Name: Nicotiana benthamiana에서 Plasmodesmata에 대한 단백질 분류의 컨포칼 현미경 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 배우세요 Nicotiana benthamiana에서 컨포칼 현미경을 이용한 플라스모데스마 단백질 분류 프로토콜을. PDLP5, TVCV MP, PDCB1 단백질의 세포 내 위치를 시각화하여 바이러스 감염 시 식물 세포 간 신호 전달 메커니즘을 규명합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Plasmodesmata Function 탐색: 표적 단백질의 공초점 현미경

<ol><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-localized+protein+mediates+crosstalk+between+cell-to-cell+communication+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).</li>
<li>Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+gateways+to+local+and+systemic+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).</li>
<li>Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Channels+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Channels under pressure.</a> Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).</li>
<li>Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Structure%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).</li>
<li>Fernandez-Calvino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasmodesmal+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasmodesmal proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18880(2011).</li>
<li>Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+meta-proteomic+pipeline+for+the+identification+of+plasmodesmata+proteins+and+regulatory+conditions+in+diverse+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species.</a> BMC Biol. 20, 128(2022).</li>
<li>Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis.</a> The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).</li>
<li>Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+rice+membrane+dynamics+and+plasmodesmata+during+biotrophic+invasion+by+the+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus.</a> The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).</li>
<li>Aung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+target+plant+plasmodesmata+to+colonize+and+invade+surrounding+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues.</a> The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).</li>
<li>Cui, W., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+callose+synthases+CalS1%2F8+regulate+plasmodesmal+permeability+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress.</a> Nat Plants. 2 (5), 160(2016).</li>
<li>Liu, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytosphinganine+affects+plasmodesmata+permeability+via+facilitating+PDLP5-stimulated+callose+accumulation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis.</a> Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).</li>
<li>Caillaud, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+protein+PDLP1+localizes+to+haustoria-associated+membranes+during+downy+mildew+infection+and+regulates+callose+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition.</a> PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).</li>
<li>Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Z+%22The+Plant+Cell%22">The Plant Cell</a>. , (2024).</li>
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<li>Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+targeting+of+a+plasmodesmal+protein+affecting+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication.</a> PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).</li>
<li>Lim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+localizing+proteins+regulate+transport+and+signaling+during+systemic+acquired+immunity+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).</li>
<li>Walhout, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+recombinational+cloning%3A+Application+to+the+cloning+of+large+numbers+of+open+reading+frames+or+ORFeomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.</a> Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-induced+immunity+targets+plasmodesmata+and+is+suppressed+by+viral+movement+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins.</a> The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).</li>
<li>Roberts, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+frequency+and+architecture+of+plasmodesmata+during+the+sink-source+transition+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves.</a> Protoplasma. 218, 31-44 (2001).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+localization+signal+of+TMV+MP+is+recognized+by+plant+synaptotagmin+SYTA%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA.</a> mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).</li>
<li>Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+prevents+the+development+of+cold+and+mechanical+allodynia+in+paclitaxel-treated+female+C57Bl6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice.</a> Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).</li>
<li>Erkkilä, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widefield+fluorescence+lifetime+imaging+of+protoporphyrin+IX+for+fluorescence-guided+neurosurgery%3A+An+ex+vivo+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study.</a> J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).</li>
<li>Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobamovirus+Turnip+vein+clearing+virus+30-kilodalton+movement+protein+localizes+to+novel+nuclear+filaments+to+enhance+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection.</a> J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+plasmodesmal+localization+signal+in+a+plant+viral+cell-to-cell-movement+protein%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein.</a> mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).</li>
<li>Kumar, G., Dasgupta, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability%2C+functions+and+interactions+of+plant+virus+movement+proteins%3A+what+do+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far.</a> Microorganisms. 9 (4), 695(2021).</li>
<li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+nondestructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses.</a> Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ABT AC 1상 모터</td><td>BRANDTECH</td><td>&nbsp; ABF63/4C-7RQ</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens EHA105</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>오염 제어&nbsp;</td><td>CCI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II 효소 혼합물</td><td>Invitrogen</td><td>#11789020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II 효소 혼합물</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.1.</td><td>GraphPad 소프트웨어 Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미지: J</td><td>미국 국립보건원(National Institutes of Health) 및 광학 및 컴퓨터 계측 연구소(Laboratory for Optical and Computational Instrumentation</td><td></td><td></td>),</tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td>, <td>Zeiss</td><td>LSM 900</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Plant species</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>pDONR207</td>, <td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>Q5, High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>넵</td><td>#M0491S</td><td></td></tr></tbody></table>

nicotiana benthamiana에서 plasmodesmata에 대한 단백질 분류의 컨포칼 현미경 분석

Confocal Microscopy Analysis of Protein Sorting to Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

