Name: 혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(Microfluidics in Assessing Platelet Function) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 배우세요 미세유체역학을 활용한 혈소판 기능 평가 방법으로, 생리학적 조건에서 혈소판 행동을 분석하고 수혈의학 및 지혈 재생 응용을 위한 통찰을 제공합니다.

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모든 연구는 기관 지침에 따라 수행되었습니다. University of Pittsburgh Human Research Protection Office의 승인을 받았으며 건강한 인간 지원자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.
1. 미세유체 장치 준비
<ol>
	<li>장치의 PDMS 부분을 제작하려면 CNC(Computer Numerical Control) 미세 가공을 통해 황동을 사용하여 마스터 금형을 준비합니다. 참고: 채널 치수에 따라 포토리소그래피 기술을 사용하여 마스터 금형을 만들 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 장치에는 약 480μm 너비, 장치 입구 및 출구 140μm 높이, 장치 협착 시 40μm 높이의 8개의 병렬 미세 가공 채널이 포함되며 협착 영역과의 램프 길이는 약 0.3mm입니다. 채널 길이는 약 6mm입니다.</li>
	<li>얻은 마스터 몰드와 함께 실리콘 엘라스토머 베이스(엘라스토머 키트에서 얻음)를 계량 접시에 붓습니다. 실리콘 폴리머 사슬의 가교를 촉진하여 액체 PDMS를 내구성 있고 유연한 고체로 변환하는 실리콘 경화제(엘라스토머 키트에서 얻음)를 10:1(염기제)의 비율로 첨가하고 혼합물을 잘 저어줍니다.</li>
	<li>금형을 페트리 접시에 넣고 경화되지 않은 PDMS를 금형에 붓습니다. 페트리 접시를 진공 데시케이터에 30분 동안 넣어 거품을 제거합니다.</li>
	<li>PDMS를 70°C로 설정된 오븐에서 90분 동안 넣어 마스터 몰드에서 경화를 마칩니다.</li>
	<li>PDMS 경화가 완료된 후 면도날이나 메스를 사용하여 미세유체 캐스트를 잘라냅니다. 채널 가장자리에 펀치 구멍을 뚫습니다(양쪽 직경 1.5mm).</li>
	<li>실험실 테이프를 사용하여 유리 슬라이드의 표면과 미세유체 주조물의 에칭된 면을 청소합니다. 필요에 따라 압축 공기를 사용하여 남아 있는 이물질을 제거합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드와 에칭된 면이 위쪽을 향하도록 미세유체 주조물을 플라즈마 클리너에 넣습니다. 진공 펌프를 시작하고 챔버를 밀봉한 다음 플라즈마 클리너를 높은 설정으로 켭니다. 슬라이드와 PDMS를 플라즈마 클리너에 30초 동안 그대로 둔 다음 플라즈마 클리너를 끄고 진공을 제거합니다.</li>
	<li>플라즈마 세척 캐스트와 유리 슬라이드를 플라즈마 클리너에서 앞면이 위로 향하게 한 면을 부드럽게 눌러 함께 묶습니다. 그런 다음 미세유체 장치를 70°C의 오븐/핫플레이트에 10분 동안 놓습니다. 알림: 캐스트와 유리 슬라이드를 함께 접착할 때 채널 형태가 손실될 수 있으므로 너무 많은 압력을 가하지 마십시오.</li>
	<li>각 챔버를 10-30 μL의 70% 에탄올로 헹구어 멸균하고 미세유체 장치를 70 °C 핫 플레이트에서 건조시킵니다. 참고: 장치는 최소 24시간 전에 제작해야 하지만 몇 주에서 몇 달 전에 제작될 수도 있습니다. 장치는 밀폐 용기 또는 실온의 덮개를 씌운 페트리 접시에 보관해야 합니다.</li>
