Name: 절제된 관류 마우스 심장에서 내재적 심장 자율 뉴런의 광유전학적 활성화(Optogenetic Activation of Intrinsic Cardiac Autonomic Neurons in Excised Perfused Mouse Hearts) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T12:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 배우세요 절제된 관류 마우스 심장에서 광유전학을 이용한 내재적 심장 자율 뉴런의 활성화 방법을. ChAT 뉴런 광자극과 심박수 변화를 관찰하여 교감신경과 부교감신경계의 상호작용을 연구할 수 있습니다.

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모든 동물 프로토콜은 조지 워싱턴 대학의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드를 따랐습니다.
1. 마이크로 LED 광원 건축
<ol>
	<li>환기가 잘 되는 곳의 해부 현미경을 사용하여 길이가 20cm 이상인 두 개의 절연 구리선의 벗겨진 끝을 465nm 마이크로 LED의 접점에 납땜합니다(그림 1). LED를 전원에 연결하고 전원을 켜서 납땜을 테스트하십시오.</li>
	<li>200μL 여과된 피펫 팁의 바닥을 1cm 자릅니다. 직경이 작은 막대를 사용하여 필터를 밀어냅니다. LED가 팁 끝과 같은 높이가 되도록 와이어가 있는 마이크로 LED를 피펫 팁에 삽입합니다. 피펫 팁 상단의 필터를 교체하여 LED와 전선을 제자리에 고정한 다음 LED 가장자리를 피펫 팁에 과접착합니다. 초강력 접착제를 건조시킵니다.</li>
	<li>베이스와 경화제를 10:1의 비율로 결합하여 실리콘 엘라스토머를 준비하고 잘 혼합합니다. 진공 챔버를 사용하거나 원심분리를 통해 혼합물에서 기포를 제거합니다.</li>
	<li>0.5mL 원심분리기 튜브를 사용하여 LED를 더 쉽게 제거할 수 있도록 측면에 점수를 매깁니다(원하는 경우 여기에서 튜브 내부에 윤활제를 추가할 수도 있음). 누출이 없도록 튜브 외부를 테이프로 감습니다. 약 0.2mL의 실리콘 엘라스토머 혼합물을 튜브에 붓고 마이크로 LED 피펫 팁을 튜브에 넣고 LED와 튜브 바닥 사이에 최소 1mm의 공간을 남겨둡니다. 거품이 형성되면 단단한 표면에 원심분리기 튜브를 두드려 거품을 제거합니다. 참고: 피펫 팁은 LED를 배치할 때 기포 형성을 줄이기 위해 실리콘 엘라스토머로 선제적으로 코팅할 수 있습니다.</li>
	<li>원심분리기 튜브 micro-LED를 50°C 실험실 오븐이나 인큐베이터에 똑바로 세우고 최소 8시간 또는 밤새 그대로 둡니다. 오븐과 상호 작용할 때는 내열 장갑을 착용하십시오. 엘라스토머가 굳어지면 원심분리기 튜브에서 LED를 제거합니다. 엘라스토머가 여전히 끈적거리면 오븐에 다시 넣으십시오.</li>
	<li>완전히 경화되면 정밀 유틸리티 나이프로 LED 끝에서 여분의 엘라스토머를 제거하고 1mm 이하를 남겨둡니다. LED를 적절하게 캡슐화하면 광자극 중 조직의 가열을 최소화할 수 있습니다.</li>
	<li>광 파워 미터를 사용하여 LED의 광 전력을 확인합니다. 파워 미터를 켜고 465nm를 읽도록 파장 설정을 조정합니다. LED를 포토다이오드 전력 센서와 나란히 놓고 함수 발생기로 LED를 켭니다. 광 파워 미터는 와트 단위의 판독값을 생성합니다. 전력 판독값을 조명된 표면의 면적(0.88mm2)으로 나누어 방사 조도를 계산합니다. 알림: 이상적인 방사 조도는 ChR211의 적절한 활성화를 위해 약 2.4mW/mm2여야 합니다.</li>
</ol>
2. 실험 준비
<ol>
	<li>이전 간행물에 따라 콜린성 뉴런(ChAT-ChR2) 또는 카테콜아민성 뉴런(TH-ChR2)에서 ChR2를 발현하도록 마우스를 사육합니다(그림 2). 앞서 설명한 바와 같이 유전형 분석 접근법을 사용하여 실험에 사용된 마우스에서 TH-Cre 또는 ChAT-Cre의 발현을 확인합니다12.</li>
	<li>최소 225mL의 Krebs-Henseleit(KH) 용액(mM: 118 NaCl, 4.7 KCl, 1.25 CaCl2, 0.57 MgSO4, 25 NaHCO3, 1.17 KH2PO4, 6 glucose)을 준비하고 0.2 μm 질산 셀룰로오스 멤브레인 필터를 사용하여 필터링합니다. 95% O2 및 5% CO2를 사용하여 산소화할 때 pH를 7.4로 조정합니다.</li>
