낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발

우리의 연구는 복잡한 다미생물 모델을 사용하여 낭포성 섬유증 환경에서 미생물 간의 복잡한 상호 작용과 이로 인해 항생제 내성이 어떻게 증가하는지 이해하는 데 중점을 두었습니다. 우리는 이 지식을 사용하여 새로운 치료 개입을 개발하기를 희망합니다. 생물막 분야의 발전은 생물물리학적 접근 방식과 함께 정량화 방법론과 결합된 시각화에 의해 주도되고 있습니다.

여기에는 마이크로 및 나노 단위까지 공간 해상도를 제공하는 3D OrbiSIMS와 같은 기술이 포함됩니다. 이 연구는 CF 환자의 항생제 치료에서 볼 수 있는 것을 대표하는 복잡성 수준을 유지하는 다미생물 모델을 만드는 것을 목표로 합니다. 또한 처리량을 늘리고 관련성을 높이며 다른 균주 및 조건에 대한 적응성을 높일 수 있습니다.

이 프로토콜은 CF 병원체에 대한 관련 테스트 환경을 제공합니다. 견고하고 상대적으로 처리량이 높습니다. 또한 여러 종점에 적용할 수 있어 보다 복잡한 연구를 수행할 수 있습니다.

이 연구는 CF와 관련된 환경이 미생물 감수성을 변화시킨다는 것을 보여주었습니다. 또한, 존재하는 곰팡이의 유형은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 감수성을 변화시킬 수 있으며, 이는 상당한 임상적 관련성을 가질 수 있습니다. 먼저 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 배양균을 예로 들어 보겠습니다.

마이크로피펫을 사용하여 각 액체 배양액 1ml를 별도의 멸균 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 박테리아 또는 균류를 펠릿으로 만들기 위하여 8, 000 x g에 2 분 동안 관을 원심 분리하십시오. 그 후, 피펫을 사용하여 각 튜브에서 상등액을 흡인하고 펠릿을 1 밀리리터의 PBS에 재현탁시킵니다.

PBS에서 재현탁된 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 세포를 1 내지 10으로 희석한다. 그런 다음 분광 광도계를 사용하여 600나노미터의 파장에서 광학 밀도를 측정합니다. 세척된 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 샘플을 PBS에서 1-100으로 희석한 후, 각 샘플 10마이크로리터를 혈구계의 두 개의 개별 챔버에 피펫팅합니다.

그런 다음 칸디다 알비칸스 샘플을 1 x 10으로 조정하여 PBS에서 밀리리터당 8CFU의 거듭제곱을 조정합니다. 생물막에 추가할 접종물을 준비하려면 PBS를 사용하여 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 접종물을 조정합니다. 단일종 생물막의 경우, 희석된 미생물 10마이크로리터를 6웰 플레이트의 SCFM2 1.5% 기술 한천에 놓인 폴리카보네이트 디스크의 중앙에 피펫팅합니다.

처리 또는 중단하기 전에 24시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 정적으로 배양하십시오. 다미생물 생물막의 경우, 동일한 폴리카보네이트 디스크에 각각 황색포도상구균과 칸디다 알비칸스를 각각 10마이크로리터씩 추가합니다. 접종된 디스크를 섭씨 37도에서 24시간 동안 정적으로 배양합니다.

멸균 겸자를 사용하여 배양한 후 폴리카보네이트 디스크를 새로운 SCFM2 1.5% 기술 한천 플레이트로 옮깁니다. 1 x 10의 10 마이크로리터를 미리 확립된 황색포도상구균, 칸디다 알비칸스 생물막 위에 녹농균의 밀리리터당 4 CFU 희석의 거듭제곱에 추가합니다. 섭씨 37도에서 24시간 더 배양합니다.

시작하려면 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 고체 공기 계면 식민지 생물막을 예로 들어 보겠습니다. 플레이트에 직경 2.8mm의 세라믹 비드를 추가하고 플레이트를 UV 가교시킵니다. 화염 멸균 겸자를 사용하여 5개의 세라믹 비드를 멸균 2밀리리터 균질화 튜브로 옮깁니다.

PBS 1ml를 2mL 균질화 튜브에 피펫팅합니다. 최소 10초 동안 또는 육안 검사에 의해 결정된 대로 폴리카보네이트 디스크에서 생물막이 제거될 때까지 튜브를 소용돌이칩니다. 일단 제거되면, 폴리탄산염 원판을 밖으로 가지고 가고, 그 후에 균질화기에 있는 구슬을 가진 관을 두고 구타 사이 10초 간격으로 초당 6미터로 10 초 동안 그(것)들을 2 시간 치십시오.

이제 균질화 튜브에서 파괴 된 생물막을 4 밀리리터의 PBS를 포함하는 7 밀리리터 옥주에 붓고 최종 부피는 5 밀리리터입니다. 균질화기 튜브를 8, 000 x g에서 2분 동안 원심분리하십시오. 그런 다음 남은 액체를 7ml 옥양으로 옮겨 모든 액체가 옮겨지도록 합니다.

파괴된 생물막 200마이크로리터를 바닥이 투명한 검은색 96웰 플레이트에 추가한 다음 0.02%레사주린 용액 10마이크로리터를 각 웰에 피펫팅합니다. 레사주린으로 처리된 생물막을 섭씨 37도의 플레이트 리더에서 배양합니다. 형광등을 측정하기 전에 200RPM에서 10초 동안 30분마다 궤도 진탕을 적용합니다.

540나노미터의 여기 파장과 590나노미터의 방출 파장을 사용하여 형광을 측정합니다. 단일종 생물막은 다미생물 생물막에 비해 50% 사멸을 달성하기 위해 메로페넴과 토브라마이신의 농도가 현저히 낮아야 했으며, 후자에 필요한 항생제 농도가 2log 증가했습니다. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 생존율은 토브라마이신(tobramycin)이 밀리리터당 64마이크로그램으로 다미생물 생물막에서 증가한 반면, 메로페넴(meropenem)은 유사한 조건에서 생존율이 감소한 것으로 나타났습니다.

단일종 생물막(mono-species biofilms)에서, 메로페남(meropenam)과 토브라마이신(tobramycin)으로 치료했을 때 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 생존과 대사 활동 사이에 강한 상관관계가 관찰되었습니다.