Name: Stereotaxic Device를 이용한 뇌종양에 대한 Orthotopic Patient-derived Xenograft Models 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 정확한 스테레오택틱 기법을 이용한 소아 뇌종양 정위적 환자유래 이종이식 모델 구축 방법을. 종양 이식 모니터링과 면역조직화학 분석을 통해 치료 효과를 연구합니다.

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<ol><li>Mueller, S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+brain+tumors%3A+current+treatment+strategies+and+future+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Pediatric brain tumors: current treatment strategies and future therapeutic approaches.</a> Neurotherapeutics. 6 (3), 570-586 (2009).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>마취제(예: 이소플루란)</td><td>머 크</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>머 크</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>NA</td><td>NA</td><td>멸균수로 희석하여 100% 에탄올로 70% 에탄올을 만듭니다.</td></tr><tr><td>에탄올 80%</td><td>NA</td><td>NA</td><td>멸균수로 희석하여 100% 에탄올을 80% 만듭니다.</td></tr><tr><td>접착식 현미경 슬라이드</td><td>머 크</td><td>Z681156</td><td></td></tr><tr><td>진통제(부프레노르핀 0.3mg/mL)</td><td>주록스</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>탄소 필터 캐니스터</td><td>수의사 장비</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>원추형 튜브 15mL(Falcon)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 50mL(Falcon)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>머 크</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>이어바</td><td>코프</td><td>1921</td><td></td></tr><tr><td>ECM 하이드로겔(Matrigel, Corning)</td><td>머 크</td><td>E1270</td><td></td></tr><tr><td>눈 연고(Poly Visc)</td><td>화학자다이렉트&nbsp;</td><td>719986</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 세럼</td><td>머 크</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>유리 마이크로 주사기</td><td>해밀턴</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올 물티슈</td><td>메디사</td><td>SUL_LWMS-1</td><td></td></tr><tr><td>KI67 항체</td><td>아브캠</td><td>ab209897</td><td></td></tr><tr><td>미세 원심분리기 튜브</td><td>에펜도르프</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>마이크로드릴 비트&nbsp; 0.028인치</td><td>코프</td><td>8170</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 주입 장치</td><td>코프</td><td>5004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>머 크</td><td>P4474</td><td></td></tr><tr><td>피펫 10mL</td><td>코 닝</td><td>CLS4488</td><td></td></tr><tr><td>피펫 1mL&nbsp;</td><td>에펜도르프</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>피펫 200uL</td><td>에펜도르프</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>피펫 20uL</td><td>에펜도르프</td><td>3123000098</td><td></td></tr><tr><td>피펫 25mL</td><td>코 닝</td><td>CLS4489</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 1mL</td><td>코 닝</td><td>CLS4868</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 200uL</td><td>코 닝</td><td>CLS4860</td><td></td></tr><tr><td>폴리소르베이트 20 세제(F10SC)</td><td>건강 및 위생</td><td>지3070</td><td></td></tr><tr><td>맥박 산소 측정기(MouseSTAT)</td><td>켄트 사이언티픽</td><td>SPO2-MSE</td><td></td></tr><tr><td>리오딘(포비돈-요오드)</td><td>머 크</td><td>Y0000466</td><td></td></tr><tr><td>메스(일회용)</td><td>메디사</td><td>SUL_SCALPEL</td><td></td></tr><tr><td>스킨 글루 베트본드</td><td>메디사</td><td>3M_1469SB</td><td></td></tr><tr><td>디지털 디스플레이 콘솔이 있는 작은 동물 정위 기기&nbsp;</td><td>코프</td><td>940</td><td></td></tr><tr><td>정위 훈련&nbsp;</td><td>코프</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>온도 모니터링 시스템&nbsp;</td><td>하버드 장치</td><td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>머 크</td><td>93595</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic device를 이용한 뇌종양에 대한 orthotopic patient-derived xenograft models 구축

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

정위 장치를 사용한 정위 주사는 뇌종양 모델 개발에 필수가 되었습니다. 이 기술을 사용하면 종양 세포를 정확하고 재현 가능한 배치할 수 있으며, 이는 신경 종양학 연구에서 일관되고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하는 데 매우 중요합니다. 정위 주사의 성공적인 구현은 일반적으로 입체 주사 프레임, 정확한 움직임을 위한 디지털 미세 조작기, 주사 주사기 및 동물을 움직이지 못하게 하는 마취 시스템을 포함하는 정위 장비의 정확한 설정에 크게 의존합니다(그림 1A, B). 유리 마이크로주사기를 사용하면 일반적으로 2-5μL 사이의 소량을 두개내 주입할 수 있습니다. 주입을 막을 수 있는 생물학적 물질의 축적을 방지하기 위해 적절한 유지 관리와 잦은 세척이 필수적입니다(그림 1C).
