키메라 항원 수용체 T 세포에서 체외 게놈 와이드 CRISPR 녹아웃 스크리닝 수행

Car T 세포 요법은 10년 이상 지속되는 관해를 이끌어온 혁신적인 유형의 암 면역요법입니다. 그러나 지속적인 응답률은 여전히 제한적입니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 내성 뒤에 있는 메커니즘에 대한 이해를 높이고 CAR T 세포 요법에 대한 반응을 개선하기 위한 도구를 만드는 것을 목표로 합니다.

현재 병용 요법 및 CAR 설계 최적화를 포함하여 CAR T 세포 요법을 개선하기 위해 많은 접근 방식이 사용되고 있습니다. 그러나 주입 전 CAR T 세포 제품의 후생유전학적 프로필이 중요한 결정적 반응이라는 증거가 증가함에 따라 유전자 편집 기술이 널리 사용되는 도구가 되었습니다.

CAR T 세포의 게놈 편집은 전임상 및 임상 연구에서 독성을 예방하고 CAR T 세포의 확장 및 지속성을 증가시키는 데 성공한 것으로 나타났습니다. 게놈 전체 CRISPR 녹아웃 스크리닝을 위한 당사의 프로토콜은 CAR T 세포 기능을 개선하기 위한 최상의 유전자 편집을 결정하기 위한 효율적이고 편견 없는 접근 방식을 제공합니다.

게놈 전체의 유전자 교란이 효과적이려면 대규모의 적절한 선택 조건이 필요합니다. CAR T 세포 고갈의 발달을 연구하기 위해 우리는 최적의 유전자 편집을 선택하기 위해 2주 동안 8천만 개 이상의 CAR T 세포를 자극해야 한다는 것을 배웠습니다.

우리의 프로토콜은 탈진의 발달을 평가하도록 설계되었지만 이 프로토콜은 다른 저항 메커니즘의 발달을 평가하도록 조정될 수 있습니다. 다양한 환경에서 게놈 전체 스크리닝을 완료함으로써 결국 CAR T 세포 요법에 대한 전반적인 반응을 개선하기 위한 최상의 편집을 결정할 수 있습니다.

[해설자] CRISPR 라이브러리로 CAR T 세포를 형질도입한 후, 시료를 섭씨 4도에서 5분 동안 300g에서 원심분리하여 세척합니다. 상청액을 흡인하고 샘플을 20밀리리터의 T 세포 배지에 재현탁합니다. 차세대 시퀀싱을 위해 샘플을 보존하려면 가이드 RNA당 500개 세포의 가이드 RNA 표현을 유지하기 위해 충분한 CAR T 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 분취합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 5분 동안 300g에서 원심분리합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 1밀리리터의 PBS에 재현탁하고 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 50밀리리터 원추형 튜브를 1밀리리터의 PBS로 세척하고 세척액을 동일한 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 5분 동안 500g에서 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 섭씨 -20도에서 보관합니다. 공동 배양을 시작하려면 CAR T 세포를 CD19 양성 JeKo-1 세포에 1:1 비율로 추가합니다. T 세포 배지로 공동 배양의 총 부피를 160밀리리터로 가져오고 샘플을 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37도의 인큐베이터에 보관합니다. CAR T 세포를 재자극하려면 공동 배양을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 수집하고 샘플을 섭씨 4도에서 5분 동안 300g에서 원심분리합니다. 각 샘플을 80밀리리터의 T 세포 배지에 재현탁하고 80밀리리터의 T 세포 배지에 6개의 JeKo-1 세포의 거듭제곱에 80곱하기 10을 첨가합니다. 샘플을 섭씨 37도의 인큐베이터에 5% 이산화탄소로 보관합니다. 15일째에 공동 배양에서 CAR T 세포를 분리하기 위해 먼저 세포를 계산합니다. CD4 양성 T 세포에 대한 양성 선택 키트와 CD8 양성 T 세포에 대한 양성 선택 키트를 결합하여 CAR T JeKo-1 공동 배양에서 T 세포를 분리합니다. 그런 다음 분리된 T 세포를 계산합니다. 차세대 시퀀싱을 위해 샘플을 보존하려면 6개의 CAR T 세포의 거듭제곱으로 33 x 10을 50밀리리터 원추형 튜브에 분취하고 샘플을 섭씨 4도에서 5분 동안 300g으로 원심분리합니다. 세포 펠릿을 1밀리리터의 PBS에 재현탁하고 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 50밀리리터 원추형 튜브를 1밀리리터의 PBS로 세척하고 세척액을 동일한 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 샘플을 원심분리하고 상청액을 제거한 후 세포 펠릿을 섭씨 -20도에서 보관합니다. 시작하려면 게놈 DNA 분리 키트를 사용하여 냉동 CAR T 세포 펠릿에서 게놈 DNA를 분리합니다. 먼저 100% 에탄올을 섭씨 -20도로 사전 냉각하여 에탄올 침전을 통해 분리된 게놈 DNA를 정제합니다. 용출된 DNA를 여러 개의 미세 원심분리기 튜브에 균등하게 분취하여 각 분취량이 200-250마이크로리터가 되도록 합니다. 미리 냉각된 100% 에탄올 2부피, 3몰 아세테이트나트륨 0.1부피, 글리코겐 밀리리터당 20밀리그램 1마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 섭씨 -20도에서 밤새 배양합니다. 둘째 날에는 샘플을 13,000g에서 20분 동안 회전시켜 침전된 DNA를 펠릿화합니다. 상청액을 제거하고 펠릿을 7,500g에서 10분 동안 회전시켜 70% 에탄올 1밀리리터로 세척합니다. 펠릿을 완전히 건조시킨 후 펠릿을 50마이크로리터의 멸균수에 재현탁합니다. 차세대 시퀀싱을 위해 게놈 DNA를 준비하려면 여기에 표시된 지정된 반응 혼합물로 PCR을 설정합니다. 그런 다음 다음 사이클링 조건을 사용하여 PCR을 수행합니다. 각 샘플에 대한 PCR 반응을 가져오고 제조업체의 지침에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. 2% 아가로스 겔에 각 샘플에 대해 3마이크로그램의 PCR 산물을 실행합니다. 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 추출하여 겔에서 PCR 산물을 제거합니다. 추출된 샘플을 섭씨 -20도에서 보관하십시오.