식물 생리학에서 PD 기능 및 병원체와의 상호 작용에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 PD 국소화를 위해 간단하고 신뢰할 수 있는 세 가지 참조 단백질이 개발되었습니다. 2개의 세포 PD 단백질과 식물 토바모바이러스 TVCV에 의해 암호화된 병원체 유래 MP 단백질을 선택하였다. 이러한 단백질의 세포 내 국소화는 각 단백질의 C-말단에 융합된 자가형광 리포터 EGFP를 사용하여 시각화되었습니다. 다른 접근법으로, PD 관련 칼로스 침전물의 아닐린 블루 염색을 사용하여 PD를 시각화했습니다. 실험은 PDLP5와 MP 모두 반점 PD 국소화를 나타냈으며, MP도 세포핵에서 국소화되어 있음을 보여주었습니다(그림 1A), 앞서 언급한바와 같이 25. 대조적으로, PDCB1은 PD와 ER 사이에서 분할되는 것처럼 보였다(그림 1A). GFP 태그 단백질의 세포 내 국소화를 해석한 경험이 적은 연구자를 위해 그림 1A 는 식물 세포에서 발현되는 EGFP의 특징적인 핵세포질 패턴도 보여줍니다. PDCB1의 ER 신호를 확인하기 위해 PDCB1을 ER 마커와 함께 발현한 결과 PDCB1 신호가 ER 마커의 신호와 겹치는 것을 확인했습니다(그림 1B). 테스트된 단백질의 PD 국소화의 효율성을 평가하기 위해, 이 신호의 PD 국소화를 나타내는 형광 신호를 발현하는 세포의 비율을 계산하였다(표 1).
참조 단백질을 사용하여 세포 내 국소화를 식별하려면 참조 단백질 발현의 시간 척도와 그 국소화의 잠재적 변화를 이해하는 것이 유용합니다. 그림 2 는 PD 자체가 아닐린 블루 염색으로 시각화되었을 때 MP, PDLP5 및 PDCB1에 대한 이러한 역학을 보여줍니다. MP와 PDLP5 모두 침투 후 1일(dpi)에 이미 PD에서 축적되기 시작했으며, 이 축적은 2dpi에서 겉보기 최대치에 도달하여 5일 동안 더 안정적으로 유지된 후 신호 강도가 감소했는데, 이는 단백질 분해로 인한 것일 수 있습니다. PDCB1 세포 내 분류의 시간 경과는 더 복잡했습니다: 처음 3dpi에서 PDCB1은 비교적 강한 ER 신호를 나타내어 PD 특이적 신호 국소화를 거의 완전히 모호하게 한 반면, 5dpi에서는 더 적은 세포에서 이 후자의 신호가 더 뚜렷해졌습니다(그림 2). 흥미롭게도, 5dpi 후 PDCB1의 명확한 PD 국소화 패턴의 출현은 EGFP 신호를 나타내는 셀의 수가 상당히 적다는 것과 일치했습니다(보충 그림 1). 따라서 PDLP5 및 MP는 대부분의 다른 세포 구획에서 배경지식이 거의 없는 PD 참조 단백질로 기능할 수 있으며, 최적의 시각화 시간 창은 2-5dpi입니다. 반면에 PDCB1은 PD 마커만큼 적합하지 않습니다.
그런 다음 PD 마커가 다른 PD 단백질의 존재 하에서 세포 내 국소화 특이성을 유지한다는 것을 확인했습니다. 이를 위해, MP-EGFP 또는 PDLP5-EGFP는 CFP로 태그된 또 다른 식물 바이러스인 담배 모자이크 바이러스(TMV)의 PD-국소화26MP와 동시 발현되었습니다. 그림 3 은 두 경우 모두 동시 발현된 단백질이 명확한 PD 국소화 패턴을 나타냈다는 것을 보여줍니다. 마찬가지로, MP-EGFP- 또는 PDLP5-EGFP 발현 조직의 PD 특이적 조직학적 아닐린 청색 염색에서는 EGFP 및 아닐린 청색 신호의 PD 국소화에 대한 간섭이 감지되지 않았습니다(그림 3).
PD 국소화 연구는 종종 기준 단백질의 전체 발현 및 PD 신호에 대한 보다 정량적인 추정을 통해 이점을 얻을 수 있습니다. 이 정량화 접근법은 그림 4 와 그림 5에 나와 있습니다. 일반적인 발현의 정량화를 위해 PDLP5 및 MP의 신호 강도를 측정하였다. 두 단백질 모두 10dpi 기간 동안 모든 시각화 시점에서 강력한 신호를 보였으며 PDLP5의 경우 3dpi, MP의 경우 2dpi에서 최대 신호 강도를 보였습니다(그림 4). 시각화 시점 중 어느 곳에서도 PDLP5와 MP 간의 신호 강도에는 통계적으로 유의미한 차이가 없었습니다. PDCB1 신호 강도는 발현 세포의 부족으로 인해 이 시점에서 통계적으로 유의미한 데이터를 수집하기 어려웠지만, 가장 강한 신호는 7dpi에서 관찰되어 시점 간 변동이 더 컸습니다(그림 4). 따라서 처음 3dpi는 PDCB1 발현을 감지하기 위한 최적의 타이밍을 나타냅니다. 예상대로 아닐린 청색 염색 샘플은 일시적으로 발현된 단백질보다 더 안정적인 신호를 나타냈습니다(그림 4).
그런 다음 PDLP5 및 MP에 의해 형성된 PD 반점을 정량화했습니다. PDLP5는 관찰 기간 동안 안정적인 PD 반점 수를 보였으며 테스트된 두 시점 간에 통계적으로 유의한 차이는 없었습니다(그림 5). MP에 의해 형성된 PD puncta의 가장 많은 수는 2dpi에서 감지되었으며, 관찰 기간이 끝날 때까지 비교적 안정적인 상태를 유지했습니다. PDLP5와 MP 사이의 PD 반점 수를 비교한 결과, 대부분의 샘플링 시간에서 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았습니다(그림 5). 아닐린 블루로 염색 된 PD puncta의 수도 10dpi에서 약간 감소했지만 안정적으로 유지되었습니다. 아닐린 블루, PDLP5 또는 MP로 장식된 PD 반점의 수는 통계적 유의성으로 서로 유사했으며(그림 5), 이러한 마커의 PD 특이성과 일치했습니다. PDCB1에 대한 PD 반점의 수는 분석되지 않았는데, 그 이유는 초기 시점에서는 PD 신호가 ER 신호에 의해 가려졌고 이후 시점에서는 상대적으로 적은 수의 세포에서만 관찰되었기 때문입니다( 그림 2 참조).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig01.jpg"> 그림 1: 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana )에서 일시적으로 발현되는 TVCV MP, PDLP5 및 PDCB1의 플라스모데마타(PD) 국소화 및 PD의 아닐린 블루 염색 . (A) MP-EGFP, PDLP5-EGFP 및 PDCB1-EGFP 및 아닐린 염색의 PD 국소화. EGFP 신호는 녹색, 아닐린 청색 신호는 청색, 플라스티드 자가형광은 빨간색입니다. (B) MP-EGFP, PDLP5-EGFP 및 PDCB1-EGFP와 mRFP로 태그된 소포체(ER) 마커의 동시 발현. 