생쥐에서 입체택시 장비를 사용하여 뇌종양 세포를 두개내 주입하는 절차에는 몇 가지 주요 단계가 포함됩니다. 첫째, 마우스는 시술 내내 가만히 있고 편안하게 유지되도록 마취됩니다. 동물이 마취되었음을 나타내는 일반적인 신호에는 발가락을 꼬집을 때 움직임과 반사 신경이 없는 것뿐만 아니라 규칙적인 호흡 패턴의 존재가 포함됩니다. 그런 다음 마우스를 입체성 프레임에 놓고 머리를 고정된 위치에 고정합니다(그림 2A). 브레그마(bregma)와 람다(lambda)와 같은 두개골의 랜드마크를 사용하여 주입을 위한 정확한 좌표를 결정합니다. 두피를 작게 절개하고 선택한 좌표로 두개골을 통해 버 구멍을 뚫습니다(그림 2B). 정위 팔에 부착된 미세 주입 바늘을 버 구멍을 통해 삽입하여 종양 세포를 원하는 뇌 영역(피질, 소뇌 또는 뇌간; 그림 2C). 바늘 위치를 주의 깊게 모니터링하고 조정하면 정확한 조준이 보장됩니다. 주입 후 바늘을 천천히 빼내고 절개 부위를 닫습니다(그림 2D). 봉합된 상처는 두개내 주사 후 2주 이내에 치유될 것으로 예상됩니다.
두개내 주사 후 동물은 전반적인 건강 상태와 종종 종양 진행을 나타내는 신경학적 증상의 발달에 대한 신중한 모니터링이 필요합니다(보충 표 1). 일반적으로 동물은 주사 후 1주 동안 약간의 체중 감소를 경험할 수 있으며(최대 체중의 최대 10%), 일반적으로2주가 끝날 때까지 주사 부위가 완전히 밀봉되면 안정화됩니다. 일반적으로 동물은 체중이 꾸준히 증가하고 종양이 진행될 때까지 전반적인 건강을 유지합니다. 신경학적 증상의 발현은 뇌종양의 유형, 주사 부위 및 동물 균주와 같은 요인에 따라 다릅니다. 예를 들어, 피질 신경교종(cortical gliomas) 또는 뇌실막종(ependymomas)은 점진적인 체중 감소와 잠재적인 전뇌 비대를 동반할 수 있는 반면, 뇌간 신경교종(brainstem gliomas)과 수모세포종(medulloblastomas)은 특히 면역력이 저하된 동물에서 운동 실조증 및 머리 기울어짐과 같은 증상을 나타낼 수 있습니다(그림 3A). 또한 뇌간 종양이 있는 동물, 특히 NSG 또는 NOD/SCID 균주에서 빙빙 도는 행동이 관찰될 수 있습니다. 신경학적 증상의 진행은 종종 점진적인 체중 감소와 일치합니다. 노즐이 긴 물병을 제공하거나 부드러운 음식(흐물흐물한 음식 알갱이) 또는 씨앗을 제공하는 것과 같은 적절한 사후 관리 조치는 동물의 복지를 지원하는 데 필수적입니다. 실험 종말점에 도달하고 동물에 대한 후속 인도적 안락사에 도달하면, 주사 부위의 확대 및/또는 출혈 부위의 존재를 포함하여 뇌의 잠재적인 변화가 명백해질 수 있습니다(그림 3B).
