Name: 폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 배우세요 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 대식세포를 이용한 기도 장벽 공동 배양 모델링 방법. 이 기술은 폐 건강 및 질환 연구에 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>폐 장벽 무결성, 질병 및 약물 발견 연구를 위한 기도 모델

<ol><li>Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+airway+basal+stem+cells+in+lung+homeostasis+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine.</a> Respir Res. 23 (1), 122(2022).</li>
<li>Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+in+club+cell+biology+and+its+potential+relevance+to+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).</li>
<li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+mucus+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Airway mucus function and dysfunction.</a> N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li>
<li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Ann Am Thorac Soc. 15 (Suppl 3), S143-S148 (2018).</li>
<li>Khalilgharibi, N., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+form+and+function%3A+On+the+role+of+basement+membrane+mechanics+in+tissue+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease.</a> Open Biol. 11 (2), 200360(2021).</li>
<li>Mcdonald, D. M., Yao, L. C., Baluk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+airway+blood+vessels+and+lymphatics%3A+Lessons+from+development+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Dynamics of airway blood vessels and lymphatics: Lessons from development and inflammation.</a> Proc Am Thorac Soc. 8 (6), 504-507 (2011).</li>
<li>Parker, D., Prince, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+the+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in the respiratory epithelium.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45 (2), 189-201 (2011).</li>
<li>Davis, J. D., Wypych, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+functional+heterogeneity+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium.</a> Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).</li>
<li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+Soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 24 (1), 210-229 (2011).</li>
<li>Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+emerging+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in emerging viral infections.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).</li>
<li>Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+and+airway+hyperresponsiveness+associated+with+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection.</a> Front Immunol. 13, 1012048(2022).</li>
<li>Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+co-culture+of+human+alveolar+epithelium%2C+endothelium+and+macrophages+for+studying+the+interaction+of+nanocarriers+with+the+air-blood+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier.</a> Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).</li>
<li>Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+whole+lung+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+lung+developmental+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease.</a> J Vis Exp. (170), e62456(2021).</li>
<li>Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51(2018).</li>
<li>Choi, K. -Y. G., Wu, B. C., Lee, A. H. -Y., Baquir, B., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+organoid+and+air-liquid+interface+models+as+a+screening+method+in+the+development+of+new+host+defense+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Utilizing organoid and air-liquid interface models as a screening method in the development of new host defense peptides.</a> Front Cell Infect Microbiol. 10, 228(2020).</li>
<li>Fulcher, M. L., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+and+tracheo-bronchial+respiratory+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture.</a> Methods Mol Biol. 945, 109-121 (2013).</li>
<li>Hao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+modeling+of+SARS-COV-2+infection+of+in+vitro+cultured+polarized+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium.</a> mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).</li>
<li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 994-1003 (2015).</li>
<li>Van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long-term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), e71098(2013).</li>
<li>Pouyanfard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+ameliorate+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis.</a> Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).</li>
<li>Ardini-Poleske, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lungmap%3A+The+molecular+atlas+of+lung+development+program%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lungmap: The molecular atlas of lung development program.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (5), L733-L740 (2017).</li>
<li>Ronaghan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1-like%2C+but+not+m0-+or+m2-like%2C+macrophages%2C+reduce+RSV+infection+of+primary+bronchial+epithelial+cells+in+a+media-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">M1-like, but not m0- or m2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion.</a> PLoS One. 17 (10), e0276013(2022).</li>
<li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (3), 394-403 (2014).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nat Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li>
<li>Firth, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiciliated+cells+in+functional+airway+epithelia+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>12웰 인서트, 0.4 &마이크로; M, 반투명&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>혁신적인 세포 기술</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>All-trans 레티노산 (RA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 레티노산 없음&nbsp;</td><td>써모피셔</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA) 분획 V, 7.5% 용액&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>시그마-알드리치</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CD 14 (FITC)</td><td>BioLegend</td><td>982502</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 PECAM-1(APC)</td><td>R& D 시스템</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>CD 45 (PE)</td><td>BD 생명과학</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CD 68 (PE)</td><td>BioLegend</td><td>33808</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>후지필름</td><td>014-27501</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>디스파제&nbsp;</td><td>스템셀텍</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>R & D 시스템</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD/CD 324 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324107</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D 시스템</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 중간</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM/CD 326 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324212</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D 시스템</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D 시스템</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>피셔</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>포스콜린</td><td>Abcam</td><td>ab120058</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>햄' s F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s 수정된 둘베코' s 매체 (IMDM) + 글루타맥스&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>모노티오글리세롤&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 플러스 키트 (10/케이스)</td><td>줄기세포 Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>줄기세포 Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax&nbsp;</td><td>생명 기술</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>SMA</td><td>Invitrogen</td><td>50-9760-80</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5275</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>VEGF165</td><td>Preprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>세포 신호 전달</td><td>5741S</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (암석 억제제)&nbsp;</td><td>R& D 시스템</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>339100</td><td></td></tr></tbody></table>

폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 ipsc 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

iPSC-Derived Epithelial, Mesenchymal, Endothelial, and Immune Cell Co-Culture to Model Airway Barrier Integrity in Lung Health and Disease

iPSC 유래 기도 오가노이드, 내피 세포, 면역 세포 및 공동 배양의 분화가 성공적으로 완료된 것으로 평가할 수 있는 여러 단계가 있습니다. 차별화는 서로 다른 iPSC 라인에서 수행될 수 있으며, 이 프로토콜은 최소 5개의 서로 다른 라인에서 테스트되었습니다. 프로토콜은 모든 새로운 iPSC 라인에 맞게 조정되어야 하며, 특히 시딩 밀도를 수정하고 최적화해야 합니다.
iPSC 유래 기도 오가노이드의 성공적인 수율은 명시야 를 통해 평가할 수 있으며 정의된 경계/가장자리, 반투명/낭성 형태, 증식/증식 능력, 괴사 세포 부족의 네 가지 특성을 갖습니다. 흐릿하게 보이는 기도 오가노이드는 배양 2주 동안 크기가 증가하지 않으며 괴사가 있는 경우 공동 배양 실험에 사용해서는 안 됩니다. 주변에 두꺼운 발광층이 있는 오가노이드 vs. 반투명/낭성 오가노이드는 후속 실험에 계속 사용할 수 있습니다. 그러나 반투명/낭포성 기도 오가노이드는 주로 기저 세포로 구성되어 있는 반면, 두꺼운 이중막 오가노이드는 주로 곤봉 세포로 구성되어 있습니다. 기저 세포는 쉽게 증식하고 확장하기 때문에 공기-액체 계면 배양 및 분극에 더 적합합니다. iPSC 유래 폐 오가노이드의 성공적인 수율을 평가하는 다른 방법으로는 폐 전구 단계(분화 16일차)에서 성공적인 분화 수율&gt;50% CPM+ 세포)인 표면 마커 CPM(표 1)에 대한 유세포 분석 분석이 있습니다.
기도 오가노이드 해리 및 공기-액체 계기 배양의 경우 ECM 폴리머가 모두 제거되었는지 확인하지 않으면 세포막에서 세포가 확장되는 것을 방지할 수 있습니다. 세포는 공기 리프트 전에 배양 3일차까지 합류해야 합니다. iAirways의 세포 유형 확인은 기저 세포(p63+), 클럽 세포(SCGB1A1+), 배상 세포(MUC5AC+) 및 섬모 세포(AcTub+)와 같은 각 세포 유형별 마커에 대한 염색을 통해 평가할 수 있습니다. 특성화 및 특징적인 폐 세포 유형별 마커는 LungMAP21에서 검증되었습니다. 중간엽은 비멘틴 또는 평활근 액틴에 대한 항체로 검출할 수 있습니다. 더 많은 섬모 세포를 생성하기 위해 배양은 더 오랜 기간 동안 공기 양력을 필요로 하거나 DAPT를 추가해야 할 수 있습니다.
iPSC 유래 내피 세포의 성공적인 수율은 조약돌과 같은 형태를 보여주는 명시야를 통해 평가할 수 있습니다(iPSC 유래 내피 분화 6일차). 성공적인 iPSC 유래 내피 배양에는 &gt;50%의 CD31+ 세포가 포함되어야 하며, 분류 후 수율이 500,000개 이상이 될 수 있도록 충분한 세포가 생성되어야 합니다. 세포는 계대 분석 또는 동결 보존이 가능하며, CD31 마커는 각 계대 또는 새로운 배양과 함께 흐름을 통해 테스트해야 합니다. 세포는 P4 이상으로 계대배양되어서는 안 됩니다. 참고로 iPSC 유래 내피 세포 CD31 정렬(그림 1C) 전/후 내피 세포를 참조하십시오. 내피 세포는 길쭉한 방추 모양의 형태를 가진 큰 세포체로 평평합니다.