이미지는 침투 후 2일(dpi)에 기록되었으며 두 개의 독립적인 실험(N = 2개 공장의 이미지 20개)을 대표하는 단일 공초점 섹션입니다. EGFP 신호는 녹색, mRFP 신호는 자주색, 플라스티드 자가형광은 빨간색입니다. 노란색 화살표는 응급실에 국한된 PDCB1을 나타냅니다. 스케일 바 = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig02.jpg"> 그림 2: 니코티아나 벤타미아나 에서 일시적으로 발현되는 TVCV MP, PDLP5 및 PDCB1의 PD 국소화 시간 경과와 PD의 아닐린 블루 염색. 이미지는 2dpi로 기록되었으며 두 개의 독립적인 실험을 대표하는 단일 공초점 섹션입니다(더 적은 수의 셀이 신호를 나타내는 PDCB1-EGFP의 경우 7dpi 및 10dpi를 제외한 모든 시스템에 대해 2개 공장의 N = 20개 이미지). EGFP 신호는 녹색이고 아닐린 청색 신호는 청색입니다. 스케일 바 = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig03.jpg"> 그림 3: TVCV MP 및 PDLP5는 PD 국소화 TMV MP와 동시 발현하고 아닐린 블루와 함께 염색한 후 PD 국소화를 유지합니다. 이미지는 2dpi로 기록되었으며 4-6 개의 식물에서 N ≥ 10 개의 이미지를 대표하는 단일 공초점 섹션입니다. EGFP 신호는 녹색, CFP 신호와 아닐린 청색 신호는 청색, 플라스티드 자가형광은 빨간색입니다. 스케일 바 = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig04.jpg"> 그림 4: Nicotiana benthamiana 및 아닐린 블루 PD 염색에서 일시적으로 발현된 TVCV MP, PDLP5 및 PDCB1의 형광 강도의 시간 경과. 정량적 데이터는 그림 2에 설명된 실험에서 수집되었습니다. 오차 막대는 여러 실험에서 평균의 표준 편차를 나타냅니다. 개별 데이터 포인트는 각 측정의 평균으로 표시됩니다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 이원 분산 분석으로 평가한 평균값 간의 차이는 P-값에 대해 통계적으로 유의합니다. *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01, ***P &lt; 0.001, ****P &lt; 0.0001; NS는 통계적으로 유의하지 않습니다. 블루 바, 아닐린 염색; 연한 녹색 막대, MP-EGFP, 짙은 녹색 막대, PDLP5-EGFP; 노란색 막대, PDCB1-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig05.jpg"> 그림 5: Nicotiana benthamiana 및 PD의 아닐린 블루 염색에 의해 일시적으로 발현되는 TVCV MP 및 PDLP5에 의한 PD 반점 형성의 시간 경과. 정량적 데이터는 그림 2에 설명된 실험에서 수집되었습니다. 오차 막대는 여러 실험에서 평균의 표준 편차를 나타냅니다. 개별 데이터 포인트는 각 측정의 평균으로 표시됩니다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 이원 분산 분석으로 평가한 평균값 간의 차이는 P-값에 대해 통계적으로 유의합니다. *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01, ***P &lt; 0.001, ****P &lt; 0.0001. 블루 바, 아닐린 염색; 연한 녹색 바, MP-EGFP, 짙은 녹색 바, PDLP5-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="4">실험 I</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>전체 셀 수</td>
			<td>PD 국소화가 있는 세포</td>
			<td>신호가 혼합된 셀</td>
			<td>PD 국소화가 있는 세포(%)</td>
		</tr><tr><td>아닐린 블루</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP 님</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>3</td>
			<td>38</td>
			<td>7.5</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP 님</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="4">실험 II</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>전체 셀 수</td>
			<td>PD 국소화가 있는 세포</td>
			<td>신호가 혼합된 셀</td>
			<td>PD 국소화가 있는 세포(%)</td>
		</tr><tr><td>아닐린 블루</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>8</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP 님</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>8</td>
			<td>97.5</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>31</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP 님</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>2</td>
			<td>97.5</td>
		</tr></tbody></table>표 1: PD 위치 파악의 효율성.
보충 그림 1: Nicotiana benthamiana에서 일시적으로 발현된 TVCV MP, PDLP5 및 PDCB1의 PD 국소화. 이미지는 5dpi(A), 7dpi(B), 10dpi(C)로 기록되었습니다. EGFP 신호는 녹색이고 플라스티드 자가형광은 빨간색입니다. 스케일 바 = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/Figure%20S1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Nicotiana benthamiana에서 Plasmodesmata에 대한 단백질 분류의 컨포칼 현미경 분석

