">BME 배양 배지</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">L-글루타민이나 HEPES가 아닌 페놀 레드를 함유한 BME(Basal Medium Eagle) 100mL를 페놀 레드가 함유된 HBSS 50mL, 열불활화 말 혈청 50mL, 50% D-포도당 2mL, 200mM L-글루타민 1mL를 섞습니다. 멸균 환경에서 0.22μm 필터를 통해 혼합 및 여과합니다. 4 °C에서 보관</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">면역염색을 위한 차단 용액</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.1M 인산염 완충액: 0.5% Triton X-100, 10% 염소 혈청 첨가</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">2차 항체 희석 완충액</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.1M 인산염 완충액, 0.2% Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">세척 버퍼</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.1M 인산염 완충액, 0.2% Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">정착 용액</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Actenoe : 메탄올 (1 : 1 v : v)</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">투과화 솔루션</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.1M 인산염 완충액, 1%Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">DAPI 솔루션</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">원액(2mg/mL)을 1x PBS에서 1μg/mL로 희석한</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">인산염 완충액</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">두 개의 soulutions A와 B를 준비합니다 (아래 참조). 아래 지정된 비율에 따라 용액을 혼합하여 0.2M 인산염 완충액을 만듭니다. 그런 다음 0.2M 용액을 DDW(1:1)로 희석하여 0.1M 인산염 완충액(작업 용액)을 만듭니다.</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">솔루션 A(0.2M용)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">인산나트륨 일염기성 무수 12g(Na2HPO4 FW 141.96) DDW 500mL</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">솔루션 B(0.2M용)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">인산나트륨 반염기성 무수 14.2g(Na2HPO4 FW 141.96) DDW 500mL</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">0.2M를 만들기 위한 혼합 솔루션</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">1L 준비: 용액 A 230mL 및 용액 B 770mL</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">0.1M 인산염 완충액</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">혼합 용액을 DDW로 희석(1:1)</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 솔루션 및 그 구성.

소뇌 유기형 배양을 사용한 Purkinje 세포의 DNA 손상 반응 시각화

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional ...

visualizing-dna-damage-response-purkinje-cells-using-cerebellar

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 방법은 organotypic 소뇌 문화의 생성 및 다른 소뇌 세포 유형의 생존 능력에 특정 apoptotic 자극의 효과를 설명합니다.

Organotypic 소뇌 문화 : Apoptotic 도전과 감지

우리는 organotypic 소뇌 슬라이스 문화에서 자란 개별 Purkinje 세포의 수지상 나무의 형태를 확인하고 양적 엉덩이에 할 수 있습니다 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 Purkinje 세포 수지상 개발의 메커니즘에 대한 연구를 촉진하기위한 것입니다.

Organotypic 슬라이스 문화의 Purkinje 세포 수지상의 형태학의 분석

이 비디오는 쥐 강아지의 뇌에서 소뇌 유기형 절편을 채취하여 영양소와 성장 인자로 보충된 배지에서 절편을 배양하여 체외에서  소뇌 발달을 모방하는 기술을 보여줍니다.또한 특정 소뇌 절편을 테스트 화합물로 처리하고 면역형광 염색 기술을 사용하여 화합물의 신경 보호 능력을 분석합니다.

유기형 소뇌 절편 배양에서 Purkinje 세포 생존 분석

소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하...

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

Organotypic 슬라이스 문화는 신경 발달 또는 퇴행성 / 재생 과정을 연구할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서, 우리는 마우스 소뇌 슬라이스 배양에서 Purkinje 세포의 신경 발달 죽음을 모델로 하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 신경 보호 약물 발견에 대 한 연구 혜택을 받을 수 있습니다.

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이 프로토콜은 실시간으로 개인 replisomes하여 DNA 복제를 시각화하기위한 간단한 단일 분자 형광 현미경 기술을 보여줍니다.

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배우세요 소뇌 유기형 배양을 사용한 Purkinje 세포의 DNA 손상 반응 분석 방법을. ATM 결핍 마우스 모델에서 세포 망상 및 단백질 상관 분석을 통해 소뇌 퇴행성 질환의 분자 기전을 규명합니다.

소뇌 유기형 배양을 사용한 Purkinje 세포의 DNA 손상 반응 시각화

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