대식세포 분화를 위해 배아체는 ULA 웰의 바닥에 남아 있어야 하며 각 웰에는 하나의 EB만 있어야 합니다. 5-7일째까지 낭포성 변화를 보여야 합니다. 원심분리 후 EB를 형성하지 않으면 방사하지 않고 iPSC를 96웰 ULA 플레이트에 시딩합니다. iPSC의 수를 늘려야 할 수도 있습니다. iPSC 유래 면역 세포의 성공적인 수율은 전적으로 배아체(EB)가 낭종으로 발달하는 능력에 달려 있습니다(분화 7일차). 낭종이 발생하지 않는 iPSC 유래 면역 EB는 젤라틴에 도금될 때 기질을 형성하지 않으며 골수성 전구세포를 생성하지 않습니다. 젤라틴 코팅 플레이트로 옮긴 후 EB는 플레이트 바닥에 부착된 상태로 유지되어야 합니다. 플레이트의 이동은 플레이트가 빠지지 않도록 조심스럽게 수행해야 합니다. 플레이트는 일주일에 두 번 수동으로 교체해야 하며, 부유 세포는 Mac-CM2로 계대배양하거나 동결 보존해야 합니다. 또한, 부유골수성 전구세포를 채취한 후, 코팅되지 않은 플라스틱 플라스크에 부착하고, 대식세포를 나타내는 액포가 있는 명시야 아래에 밝은 세포를 생성해야 합니다. 단핵구의 마커인 CD14+는 부유 세포에서 &gt;90%여야 합니다. 대식세포 마커인 CD68은 시간이 지남에 따라 증가해야 하며, 대식세포의 ~50%가 2주 후에 CD68+를 발현합니다(그림 1D). 접착 효율은 각 세포주에 대해 결정되어야 합니다. 우리는 평균 20%의 접착 효율을 달성합니다. 분극의 경우, M0 대식세포는 분화 배지 II에서 48시간 동안 M1(iPSC-M1) 또는 M2(iPSC-M2) 대식세포로 분극화되며, M1 분극의 경우 100ng/mL LPS 및 20ng/mL IFN-g 또는 M2 분극의 경우 50ng/mL IL-4 및 20ng/mL IL-13. M1 편광의 마커는 CD80+이고 M2 편광은 CD206+입니다.
삼중 공동 배양의 성공적인 생성은 상피 밀착 접합 마커 EPCAM, ECAD 또는 ZO-1 또는 내피 밀착 접합 마커 CD31에 대한 면역 형광을 통해 평가할 수 있습니다(그림 2C, 표 1). 삼중 공동 배양의 기능은 또한 TEER(trans-electrical epithelial/endothelial resistance)을 통해 평가할 수 있습니다. 잘 조립된 기도 오가노이드 및 내피 공동 배양은 전기 저항이 더 커서 최적의 세포 통신 및 연결을 나타냅니다. 전자 담배 또는 바이러스 챌린지와 같은 환경적 모욕은 상피 및 내피 장벽의 무결성을 손상시켜 공동 배양의 전기 저항을 감소시키고(그림 3A, B) 무질서한 밀접 접합부(그림 3C)를 초래합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig01v2.jpg"> 
그림 1: iPSC 유래 기도 상피, 내피 및 면역 배양의 차별화 및 특성화. (A) iAirways 조립을 위한 iPSC 지시 분화의 개략도. (B) EPCAM 및 ECAD에 대한 명시야(왼쪽) 및 유세포 분석 분석(오른쪽)을 특징으로 하는 iPSC 유래 기도 상피 오가노이드. (C) CD31에 대한 명시야(왼쪽), 면역형광 및 유세포 분석 분석(오른쪽)을 특징으로 하는 iPSC 유래 기도 내피. CD31 정렬 후의 각 명시야가 오른쪽에 표시됩니다. (D) iPSC 유래 대식세포는 범조혈 마커 CD45, 단핵구 메이커 CD14 및 대식세포 마커 CD68에 대한 명시야(왼쪽) 및 유세포 분석(오른쪽)을 특징으로 합니다. 스케일 바: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig02.jpg"> 