	<li>미세유체 소자를 사용한 실험 전날, 각 챔버를 10-30μL의 70% 에탄올로 다시 헹구어 살균하고 미세유체 장치를 70°C 핫플레이트에서 건조시킵니다.</li>
	<li>지정된 배출구를 통해 지정된 주입구까지 1:5 부피 비율로 0.9% NaCl에 희석된 Type 1 말 섬유소 콜라겐 시약(1mg/mL)으로 챔버를 코팅합니다. 실험 내에서 방향성이 유지되는지 확인합니다. 채널 내에서 코팅된 콜라겐의 증발을 방지하기 위해 장치를 따뜻하고 습한 밀폐된 용기에 보관하십시오.</li>
	<li>1시간 후, 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹구어 콜라겐 용액을 씻어냅니다. 코팅의 반대 방향으로 플러시합니다. 사용하지 않을 때는 따뜻하고 습하며 밀폐된 용기에 장치를 다시 보관하십시오.</li>
</ol>
2. 혈액 샘플 준비
<ol>
	<li>venipunculture를 통해 인용된 전혈 샘플을 얻습니다. FC 수용체 차단 용액으로 구연산 전혈을 배양합니다(1:600). 알림: 혈액 샘플은 실험 전과 실험 중에 실온에서 보관됩니다.</li>
	<li>형광 접합(선택한 형광단 사용) CD41 항체(1:600)로 구연산 전혈을 배양합니다. 너팅 로커에 30분 동안 염색합니다.</li>
	<li>혈소판 억제에 대한 양성 대조군으로, PBS에서 30% w/v 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린(HP-β-CD) 용액으로 재구성된 P2Y12 수용체 길항제인 Ticagrelor를 첨가합니다. 참고: 최대 6.4mM의 Ticagrelor 스톡을 준비해야 하며, 실험 전에 HP-β-CD 용액(PBS에 용해된 30% HP-β-CD)에서 Ticagrelor 스톡을 추가로 희석할 수 있습니다(1,000배 스톡 농도 권장).</li>
	<li>구연산 시료를 Ticagrelor(최종 농도 최대 6.4μM)로 30분 동안 배양하여 혈소판 억제를 관찰합니다.</li>
	<li>혈액 제제를 구연산 샘플과 혼합하는 경우, 혈액 제제를 FC 수용체 차단 용액(1:600) 및 형광 접합(구연산 샘플에 대해 별도의 별개의 형광단 사용) CD41 항체(1:600)로 염색합니다.<ol>
		<li>수혈된 제품 단위의 부피 등가물을 인용된 샘플과 혼합합니다. 예를 들어, 출혈이 있는 사람에게 수혈된 2단위의 혈소판 제품(총 혈액량 5,000mL에 제품당 약 250mL)을 시뮬레이션하려면 100μL의 혈액 제제를 1,000μL의 구연산 혈액 샘플에 혼합합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>실험 직전에 40μm 필터를 통해 혈액 샘플을 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 여과합니다.</li>
</ol>
3. 유동 하에서 혈소판 기능 테스트(방법 1)
<ol>
	<li>현미경 및 관련 소프트웨어를 켭니다.</li>
	<li>현미경의 스테이지와 함께 인출 주사기 펌프 레벨을 설정합니다. 주사기 펌프의 설정을 조정합니다.<ol>