Kaplan-Meier 그래프는 일반적으로 뇌종양 동물 모델의 생존 결과를 묘사하는 데 사용됩니다. 그들은 두개내 주사 또는 항암 치료 후 시간이 지남에 따라 생존 확률을 시각적으로 묘사합니다. 이러한 그래프는 전임상 연구 환경에서 생존 데이터를 분석하고 제시하는 데 중요한 도구 역할을 합니다15,27. 우리는 소뇌의 다양한 세포 밀도에서 수모세포종 세포 배양 D425의 두개내 주사를 수행했습니다. 모든 동물은 두개내로 주입되어 종양이 발생했다. 그 결과, 세포 밀도가 높을수록 마우스당 50,000개 및 100,000개의 세포가 10,000개의 세포보다 더 빠르게 생착되는 것으로 나타났습니다(그림 4). 또한, 환자 유래 고급 신경교종(HGG) 세포를 두개골 내 피질과 뇌간에 주입하여 이러한 다양한 위치에서 전체 생존과 종양 성장 패턴, 면역조직화학적 특징을 비교했습니다. 위치에 관계없이 모든 동물에게 두개내에서 발생한 종양을 주입했습니다. HGG 세포의 배양은 1.1 단계 내지 1.10 단계에 자세히 설명 된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 두개내 주사를 위한 세포의 준비는 단계 2.1 내지 2.6에 기술된 바와 같이 수행되었으며, 두개내 주사 절차는 단계 4.1 내지 4.16에 설명된 방법을 따랐다27. 피질에 주입되었을 때, HGG 세포는 두개내 주사 후 약 25일의 평균 생존율을 보였습니다(그림 5A). 5.1 단계에서 5.4 단계에 설명된 대로 동물을 모니터링했습니다. 이 동물들은 신경학적 증상을 보이지 않았지만 점진적인 체중 감소를 보였습니다. 동물은 5.5단계에서 설명한 인도적 종점에 도달한 후 인도적으로 안락사되었습니다. 6.1 단계에서 6.5 단계에 상술된 프로토콜에 따라 뇌를 채취하여 추가 분석을 위해 보냈다27. 면역조직화학 분석을 통해 혈관화가 증가하고(그림 5B) 많은 증식성 Ki67 세포(그림 5C)가 있는 크고 핵이 많은 종양 덩어리가 밝혀졌습니다. 뇌간에 주입했을 때, HGG 세포는 두개내 주사 후 약 26일의 평균 생존 기간을 보였습니다(그림 5D). 면역조직화학 분석은 제4뇌실/상부 교구 영역에서 큰 종양 덩어리와 외측 심실로의 연수막 침투를 보여주었습니다(그림 5E). 추가 면역조직화학 분석에서는 뇌간 및 기타 침투 부위에 많은 증식 세포가 있는 것으로 나타났습니다(그림 5F). 이 실험은 동일한 종양 세포를 다른 해부학적 위치에 주입하는 것이 성장 패턴에서 약간의 차이가 관찰되기는 하지만 종양 성장 속도에 영향을 미치지 않는다는 것을 강조합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig1.jpg"> 
그림 1: 뇌종양 세포의 두개내 주입을 위한 입체성 설정의 대표적인 이미지. (A) 마취 장치는 일반적으로 BSC 후드 옆에 위치하며, 이는 유도 챔버와 정위 장치 모두에 마취의 이중 투여를 필요로 합니다. (B) 유리 마이크로 주사기 세척 스테이션 및 입체 홀더; 주사기는 식염수, 에탄올로 씻어내야 하며, 두개내 주사를 맞을 때마다 물을 주입해야 합니다. (C) 마취실, 드릴링 머신, 입위 장치, 입위 좌표 콘솔, 면 팁, 메스, 핀셋, 피펫 및 팁을 보여주는 BSC 후드 내부의 입체 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig2.jpg"> 