	<li>실험 전에 Langendorff 관류 시스템을 정제수로 헹구고 실험을 시작하기 전에 과도한 물을 제거하십시오.</li>
	<li>KH가 순환되기 전에 10μm 멤브레인 필터를 시스템에 추가합니다. 2-5mL/분 사이의 유속에서 37°C의 관류액 온도를 유지하도록 설정된 수조를 켭니다.</li>
	<li>175mL의 KH를 관류 시스템에 추가하고 순환을 시작합니다. 용액을 95% O2 / 5% CO2 로 거품을 일으켜 적절한 산소화를 제공합니다. 알림: KH 순환량은 튜브 및 저장소 크기에 따라 시스템마다 다릅니다.</li>
	<li>스톱콕으로 관류 시스템을 통한 흐름을 중지하고 유량계의 Zero Button 을 눌러 유량계를 보정합니다.</li>
	<li>LabChart와 같은 생리학적 데이터 수집 소프트웨어를 준비하여 12개의 채널(심욕 온도, 대동맥 관류액 온도, ECG 리드 I-III과 4개의 추가 계산 리드, 심박수 계산, 유량 및 LED 펄스를 추적하기 위한 함수 발생기 출력)을 가질 수 있습니다.</li>
	<li>심박수용으로 예약된 채널을 사용하여 리드 I에서 마우스 ECG를 감지하도록 설정된 순환 측정 기능으로 LabChart에서 심박수를 계산합니다. LabChart의 심장 축 확장은 리드 I과 리드 II를 사용하여 리드 III, aVR, aVL 및 aVF를 계산합니다.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig1.jpg"> 
그림 1: 마이크로 LED 구조. 마이크로 LED 광원을 구성하기 위한 단계에 대한 단순화된 개요입니다. 두 개의 와이어를 마이크로 LED에 납땜하고 200μL 피펫 팁에 삽입한 다음 초접착합니다(1단계). 실리콘 엘라스토머를 10:1 비율로 혼합하고 진공 챔버에 넣어 기포를 제거합니다(2단계). 실리콘 엘라스토머를 마이크로 원심분리기 튜브에 붓고 마이크로 LED 피펫 팁을 삽입하여 밤새 경화시킵니다(3단계). 그런 다음 절연된 마이크로 LED를 튜브에서 제거하고 여분의 실리콘을 트리밍해야 합니다(4단계). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig2.jpg"> 
그림 2: 형질전환 마우스 육종 계획. lox-dependent ChR2 유전자를 가진 부모 마우스는 Cre promoter를 가진 다른 마우스와 교배됩니다. 티로신 하이드록실라제(TH) Cre 프로모터를 가진 부모 마우스는 이형접합 자손을 생산하며, 50%는 카테콜아민성 세포에서 ChR2를 발현합니다. 콜린 아세틸전이효소(ChAT) Cre 프로모터를 가진 부모 마우스는 콜린성 세포에서 ChR2를 100% 발현하는 동형접합 자손을 생산합니다. 발현은 유전형 분석을 통해 확인됩니다. 이 그림은12의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 심장 절제 및 관류
<ol>
	<li>절제 전에 1mL 주사기를 사용하여 복강 내 주사로 헤파린 250단위(약 8U/g)를 투여합니다. 수술 10분 전에 최소 10분 정도 기다리세요.</li>
	<li>성체 쥐를 마취 유도실에 넣습니다. ~4%의 이소플루란을 투여하고 호흡 수가 느려지고 깊어질 때까지 기다립니다. 챔버에서 마우스를 제거하고 경추 탈구를 수행하기 전에 발가락 꼬집기로 통증 반사가 중단되었는지 확인합니다.</li>
	<li>한 쌍의 집게로 xiphoid 과정을 잡고 수술 용 가위를 사용하여 복강을 자릅니다. 횡격막을 조심스럽게 절단하여 흉강을 엽니다. 갈비뼈를 잘라 심장과 폐를 노출시킵니다. 부드럽게 폐를 잡고 심장과 폐를 절제합니다.</li>
	<li>헤파린화된 KH 접시에 심장을 넣으십시오. 폐와 큰 지방 조각을 제거하십시오. 세척된 심장을 2배 배율로 설정된 해부 현미경 아래 헤파린화된 KH의2차 접시에 놓습니다. 대동맥을 찾아 가는 집게를 사용하여 캐뉼라 위로 밀어 넣습니다. 4-0 실크 봉합사를 사용하여 심장을 캐뉼라에 고정합니다. 참고: 캐뉼레이션은 심장의 신진대사 활동을 줄이기 위해 얼음 위에서 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>관류 시스템에 놓이기 전에 관상 동맥에서 혈액을 제거하기 위해 캐뉼라를 통해 heparinized KH의 볼루스 주사를 플러시합니다.</li>
	<li>캐뉼레이션된 심장을 관류 시스템에 연결하고 관류액으로 채워진 PDMS 접시에 넣습니다. 아인트호벤의 삼각형13에 따라 ECG 바늘 전극을 PDMS 접시에 넣습니다. 최소 5분 동안 심장에 적응시킵니다.</li>