		<li>방정식 (1) 및 (2)21을 사용하여 수로의 협착 영역에서 3,500 s-1의 원하는 평균 벽 전단 속도(γ)에 대한 체적 유량(Q)을 계산합니다. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq02v2.jpg" style="margin: auto;">(2) 여기서 A는 채널의 단면적, P는 습식 둘레, λ는 형상 계수, b는 직사각형의 짧은 면(높이), a는 직사각형의 긴 면(너비)입니다. 참고: 3,500 s-1의 값은 VWF 임계 전단으로 인해 선택되며 동맥 영역 7,22,23에 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>현미경 스테이지에 미세유체 장치를 놓습니다. 움직임을 피하기 위해 미세 유체 장치의 가장자리를 스테이지에 테이프로 붙입니다. 배출구가 현미경 뒷면을 향하고 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>1/16" ID 튜브(약 30cm 길이)의 한쪽 끝을 엘보우 커넥터에 연결하고 다른 쪽 끝을 1/16" ID 커넥터가 있는 10mL 주사기에 연결합니다.</li>
	<li>주사기에 멸균 PBS를 채우고 주사기 펌프에 연결합니다.</li>
	<li>엘보우 커넥터를 장치 콘센트에 놓습니다.</li>
	<li>한쪽 끝에는 엘보우 커넥터가 있고 다른 쪽 끝에는 각진 절단부가 있는 약 10cm 길이의 흡입 라인을 준비합니다.</li>
	<li>입구 엘보우 커넥터를 장치 입구에 연결합니다.</li>
	<li>흡입 라인을 각진 홀더의 폐기물 마이크로 원심분리기 튜브에 배치합니다.</li>
	<li>약 500μm 너비의 채널 치수에 대해 10x 대물렌즈를 사용하고 미세유체 장치 채널 가장자리에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>PBS로 라인을 프라임하고 주사기 펌프를 수동으로 전진시켜 PDMS/파편이 있는 채널을 제거합니다. 채널 입구와 출구 근처를 확인하십시오.</li>
	<li>저장된 이미지 캡처 설정을 열거나 혈액 샘플에 사용된 형광 CD41 항체에 해당하는 명시야 채널 및 형광 채널을 사용하여 1-2초마다 캡처된 시계열 이미지에 대한 이미지 캡처 절차를 만듭니다.</li>
	<li>여과된 citrated 혈액 샘플을 얻고 실험 직전에 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 샘플을 각진 마이크로 원심분리기 홀더에 놓습니다.</li>
	<li>주입 라인을 샘플에 배치합니다.</li>
	<li>이미지 캡처 기록을 시작합니다.</li>
	<li>천천히 주사기를 빼서 튜브의 데드 볼륨을 채웁니다. 혈액이 채널에 도달하면 즉시 주사기 펌프의 재생을 눌러 원하는 전단 속도로 흐름을 재개합니다.</li>
	<li>필요한 경우 초점을 조정합니다.</li>
	<li>혈소판이 미세유체 장치의 협착 영역을 완전히 폐색할 때까지 또는 실험 종료(즉, 10분)까지 실험을 실행합니다.</li>
	<li>주입구 튜브가 혈액 샘플에 잠겨 있는지 확인합니다.</li>
	<li>실험이 완료되면 이미지 캡처를 중지하고 실린지 펌프를 중지합니다. 이미지 캡처를 저장합니다.</li>
	<li>입구 엘보우 커넥터를 제거하고 튜브의 내용물을 폐기물 원뿔형으로 비웁니다. 주사기와 배출 라인의 내용물도 폐기물 원뿔형으로 비우십시오.</li>
	<li>후속 샘플에 필요한 경우 주입구 및 배출구 커넥터와 튜브를 교체합니다.</li>
</ol>
4. 저용량 샘플(1mL 미만)을 사용한 유속 혈소판 기능 테스트(방법 2)
<ol>
	<li>위와 같이 1.1-1.4단계를 반복합니다.</li>
	<li>채널 가장자리에 직경 1.5mm의 배출구와 직경 3mm의 흡입구를 펀칭합니다.</li>
	<li>위와 같이 1.6-3.6단계를 반복합니다.</li>
	<li>약 500μm 너비의 채널 치수에 대해 10x 대물렌즈를 사용하고 미세유체 장치 채널 가장자리에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>주사기 펌프를 수동으로 전진시키고 실험실용 물티슈로 접근 유체를 흡수하여 PDMS/파편이 있는 채널을 청소합니다. 미세유체 장치 상단의 실험실 테이프로 이물질을 제거합니다.</li>