그림 2: 면역이 저하된 마우스에서 수행되는 두개내 주사의 대표적인 이미지. (A) 마취 원뿔에 배치된 마취된 동물. (B) 피부 절개 후 이어 바로 양쪽에 피부를 고정합니다. (C) 주입을 위해 뚫린 구멍 위에 배치된 유리 마이크로 주사기. (D) 피부는 접착되면 모호크 스타일을 형성합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig3.jpg"> 
그림 3: 뇌종양 세포 생착 후 관찰된 잠재적인 신경학적 증상. (A) 뇌간에 DMG 세포의 두개내 주입 후 머리 기울기를 보이는 동물. (B) 주사 측이 종양 형성을 드러내는 우측 피질 반구의 비대. 동물에게 뇌실막종 세포를 주입했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig4.jpg"> 
그림 4: 다양한 세포 밀도에서 수모세포종 배양 D425의 생착. 수모세포종 세포는 2μL의 ECM 하이드로겔, 50,000개 세포 및 100,000개 세포에 10,000개의 세포 밀도로 입체택시 장비를 사용하여 두개내 주입되었습니다. 동물들은 점진적인 체중 감소를 모니터링했으며 기록된 최고 체중보다 20% 낮아지면 인도적으로 안락사되었습니다. 10,000개의 세포를 주입받은 동물의 평균 생존 기간은 29일이었고, 50,000개와 100,000개의 더 높은 세포 밀도를 주입한 동물의 평균 생존 기간은 각각 17.5일과 15일이었다. 이 연구에서 주입된 모든 동물은 성공적으로 종양을 발생시켰습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig5v2.jpg"> 
그림 5: 피질과 뇌간에서 HGG 세포를 두개골 내에 주입한 NSG 동물의 대표적인 생존 곡선 및 조직학적 분석. 약 100,000 HGG 세포(통로 3)를 입체택시 장비를 사용하여 2μL의 ECM 하이드로겔에 주입했습니다. 동물들은 점진적인 체중 감소를 모니터링했으며 기록된 최고 체중보다 20% 낮아지면 인도적으로 안락사되었습니다. 이 뇌종양 아형에 대한 신경학적 증상은 관찰되지 않았습니다. (A) HGG 세포가 피질에 주입된 동물의 평균 생존 기간은 주입 후 약 25일(N=2)입니다. (B) 피질의 H&amp;E 염색은 적혈구의 존재로 나타나는 혈관화가 증가된 고도로 핵이 많은 영역을 보여줍니다. (C) 피질의 종양 생착 부위는 KI67 염색에서 알 수 있듯이 높은 수준의 증식 세포를 나타냅니다. (D) HGG 세포를 뇌간에 주입한 동물의 평균 생존 기간은 주사 후 약 26일(N=2)입니다. 이 연구에서 주입된 모든 동물은 성공적으로 종양을 발생시켰습니다. (E) 뇌간의 H&amp;E 염색은 외측심실의 연봉(leptomeninges)에서 관찰된 종양 침투와 함께 고도로 핵이 있는 영역을 보여줍니다. (F) 뇌간의 종양 생착 부위는 KI67 염색에서 알 수 있듯이 높은 수준의 증식 세포를 나타냅니다. 메인 이미지의 검은색 눈금 막대는 2mm를 나타내는 반면 확대된 삽입 이미지는 20μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 동물의 두개후 주사 및 항암제에 대한 잠재적 치료를 검사하는 데 사용되는 모니터링 양식. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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