	<li>왼쪽 심방에 접근할 수 있도록 심장을 회전하고 마이크로 자동 개방 가위로 왼쪽 심방에 ~1mm 구멍을 자릅니다. 이 슬라이스를 통해 직경 1mm의 튜브를 좌심실에 삽입하여 거기에 갇힌 관류액을 방출합니다. 참고: 심장을 보기 위해 해부 현미경이 있으면 이 단계를 더 쉽게 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>RA가 위를 향하도록 심장을 회전하고 동방(SA) 노드에 조명을 위해 접근할 수 있습니다(그림 3).</li>
	<li>전극을 심장에 더 가깝게 이동하거나 관류액에 담그면 적절한 신호 대 잡음비로 신호를 수신하여 필요에 따라 ECG 전극을 조정합니다. 설정은 사용 중인 ECG 획득 하드웨어 및 소프트웨어에 따라 달라질 수 있습니다. 이 방법은 게인이 2000이고 500Hz 차단 필터가 있는 Einthoven Goldberger 모듈을 사용했으며 소프트웨어 설정에는 주전원 필터와 1000Hz 샘플링 주파수가 포함되었습니다.</li>
</ol>
4. 광유전학적 활성화
<ol>
	<li>마이크로 LED 장치를 10Hz 주파수, 30ms 펄스 폭, 10Vpp 진폭 매개변수에서 펄스파를 생성하도록 설정된 함수 발생기에 연결합니다.</li>
	<li>마이크로 LED를 SA 노드에 부드럽게 놓습니다. 마이크로 LED를 너무 세게 누르면 심박수와 기능이 저하될 수 있으므로 피하십시오.</li>
	<li>함수 생성기를 켜고 광자극으로 인한 심박수 변화를 측정합니다. 심박수의 즉각적인 변화는 효과적인 활성화를 나타냅니다. 카테콜아민성 활성화는 심박수를 기하급수적으로 증가시키고10, 콜린성 활성화는 즉각적인 심박수 저하를 유발한다8.</li>
	<li>함수 생성기를 끕니다. 심박수가 활성화 이전 수준으로 돌아갈 수 있도록 합니다.</li>
	<li>광유전학적 활성화로 인해 심박수 변화가 100bpm 미만인 경우 RA의 뉴런을 더 잘 비출 수 있도록 마이크로 LED의 위치를 조정하십시오. 필요에 따라 반복합니다.</li>
</ol>
5. 실험 절차 및 데이터 분석
<ol>
	<li>내인성 광유전학적 콜린성 자극이 노르에피네프린(NE)에 의한 외인성 베타-아드레날린성 활성화를 억제할 수 있다는 가설을 테스트하기 위해 흄 식품에서 NE의 10μM 및 100μM 원액을 준비합니다.</li>
	<li>주입 포트를 통해 관류 시스템에 NE의 볼루스 용량을 추가합니다. 심박수가 증가하면 마이크로 LED를 ~10초 동안 켭니다. 조명을 끄고 심박수 변화를 모니터링합니다.</li>
	<li>심박수가 부비동 리듬으로 돌아온 후 NE 용량을 늘리고 광유전학적 자극을 반복합니다. NE의 각 용량에 대해 계속하십시오.</li>
	<li>연구가 끝나면 가스 공급을 차단하고 시스템에서 심장을 제거한 다음 필요에 따라 고정 용액으로 보존합니다.</li>
	<li>필요에 따라 관류 시스템 저장소와 튜브를 DI 물 또는 세제로 헹굽니다. 곰팡이를 방지하기 위해 시스템을 철저히 건조시키십시오.</li>
	<li>LabChart 파일을 저장합니다. 오프라인 분석 및 그래픽 표시를 위해 심박수 신호 및 ECG 채널을 내보냅니다.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig3.jpg"> 
그림 3: 마우스 심장 수조 구성. LED 장치 및 ECG 전극의 배치를 보여주는 캐뉼레이트 마우스 심장. 주변 전자 장치의 소음을 줄이기 위해 섀시 접지가 있습니다. ECG 바늘 전극은 아인트호벤의 삼각형을 기반으로 배치됩니다. 약어: LA = 왼팔; RA = 오른팔; LL = 왼쪽 다리; G = 접지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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<li>Asfour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+fluorescence+imaging+of+isolated+biventricular+working+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts.</a> J Vis Exp. (65), e4115(2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>#3c 집게 (x2)</td><td>Dumont</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m 셀룰로오스 질산염 멤브레인 필터</td><td>Whatman</td><td>7182-004</td><td>KH</td></tr><tr><td>0.5 ml, 마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>울트라 크루즈</td><td>sc-200269</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; m Nuclepore 멤브레인 필터</td><td>Whatman</td><td>111115</td><td>시스템 필터</td></tr><tr><td>아날로그 인큐베이터&nbsp;</td><td>Qunicy Labs</td><td>12-140</td><td></td></tr><tr><td>대동맥 캐뉼라</td><td>하버드 장치&nbsp;</td><td>73-2798</td><td></td></tr><tr><td>임의 함수 생성기</td><td>Tektronix</td><td>AFG3021B</td><td></td></tr><tr><td>꼰 실크 봉합사 4-0</td><td>외과 전문 보기</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>곡선 지혈</td><td>Ted Pella</td><td>53065</td><td></td></tr><tr><td>Einthoven Goldberger 모듈</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-1778</td><td></td></tr><tr><td>유연한 실리콘 와이어 30AWG</td><td>BNTECHGO</td><td>619317716902</td><td></td></tr><tr><td>글루코스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>헤비 커브드 아이리스 펜치&nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>OC022R</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 주입</td><td>Sagent</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>아이리스 가위</td><td>Ted Pella</td><td>13215</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 솔루션</td><td>Covetrus</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8&nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>데이터 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 가위</td><td>WPI</td><td>504520</td><td></td></tr><tr><td>Micro-LED</td><td>Dialight</td><td>598-8091-107F</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>광학 파워 미터</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/35</td><td>AD패키지</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>자동 개방&nbsp; 정밀 가위</td><td>Excelta</td><td>366</td><td></td></tr><tr><td>단일 동물 마취 기계</td><td>EZ-Z 시스템</td><td>EZ-108SA</td><td></td></tr><tr><td>납땜 스테이션</td><td>웰러</td><td>WES51</td><td></td></tr><tr><td>SureOne 필터 피펫 팁</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-478</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>DOW</td><td>04019862</td><td></td></tr><tr><td>조직 집게</td><td>Ted Pella</td><td>13220</td><td></td></tr><tr><td>튜빙 플로우 시스템</td><td>천음속</td><td>TS410</td><td></td></tr></tbody></table>