그림 2: iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 대식세포 세포의 공동 배양. (A) iAirways 조립의 개략도. (B) 각각의 상피 및 내피 단일배양, 상피 및 내피 이중 배양, 상피, 내피 및 대식세포 공동 배양의 명시야 이미지. red cytotracker로 태그된 대식세포. 스케일 바: 100μm. (C) 세포 배양 삽입물의 정점 쪽에 있는 밀착 접합 마커 ZO-1 및 기저측 쪽에 CD31에 대한 면역형광 염색. 스케일 바: 100μm. (D) 정점 쪽에 해리된 기도 오가노이드가 있는 세포 배양 삽입물의 단면, 에어 리프트 후 1주일. 검은색 화살표로 염색된 H&amp;E가 있는 왼쪽 패널은 섬모 세포를 보여줍니다. 면역형광 이미징이 있는 중간 패널은 상피 마커 E-cadherin(ECAD)을 보여줍니다. 면역형광 이미징이 있는 오른쪽 패널에는 비멘틴(VIM) 및 평활근 액틴(SMA)과 같은 중간엽 마커가 표시됩니다. 스케일 바: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig03.jpg"> 
그림 3: 전자 담배 및 바이러스에 노출된 iAirways의 기도 장벽 기능 변화.(A) TEER(trans-electrical epithelial/endothelial resistance) 측정 도구의 개략도. (B) 미디어에 멘톨 전자 담배를 첨가한 지 7일 후 TEER의 막대 그래프. 평균 +/- 95% 신뢰 구간. N = 5 개의 생물학적 복제 및 3 개의 기술 복제; p-값 &lt;0.001. (C) SARS-CoV-2 감염 전후 밀접연접 단백질 ZO-1에 대한 면역형광 염색. 감염 후 ZO-1의 무질서한 레이아웃에 주목하십시오. 스케일 바: 50μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>항체</td>
			<td>신청</td>
			<td>희석</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 31 PECAM-1(APC)</td>
			<td>유세포 분석(FC)</td>
			<td>100ul 버퍼에서 10μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPCAM/CD 326 (APC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-CAD/CD 324(고속철)</td>
			<td>FC</td>
			<td>100ul 버퍼에서 5μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPM 증폭</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 45 (체육)</td>
			<td>FC</td>
			<td>100ul 버퍼에서 5μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 14 (핏츠)</td>
			<td>FC</td>
			<td>100ul 버퍼에서 5μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 68 (체육)</td>
			<td>FC</td>
			<td>100ul 버퍼에서 5μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>조-1</td>
			<td>면역형광(IF)</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>비멘틴</td>
			<td>면</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>면</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: FACS 및 면역형광에 사용되는 항체.
보충 파일 1: 미디어 및 버퍼 조성물. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