	<li>펌프를 수동으로 전진시켜 3mm 흡입구 저장소를 PBS로 채웁니다.</li>
	<li>저장된 이미지 캡처 설정을 열거나 혈액 샘플에 사용된 형광 CD41 항체에 해당하는 명시야 채널 및 형광 채널을 사용하여 1-2초마다 캡처된 시계열 이미지에 대한 이미지 캡처 절차를 만듭니다.</li>
	<li>주사기 펌프에서 회수를 시작하고(수동 또는 설정된 속도로) PBS가 채널로 전진하고 저장소의 충전 라인이 내려가면 펌프에서 회수를 일시 중지합니다.</li>
	<li>피펫으로 저장소에서 과도한 PBS를 제거합니다.</li>
	<li>이미지 캡처를 시작합니다.</li>
	<li>혈액 샘플을 저장소(약 40μL)에 피펫으로 주입하고 즉시 회수 주사기를 시작합니다. 흐름이 시작되는지 확인합니다. 알림: 인출용 주사기 펌프 모터가 4.8단계에서 프라이밍되지 않은 경우 흐름이 즉시 시작되지 않으며 실험을 반복해야 합니다.</li>
	<li>실험 기간 동안 혈액 저장소를 다시 채우고 공기 주머니가 채널로 들어가지 않도록 합니다.</li>
	<li>혈소판이 미세유체 장치의 협착 영역을 완전히 폐색할 때까지 또는 실험 종료(즉, 10분)까지 실험을 실행합니다.</li>
	<li>실험이 완료되면 이미지 캡처를 중지하고 주사기 펌프를 중지합니다. 이미지 캡처를 저장합니다.</li>
	<li>피펫팅으로 저장통에 있는 과도한 혈액을 제거합니다. 배출 튜브의 내용물을 폐기물 원뿔형 튜브에 비우십시오.</li>
	<li>후속 샘플에 필요한 대로 커넥터와 튜브를 교체합니다.</li>
</ol>
5. 오염 제거
<ol>
	<li>10% 표백제 용액에 씻어내어 혈액의 입구와 출구 라인을 청소합니다.</li>
	<li>미세유체 장치의 모든 채널을 사용한 경우 Sharps 생물학적 유해 폐기물 용기에 장치를 버리십시오. 알림: 모든 생물학적 폐기물은 생물학적 유해 폐기물에 적절하게 처리해야 합니다.</li>
</ol>
6. 이미지 분석
<ol>
	<li>File( 파일) | 수출/수입 | 내보내기.</li>
	<li>다음 매개변수를 선택합니다. 파일 유형: 태그가 지정된 이미지 파일 형식(TIFF); 압축: LZW; 원본 데이터를 확인하고 픽셀을 이동하십시오. Apply display curve and channel color를 선택 취소하십시오. Define Subset (Region, Rectangle region, and select width and height measures between conditions 사이의 너비 및 높이 측정으로 채널 영역을 선택)을 선택합니다. 원하는 폴더로 내보내고 폴더 생성을 선택합니다.</li>
	<li>소프트웨어에서 아래 실험 값을 주목하십시오 : 혈액이 채널에 들어갈 때 시작 프레임; 프레임 속도(정보, 시계열).</li>
	<li>보충 파일 1로 제공된 Matlab 코드를 사용하여 실험에서 각 프레임의 정규화된 평균 형광 강도를 측정하고 각 실험에 대해 다음 입력을 변경합니다. 실험 길이를 기반으로 한 시작 프레임/종료 프레임(실험 길이가 조건 간에 보존되는지 확인). 실험 이름/폴더 이름; X, Y, H 및 W 매개 변수 자르기. 수신자 혈소판 형광 채널에 대해 한 번, 제품 혈소판 형광 채널에 대해 한 번 코드를 실행합니다. 정규화된 MFI(열 2) 및 정규화된 AUC 값(시작 프레임으로 정규화된 값)을 보고합니다. 정규화된 AUC 값에서 실험 길이 값을 뺍니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Trauma and Transfusion에서 혈소판 기능을 평가하기 위한 플랫폼