절제된 관류 마우스 심장에서 내재적 심장 자율 뉴런의 광유전학적 활성화(optogenetic activation of intrinsic cardiac autonomic neurons in excised perfused mouse hearts)

Optogenetic Activation of Intrinsic Cardiac Autonomic Neurons in Excised Perfused Mouse Hearts

Langendorff 정압 관류 시스템 (그림 4) 은 적절한 산소 공급, 체온 및 관상 동맥 흐름이 유지되는 경우 한 시간 이상 마우스 심박수를 최소 300bpm으로 유지할 수 있어야 합니다. 이 설정을 사용하면 대동맥 관류액 온도가 관상동맥 흐름에 의존하므로 대동맥 온도를 37°C로 유지하기 위해 유속이 변함에 따라 수조 온도를 조정해야 할 수 있습니다. 쥐의 심장 관상동맥 유속은 일반적으로 심장의 크기에 따라 1.5-4.5mL/분 범위입니다. 유속 변동 시 관류액 온도를 37°C로 유지하는 것은 일관된 심장 기능을 위해 필요하며 일정한 압력 관류에 특히 중요합니다. 설명된 관류 시스템은 관류액 컬럼 높이를 통해 70mmHg의 정수압을 유지하도록 설계되었습니다. 이는 상단 저장소에서 일관된 오버플로를 제공하는 펌프 속도로 수행됩니다. 관류물은 20μM의 혈관 확장제 크로마칼린(cromakalin)으로 보충되어 정상 또는 초정상 관상동맥 흐름을 개선하고 유지하여 완전한 심근 산소화를 보장할 수 있습니다14.
10Hz 및 30ms 펄스 폭에서 ChAT-ChR2 마우스 심장의 콜린성 뉴런을 광자극하면 심박수가 거의 즉각적으로 떨어집니다. 적절하게 관류된 심장에서 콜린성 뉴런을 효율적으로 광자극하면 심박수가 최소 100bpm 감소해야 합니다. 그림 5 는 마이크로 LED가 켜지면 즉시 75bpm이 떨어지고 최대 135bpm의 감소에 도달할 때까지 계속 떨어지는 것을 보여줍니다. 마이크로 LED를 끈 후 30초 이내에 심박수가 175bpm으로 증가한 후 점차 자극 전 수준으로 돌아갑니다. 자극 전, 자극 중, 자극 후의 RR 간격의 차이를 설명하기 위해 6개 리드의 ECG가 제시됩니다(그림 5B). 리드 aVR, aVL 및 aVF는 리드 I 및 II를 사용하여 LabChart 소프트웨어에서 계산됩니다.
TH-ChR2 마우스 심장에서 카테콜아민성 뉴런의 광자극은 콜린성 뉴런의 광자극에 비해 심박수의 점진적(기하급수적) 변화를 일으킵니다. 이는 표적 단백질을 인산화하는 cAMP 활성화 PKA의 두 번째 메신저 시스템을 필요로 하는 beta1-아드레날린성 활성화에 의해 발생하는 것으로 보이며, 무스카린 활성화는 그렇지 않습니다. 그림 6 은 10초 동안 135bpm 심박수 증가를 보여줍니다. 조명을 끈 후 정상적인 부비동 리듬으로 돌아가기 위해 추가로 10초가 필요합니다. 마이크로 LED가 제대로 절연되지 않으면 심장을 가열하여 심박수를 증가시킬 수 있습니다. 이 가열 반응은 TH-ChR2 자극보다 덜 강합니다. 따라서 심박수의 변화가 덜 두드러집니다.