Human lung tissue is composed of an interconnected network of epithelium, mesenchyme, endothelium, and immune cells from the upper airway of the ...

ipsc-derived-epithelial-mesenchymal-endothelial-immune-cell-co

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기에 제시된 1 차적인 인간 혈액 단화 절연을 위한 프로토콜은 대식세포 및 수지상 세포로의 분화뿐만 아니라 다세포 인간 폐 모델로 상피 세포를 조립한다. 염증 성 자극에 노출되면 갓 분리되거나 해동 된 단핵구로부터 분화 된 면역 세포로 구성된 공동 배양의 생물학적 반응이 비교됩니다.

유해 성 평가를 위한 상피 세포 및 1 차적인 면역 세포로 구성된 다세포 인간 폐포 모형

이 기사는 인간 폐의 근위 및 원위 영역으로부터 생존 가능한 상피 세포의 농축을 허용하는 조직 해리 및 세포 분획화 접근법에 대한 상세한 방법론을 제공한다. 본원에서 이러한 접근법은 3D 오가노이드 배양 모델의 사용을 통한 폐 상피 전구 세포의 기능적 분석에 적용된다.

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

본 프로토콜은 인간 유도만능줄기세포 유래 제2형 폐포 상피유사세포(iAT2s)를 기술한다. 이들 세포는 3D 배양물에서 자가재생 구체로서 배양되거나 공기-액체 계면(ALI) 배양에 적응될 수 있다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 유형 2 폐포 상피 세포의 3D 구체 및 2D 공기-액체 계면 배양 생성

인간 유도 만능 줄기 세포 분화 프로토콜의 최근 발전은 기관 특이적 세포 유형의 단계적 유도를 허용한다. 여기에서, 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포의 유지 및 확장과 공기-액체 계면 배양물에서 점막 상피로의 분화를 위한 상세한 단계를 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

제시된 프로토콜은 미세유체 동적 배양 채널과 기존의 고정 웰 정적 배양 챔버에서 부착 세포층 구조를 시각화하기 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색 기술의 개발 및 사용을 설명합니다. 이 접근법은 세포층 밀도, 단층 형성 및 층 두께 균일성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가

여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

이 보고서는 혈액-뇌 장벽 모델 구축을 위한 μSiM 플랫폼의 조립, 세포 배양 및 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

여기에서는 인간 식도 오가노이드 배양 및 공기-액체 계면 배양을 위한 프로토콜을 제공합니다. 식도 오가노이드의 공기-액체 계면 배양은 식도 상피 장벽에 대한 사이토카인의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

호산구성 식도염의 상피 장벽을 조사하기 위한 3차원 세포 배양 모델 

여기에서는 만성 담배 연기 추출물(CSE)에 대한 적응에 초점을 맞춘 쥐 기도 상피 세포를 분리하고 분화하기 위한 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 모델은 CSE의 다중 오믹스 영향을 종합적으로 특성화하는 데 활용될 수 있으며, 이는 만성 연기 노출 시 세포 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

담배 연기 추출물로 자극된 쥐 기도 상피 세포에서 다중-오믹스의 분화 및 변화를 연구하기 위한 시험관 내 모델

이 프로토콜은 신생아 마우스와 사춘기 쥐에서 개별 난소에서 난소를 사용하여, 마우스 난소 조직의 주요 문화 / 공동 문화를 설명합니다. 배양 기술은 난소에 외인성 제제의 효과의 조사를 가능하게하여 생리 고도로 개발을 지원하고, 난포 사이의 상호 작용.

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

배우세요 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 대식세포를 이용한 기도 장벽 공동 배양 모델링 방법. 이 기술은 폐 건강 및 질환 연구에 활용됩니다.

폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

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