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<li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li>
<li>Sorrells, M. G., Neeves, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+absorption+of+collagen+peptides+to+polydimethlysiloxane+and+its+influence+on+platelet+adhesion+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays.</a> Micromachines. 11 (1), 62(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Space Saver 진공 탈착기</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp 디지털 핫플레이트 교반기</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB30786161</td><td></td></tr><tr><td>너트 믹서</td><td>Fischer Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>오하우스 스카우트 저울</td><td>Uline</td><td>H-5852</td><td></td></tr><tr><td>오븐</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0520</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G (115V)</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프(PHD ULTRA CP, I/W 프로그래밍 가능)</td><td>하버드 장치</td><td>883015</td><td></td></tr><tr><td>Zen 3.4</td><td>Zeiss</td><td>Blue 에디션</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/16 inch ID - 가시 엘보우 커넥터</td><td>Qosina</td><td>11691</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin</td><td>Cayman Chemicals</td><td>16169</td><td>30% Dissolved in Phosphate buffered</td></tr><tr><td>Saline 40-micron filters</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td></td>NC1469671</tr><tr><td>CD41 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>&nbsp; NB100-2614</td><td>1:600 비율 in Whole</td></tr><tr><td>Blood Chrono-Par Collagen Reagent</td><td>Chrono Log Corporation</td><td>385</td><td>1:5 비율 in 0.9%</td></tr><tr><td>Saline Electron Microscopy Sciences Miltex Biopsy Punch with Plunger, 3.0 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0856599</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Essendant 121oz. Clorox 살균 표백제</td><td>Fischer Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td>70%</td></tr><tr><td>Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP 압축 가스</td><td>Supra</td><td>1381978</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>전혈 내 1:600 비율</td></tr><tr><td>LevGo smartSpatula 일회용 폴리프로필렌 주걱</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-001-017</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>안전 메스</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-718</td><td></td></tr><tr><td>식염수</td><td>Millipore</td><td>567442</td><td>0.90%</td></tr><tr><td>Sartorius 폴리스티렌 계량 보트</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-744</td><td></td></tr><tr><td>Superslip 커버 슬립 - Superslip No. 1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-055</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>NC9285739 폴리디메틸실록산(PDMS)</td></tr><tr><td>Ticagrelor</td><td>Cayman Chemicals</td><td>15425</td><td></td></tr><tr><td>Tygon PVC 투명 튜빙 1/16" ID, 1/8" OD, 50피트 길이</td><td>McMaster-Carr</td><td>6516T11</td><td></td></tr><tr><td>울트라 기계 360 황동 바</td><td>McMaster-Carr</td><td>8954K721</td><td>마스터 금형 제작</td></tr><tr><td>Vacutainers</td><td>BD</td><td>363083</td><td></td></tr><tr><td>세계 정밀 기기 재사용 가능한 생검 펀치, 1.5mm</td><td>피셔 과학</td><td>NC1215626</td><td></td></tr></tbody></table>

혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(microfluidics in assessing platelet function)

Microfluidics in Assessing Platelet Function

이 방법의 사용에 따른 미세유체 실험은 유동 채널의 협착 영역에서 혈소판이 풍부한 혈전 형성을 보여주어야 합니다(그림 1). 그림 1A 는 기능적 혈소판이 채널을 통한 혈류를 차단하기 위해 채널의 협착 영역에 혈전을 형성한 대표적인 결과를 보여줍니다. 실험 기간 동안 촬영한 동역학 이미지의 평균 형광 강도(MFI) 곡선은 성장하는 혈전에서 혈소판 통합의 지연, 성장 및 고원 단계를 보여줍니다(그림 2A, C). P2Y12 길항제인 Ticagrelor의 농도가 증가하면 혈소판 MFI와 MFI 곡선의 계산된 곡선 아래 면적(AUC)이 감소합니다(그림 2B, D). 뚜렷한 혈소판 기능 장애를 관찰하기 위해서는 더 긴 배양 시간(5분에 비해 30분)이 필요하며, 이는 5분 배양과 비교하여 30분 Ticagrelor 배양 후 전혈 임피던스 응집법을 사용하는 더 뚜렷한 용량-반응 관계에 따라 필요합니다(보충 그림 S1). 상이한 차량 조건하에서, P2Y12 억제의 유사한 시간 의존적 효과가 미세유체 모델에서 관찰되었다(보충 그림 S2).
시뮬레이션된 지혈 소생법에서 두 혈소판 집단의 시각화는 혈전 내에 두 혈소판 집단이 모두 통합되어 있음을 보여줍니다(그림 3A). 해당 형광 신호에 두 혈소판 집단의 통합은 MFI 측정을 통해 실험 기간 동안 운동학적으로 정량화할 수 있습니다(그림 3B). 성장기의 가파른 경사와 종말점 MFI 측정의 증가는 혈소판 기능과 지혈 가능성이 증가함을 보여주며, 이는 P2Y12 억제를 통해 혈액 샘플에 혈소판 기능 장애를 유도한 후 뚜렷한 혈소판 형광단으로 염색된 1:10 부피 비율로 신선한 자가 전혈을 혼합하여 시뮬레이션한 소생술에서 볼 수 있습니다. 자가 전혈 혼합을 통해 실온 보관 5일차에 성분채집술 혈소판 산물에 비해 시뮬레이션된 수혈 산물에서 더 많은 혈소판이 통합되었으며, 이는 형성 혈전에서 최소한의 산물 혼입을 보여주었습니다. 또한 5일차 실온 혈소판 제품 혼합은 신선한 자가 전혈과 혼합하는 것에 비해 더 낮은 수용자 혈소판 혼입을 보여주었습니다(그림 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig01.jpg"> 
그림 1: 미세유체역학을 사용한 혈소판 기능 검사의 표현. (A) 소량의 혈액 샘플을 사용한 혈소판 기능 테스트를 위한 개략적인 미세유체 실험 설정이 표시되어 있으며, 여기에는 실시간으로 이미지를 캡처할 수 있는 협착 유동 챔버를 통해 혈액을 끌어당기는 철수 주사기 펌프가 포함됩니다. (B) 협착 유동 챔버의 측면도가 표시되며, 여기에는 혈소판이 부착, 활성화 및 응집되어 협착 영역에서 혈전이 성장하는 콜라겐 코팅 표면이 포함됩니다. (C) 협착 미세유체 채널(3,500 s-1)에서 흐름 하에 있는 인용 혈액 샘플과 300초에 걸쳐 형성된 성장하는 혈전의 실시간 이미지 캡처. 스케일 바 = 200μm(C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig02.jpg"> 
그림 2: P2Y12 길항제 Ticagrelor를 사용한 배양 30분 후 감소된 혈소판 MFI 폴드 변화 및 곡선 아래 면적. (A) P2Y12 길항제를 사용한 배양은 5분 동안만 MFI 곡선의 지연 단계가 약간 연장되고 (B) MFI AUC가 약간 감소함을 보여줍니다. (C) P2Y12 길항제와 함께 30분 동안 배양하면 지연 단계가 확장되고 종말점 MFI 값이 감소할 뿐만 아니라 (D) MFI AUC를 통해 입증된 보다 강력한 기능 장애. 개별 데이터 포인트는 생물학적 반복실험을 나타내며 평균 ± 표준 편차가 표시됩니다. 약어: MFI = 평균 형광 강도; AUC = 곡선 아래 면적; HP-β-CD = 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig03.jpg"> 
그림 3: 미세유체 챔버에서 환자의 혈소판 기능 장애를 시뮬레이션하는 수용자 샘플에서 응고병성 P2Y12 억제와 혼합된 혈액 제제. (A) 성분채집술 혈소판 단위(혈장, 저장 7일차)(시안색의 CD41)를 0.8μM 티카그렐러로 30분 동안 사전 배양한 구연산 혈액과 1:10 비율로 혼합(빨간색의 CD41). (B) 시간 경과에 따른 수혜자 혈소판 동역학과 함께 성분채집술 혈소판 단위(보관 5일차) 또는 자가 신선 전혈(1:10 비율)을 받는 수혜자 혈액 샘플의 대표적인 정규화된 평균 형광 강도 곡선. 수혜자는 혈액 제제와 혼합하기 전에 30분 동안 0.8μM Ticagrelor로 사전 배양되었습니다. (C) 컨포칼 현미경 검사를 위해 커버슬립에 접합된 수정된 장치의 대표적인 z-stack 이미지. 성분채집술 혈소판 산물을 von Willebrand 인자 항체(1:600) 외에 1:5 용적 비율(product:blood)로 혈소판 감소성 혈액 샘플과 혼합했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 이미지 분석을 위한 Matlab 코드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/ImageReader_Jove_Supplemental.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: Ticagrelor를 사용한 P2Y12 억제의 전혈 임피던스 응집법 시간 의존성. 30분 동안 배양하면 5분에 비해 용량-반응 관계가 더 뚜렷합니다. 차량 및 의약품 솔루션은 0.1% v/v로 활용되었습니다. 개별 데이터 포인트는 생물학적 반복실험을 나타내며 평균 ± 표준 편차가 표시됩니다. 약어: AUC = 곡선 아래 면적; HP-β-CD = 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S2: 혈소판 기능의 미세유체 모델에서 Ticagrelor를 사용한 시간 의존적 P2Y12 억제. 건강한 개별 기증자의 기술적 복제에 대한 대표적인 MFI 곡선 및 곡선 아래 면적 값은 약물 용해도에 사용되는 에탄올 비히클(1% v/v)로 표시됩니다. 약어: MFI = 평균 형광 강도; AUC = 곡선 아래 면적. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(Microfluidics in Assessing Platelet Function)

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying ...