Plasmodesmata are membranous nanopores that connect the cytoplasm of adjacent plant cells and enable the cell-to-cell trafficking of nutrients, ...

confocal-microscopy-analysis-protein-sorting-to-plasmodesmata

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

식물 세포 사이 Macromolecular 거래는 transiently 관심 찬란 - 태그 단백질을 표현하고 공촛점 현미경하여 내부와 세포 분포를 분석하여 평가하실 수 있습니다.

휴대 전화의 Macromolecular 교통 분석 Planta에 Biolistic 포격을 활용

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

세포 이하 수준에서 신호 이벤트는 발달 및 환경 단서에 의해 동적으로 조절됩니다. 여기에서는 담배 일시적 발현 시스템을 사용하여 동적 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링하고 식물 세포에서 신호 전달의 공간적 조직을 공개하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.

Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

이 프로토콜 라이브 이미지 촬영 정점 meristems 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다른 식물 종에서 분석 하는 방법을 제공 합니다.

다른 식물 종에서 촬영 정점 Meristems의 confocal 라이브 영상

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

옥수수 잎 primordia는 깊숙이 찢어지고 구겨져 연구하기가 어렵습니다. 여기에서 우리는 형광 및 공초점 이미징을 위해 옥수수 잎 원시의 횡단면과 펼쳐진 전체 마운트를 준비하는 방법을 제시합니다.

형광 및 공초점 이미징을 위해 횡단면을 준비하고 옥수수 잎 원시의 전체 마운트를 펼치기 위한 개선된 방법

배우세요 Nicotiana benthamiana에서 컨포칼 현미경을 이용한 플라스모데스마 단백질 분류 프로토콜을. PDLP5, TVCV MP, PDCB1 단백질의 세포 내 위치를 시각화하여 바이러스 감염 시 식물 세포 간 신호 전달 메커니즘을 규명합니다.

Nicotiana benthamiana에서 Plasmodesmata에 대한 단백질 분류의 컨포칼 현미경 분석

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