이 프로토콜의 한 가지 응용 분야는 광유전학적 자극을 사용하여 뉴런을 탈분극하여 내인성 신경전달물질의 방출로 이어지는 동시에 관류물에 외인성 신경전달물질을 추가하는 것입니다. 그림 7A는 ChAT-ChR2 마우스 심장에서 내인성 아세틸콜린이 방출되고 NE의 볼루스 용량이 관류물에 첨가된 것을 보여줍니다. NE가 없으면 광자극으로 인해 심박수가 100bpm 이상 떨어졌고 자극이 지속되는 동안 이 감소를 유지했습니다. 반면 많은 양의 NE(2000nM)를 투여한 경우 광자극 중 최대 심박수 강하는 40bpm이었습니다. 심장 박동수가 즉시 상승하기 시작했고, 조명이 꺼지기 전에 거의 자극 전 수준에 도달했습니다. 이 결과는 ChAT 뉴런 광자극에 의한 심박수의 광유전학적 억제가 고용량의 NE로 인한 심박수 증가를 완전히 억제할 수 없어 심박수 억제 시간이 짧아지고 심박수가 감소하는 원인이 되었음을 나타냅니다(그림 7B). 이러한 결과는 미주신경과 성상신경절 자극이 동시에 진행되는 동안 진행성 AV 노드 차단을 입증한 대형 동물을 대상으로 한 이전 연구와 일치합니다 12,13.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig4.jpg"> 
그림 4: 실험 설정. 관류 시스템의 다이어그램. 화살표는 관류물의 방향을 나타냅니다. Superfusion perfusate는 점선으로 표시되며 구성 요소는 빨간색으로 윤곽선이 그려져 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig5.jpg"> 
그림 5: 대표적인 콜린성 광자극 반응. (A) ChAT-ChR2 광유전학적 활성화 중 6 리드 ECG. 파란색 실선은 마이크로 LED가 켜지거나 꺼지고 있음을 나타냅니다. 빨간색 파선 상자는 (B) 스니펫의 시간을 나타냅니다. (B) 광자극 전(a), (b) 중, 광자극 후(c)의 30초 간격의 ECG 신호 발췌. 각 섹션에 대해 RR 간격이 표시됩니다. (C) 심박수(위)가 함수 발생기(아래)의 맥파와 함께 표시됩니다. 심박수는 450bpm에서 시작하여 광자극 8초 후 315bpm으로 떨어지고 광자극이 끝난 후 7초 후에 410bpm으로 돌아갑니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig6.jpg"> 
그림 6: 대표적인 카테콜아민성 광자극 반응. (A) TH-ChR2 광유전학적 활성화 중 6 리드 ECG. 파란색 실선은 마이크로 LED가 켜지거나 꺼지고 있음을 나타냅니다. 빨간색 파선 상자는 (B) 스니펫의 시간을 나타냅니다. (B) 광자극 전(a), (b) 중, 광자극 후(c)의 30초 간격의 ECG 신호 발췌. 각 섹션에 대해 RR 간격이 표시됩니다. (C) 심박수(위)가 함수 발생기(아래)의 맥파와 함께 표시됩니다. 심박수는 390bpm에서 시작하여 10초 광자극 후 525bpm으로 최고조에 달한 후 광자극이 끝난 후 8초 후에 390bpm으로 돌아갑니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig7.jpg"> 
그림 7: 외인성 NE를 동반한 콜린성 광자극.(A) ChAT-ChR2 광자극 중 심박수 반응, 관류를 위해 NE의 용량 증가를 동반. NE로 인해 심박수가 최대 증가에 도달하면 마이크로 LED가 약 10초 동안 켜졌습니다. 고용량의 NE에서는 심박수 억제가 여전히 가능했지만, 용량이 증가함에 따라 자극의 지속 시간이 감소했다. (B) 심박수가 억제된 상태를 유지한 시간. 10초에 가까운 시간은 일반적으로 자극이 지속되는 동안 억제된 상태로 유지되었습니다. (C) 광자극 중 심박수 감소는 저용량보다 고용량의 NE에서 덜 심각했다. 저용량의 심박수는 평균 40%의 심박수 감소를 보인 반면, 높은 용량의 심박수는 25% 감소하는 데 그쳤습니다. 통계적 유의성을 평가하기 위해 쌍을 이루지 않은 t-검정을 수행했습니다. 평균 * p &lt; 0.05의 표준 오차로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