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

혈소판 유착 계단식는 전단 흐름의 존재에서 일어나는, 요인은 종래의 (정적) 잘 철판 assays에서 차지하는 없습니다. 이 문서의 생리 전단 흐름 조건을 에뮬레이트하는 microfluidic 잘 플레이트 형식을 이용한 혈소판 - 집계 분석에 대한 보고서.

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

혈소판 수혈 및 지혈은 혈액 은행 혈소판의 기능을 조사하기 위해 혈액 재구성 및 미세유체 유동 챔버를 사용하여 모델링되었습니다. 이 데이터는 혈소판 저장 병변이 지혈에 미치는 영향을 in vitro에서 보여줍니다.

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

이 논문은 동시에 혈소판 기능과 응고를 측정 지혈의 실험 모델을 설명합니다. 혈소판 및 피브린 형광을 실시간으로 측정하고, 혈소판의 부착 율, 응고 속도 및 응고의 개시가 결정된다. 모델은 수혈 농축 플로우하에 혈소판 응고 특성을 결정하는데 사용된다.

혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

우리는 탁도 의해 작용제 - 유도 된 혈소판 응집을 측정 하였다 인간 혈액으로부터 세척 혈소판 분리하는 간단한 방법을 설명한다. 예를 들어 우리는 Pannexin1 채널 억제제 브릴리언트 블루 FCF와 미리 인큐베이션 한 후 콜라겐 인간 혈소판 응집 반응을 연구하는데이 방법을 적용한다.

콜라겐 - 유도 된 응집에 Pannexin1 억제제의 효과 브릴리언트 블루 FCF : 탁도는 인간 혈소판에 씻어

이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다.

흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

정전식 바이오센서를 사용한 새로운 동적 다중 매개변수 혈소판 기능 분석을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 생리학적 관련성을 높이기 위해 반강성 미시환경 내에서 설계된 이 접근법은 혈소판 수, 자극 강도 및 활성화 경로에 민감한 세 가지 출력 매개변수를 제공합니다.

Capacitive Biosensor를 사용한 Dynamic Multiparameter Platelet Function Assessment (동적 다중 파라미터 혈소판 기능 평가)

프로응고제 혈소판 형성은 혈전증 위험 증가와 상관관계가 있습니다. 여기에는 인간 혈액에서 세척된 혈소판을 분리하기 위한 정확한 프로토콜이 제시되어 있으며, 이는 프로코아응고제 혈소판의 특징인 포스파티딜세린 및 미세소포 방출의 노출을 정량화하기 위한 것입니다.

인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 응고제 혈소판 특성 분석

이 연구는 전단 응력을 이용해 혈전 형성을 유도하고, 여러 차원의 판독을 통해 혈전을 특성화하는 마이크로유체 분석법을 설명합니다. 이 검사법은 혈액 샘플의 혈전형성 경향을 측정할 수 있어 질병 진단, 신약 개발, 혈전증과 관련된 기전적 연구에도 유용합니다.

혈전 프로파일링 분석법: 생체역학적 혈전 생성을 포괄적으로 특성화하기 위한 마이크로플루이딕스 기반 플랫폼

내피 기능을 평가하기위한 비침 투 절차는 엔도 - PAT 2000을 사용하는 증명이다.

엔도 - PAT 2000 내피 Vasodilator 기능을 평가

배우세요 미세유체역학을 활용한 혈소판 기능 평가 방법으로, 생리학적 조건에서 혈소판 행동을 분석하고 수혈의학 및 지혈 재생 응용을 위한 통찰을 제공합니다.

혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(Microfluidics in Assessing Platelet Function)

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