절제된 관류 마우스 심장에서 내재적 심장 자율 뉴런의 광유전학적 활성화(Optogenetic Activation of Intrinsic Cardiac Autonomic Neurons in Excised Perfused Mouse Hearts)

A balance of cholinergic and catecholaminergic activation is necessary to maintain heart health. Interrogating the interaction between these pathways can ...

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 문서 potentiometric 염료 (DI - 8 - ANEPPS)를 사용 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 광학 이미지 조치 가능성이 운동에 높은 시간적 및 공간적 해상도 기법을 설명합니다.

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

출처: Jungen, C., et al. 생체 외 Langendorff 시스템에서 심장 전기생리학 및 부정맥 형성에 대한 심장 내 뉴런의 영향. J. Vis. 특급 (2018).이 비디오는 심장내 신경계를 자극하여 부정맥에 대한 심장의 민감성을 평가하는 생체 외 기술을 보여줍니다. 관류 장치를 사용하여 분리된 마우스 심장에 산소가 함유된 완충액을 관류합니다. 그런 다음 심장내 신경계는 부정맥을 유발하기 위해 고주파로 자극됩니다.

부정맥에 대한 감수성을 평가하기 위한 심장내 신경계의 자극

여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.

Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

여기, 선물이 intracardiac 자율 신경의 변조 및 기본 전기 생리학, arrhythmogenesis, 및 비보 전 Langendorff 설치를 사용 하 여 캠프 역학에 미치는 영향의 평가 대 한 프로토콜.

심장 전기 생리학 및 전 비보 Langendorff 시스템에서 Arrhythmogenesis Intracardiac 뉴런의 영향

이 연구의 목적은 번역 동물 모델을 사용하여 심장 역학을 조사하는 방법을 확립하는 것이었습니다. 기술된 실험 접근법은 분리되고 손상되지 않은 돼지 심장 모델에서 전기 적 활동을 평가하기 위한 전기 생리학 연구와 함께 이중 방출 광검을 통합합니다.

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

우리는 토끼 심근 세포에서 GtACR1 활성화의 전기 기계적 효과를 평가하기위한 프로토콜을 제시한다. 당사는 세포 격리, 배양 및 아데노바이러스 전이, 패치 클램프 및 탄소 섬유 기술로 기능적 실험에 대한 자세한 정보를 제공합니다.

광유전학적으로 변조된 심근세포 활동의 전기기계적 평가

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쥐 심장에 광유전학적 다중 부위 광자극을 적용하여 고급 심장 리듬 관리

이 프로토콜은 마우스의 페이스메이킹 결함을 식별하기 위해 전체 시노어심 노드 조직의 미세 전극 어레이 기록을 사용하여 본질적인 심장 발사 속도를 측정하는 새로운 방법론을 설명하는 것을 목표로합니다. 약리학 에이전트는 또한 본질적인 페이스 메이킹에 그들의 효력을 공부하기 위하여 이 방법에 소개될 수 있습니다.

중고심 노드 발사 속도의 마이크로 전극 어레이 기록으로 마우스의 본질적인 심장 페이스메이킹 결함을 식별합니다.

본 프로토콜은 심초음파유도 하에 바이러스의 직접 심내내 주사에 의해 래트 및 마우스 심장에서 전이유전자 발현을 위한 방법을 기술한다. 격리 된 Langendorff 관류 심장의 프로그램 된 전기 자극에 의한 심실 부정맥에 대한 심장의 감수성을 평가하는 방법도 여기에 설명되어 있습니다.

설치류 심장에서의 바이러스 전이 유전자 발현 및 심장 부정맥 위험 평가

이 프로토콜은 발달 중인 마우스 심장에서 심장 세포의 전기천공법 기반 형질전환(transgenesis)을 위한 상세한 방법론적 프레임워크를 제시합니다. 여기에 제공된 비디오 자산은 이 다재다능한 기술을 쉽게 배울 수 있습니다.

마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

배우세요 절제된 관류 마우스 심장에서 광유전학을 이용한 내재적 심장 자율 뉴런의 활성화 방법을. ChAT 뉴런 광자극과 심박수 변화를 관찰하여 교감신경과 부교감신경계의 상호작용을 연구할 수 있습니다.

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절제된 관류 마우스 심장에서 내재적 심장 자율 뉴런의 광유전학적 활성화(Optogenetic Activation of Intrinsic Cardiac Autonomic Neurons in Excised Perfused Mouse Hearts)

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