Name: 세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 학습하세요 HeLa 세포를 이용한 LC3-II 양성 세포외 소포 방출 평가 방법을 통해 TDP-43 관련 신경퇴행성 질환의 자가소화 조절 메커니즘을 탐구하세요. 이 기법은 ALS 및 FTLD-TDP 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>리소좀 융합이 손상된 자가포식에서 LC3-II-양성 EV 방출 평가

<ol><li>Tanaka, Y., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+1+mutants+form+aggregates+that+induce+accumulation+of+prion-like+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43.</a> Prion. 10 (4), 283-289 (2016).</li>
<li>Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+cryptic+exons%3A+Implications+for+als-ftd%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">The era of cryptic exons: Implications for als-ftd.</a> Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).</li>
<li>Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+clinicopathological+heterogeneity+in+tdp-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy.</a> Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).</li>
<li>Chatterjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+extracellular+vesicle+tau+and+tdp-43+as+diagnostic+biomarkers+in+ftd+and+als%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als.</a> Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).</li>
<li>Kasai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+csf+nfl+and+csf+tdp-43+improves+diagnostic+performance+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als.</a> Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion+is+a+key+pathway+for+clearance+of+pathological+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43.</a> Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+als-ftd-csf+generates+tdp-43+aggregates+in+glioblastoma+cells+through+exosomes+and+tnts-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure.</a> Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Sasaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+spinal+cord+motor+neurons+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+als+and+ftd%3A+Disrupted+rna+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+common+pathway+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+involvement+of+lysosomal+dysfunction+in+pathological+changes+of+the+brain+in+aged+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+progranulin-driven+autophagy-lysosomal+pathway+mediates+secretion+of+the+nuclear+protein+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).</li>
<li>Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+secretion+via+extracellular+vesicles+is+regulated+by+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy+Rep%22%5BJournal%5D)">TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy.</a> Autophagy Rep. 3 (1), (2024).</li>
<li>Ratajczak, M., Ratajczak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microvesicles%2Fexosomes%3A+discovery%2C+disbelief%2C+acceptance%2C+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future.</a> Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).</li>
<li>Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abemaciclib+and+vacuolin-1+decrease+aggregate-prone+tdp-43+accumulation+by+accelerating+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux.</a> Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).</li>
<li>Dingjan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+and+phagosomal+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endosomal and phagosomal snares.</a> Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+regulates+lysosomal+function+and+biogenesis+through+acidification+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes.</a> Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).</li>
<li>Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+freely+available+easy-to-use+software+%27EZR%27+for+medical+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics.</a> Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Plate, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+proteostasis+regulators+that+reprogram+the+ER+to+reduce+extracellular+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation.</a> eLife. 5, e15550(2016).</li>
<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mammalian+autophagy+in+protein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of mammalian autophagy in protein metabolism.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).</li>
<li>Nanayakkara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+lysosome+reformation+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic lysosome reformation in health and disease.</a> Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).</li>
<li>Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STX6-VTI1B-VAMP3+complex+facilitates+xenophagy+by+regulating+the+fusion+between+recycling+endosomes+and+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes.</a> Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25 % 트립신 EDTA</td><td>후지 필름 Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>10cm 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L 피펫 팁</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-301</td><td>피펫팅</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21417-52</td><td> 샘플 버퍼 용액용 재료</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td><td>Nacalai Tesque</td><td>11009-41</td><td>DAB 용액용 재료</td></tr><tr><td>3.5 cm 접시&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>6cm 접시&nbsp;</td><td>TrueLine</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 블록 온도 조절 수조(건식 열욕)</td><td>EYELA</td><td>273860</td><td></td></tr><tr><td>흡인기</td>, <td>SANSYO</td><td>SAP-102</td><td>흡입 용액</td></tr><tr><td>, Avanti JXN-30</td>, <td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr>, <tr><td>Bafilomycin A1</td>, <td>Adipogen</td><td>BVT-0252</td><td></td></tr><tr><td>비오틴 접합 염소 항토끼 IgG 항체</td><td>벡터 실험실&nbsp;</td>면역 <td>블로팅을 위한</td> <td>BA-1000</td> 2차 항체</tr><tr><td>비오틴 접합 말 안티마우스 IgG 항체</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>BA-2000</td><td>면역 블로팅을 위한 2차 항체</td></tr><tr><td>블로킹 One</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03953-95</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Nacalai Tesque</td><td>05808-61</td><td> 샘플 버퍼 용액</td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>cytiva</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>CanoScan LiDE 220</td><td>Canon</td><td>CSLIDE220</td><td>스캐너</td></tr><tr><td>Centrifuge 5702 R</td><td>eppendolf</td><td>5703000039</td><td></td></tr><tr><td>카운팅 슬라이드 듀얼 챔버</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015J</td><td>셀 카운팅</td></tr><tr><td>디지털 Sonifier 450</td><td>BRANSON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Nacalai Tasque</td><td>09659-14</td><td>차량</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드가 없는 배양 배지 DMEM</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08489-45</td><td>문화 매체</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>동인지&nbsp;</td><td>348-01311</td><td>A68 솔루션 Excel용 재료</td></tr><tr><td>Microsoft</td><td></td><td>버전 16.16.27</td><td>위성 분석</td></tr><tr><td>EZR</td><td>참조 번호 24</td><td>버전 1.68</td><td>위성 분석</td></tr><tr><td>FBS</td><td>시그마</td><td>173012</td><td>문화 매체</td></tr><tr><td>피지</td><td>NIH</td><td></td><td>이미지 분석 도구</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09886-05</td><td> 샘플 버퍼 용액</td></tr><tr><td>Hoehst33342</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>후지필름 Wako</td><td>080-0186</td><td>DAB 용액</td></tr><tr><td>재료 Kimwipe S-200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>62011</td><td>세척 와이프</td></tr><tr><td>저보유 튜브</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-MCT015CLB</td><td>siRNA 및 DNA transfection</td></tr><tr><td>LSM780 컨포칼 레이저 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단클론 마우스 Anti-LC3 항체</td><td>MBL</td><td>M186-3</td><td>면역 블로팅을 위한 1st 항체</td></tr><tr><td>니켈(II) 염화물 헥사하이드레이트</td><td>후지필름 Wako</td><td>149-01041</td><td>DAB 용액</td></tr><tr><td>N-라우로일사르코신 나트륨 염</td><td>Nacalai Tesque</td><td>20117-12</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원 혈청 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>siRNA 및 DNA transfection</td></tr><tr><td>pEGFP-C1-hAtg13</td><td>Addgene</td><td>22875</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-PCNA 항체</td><td>BioAcademia</td><td>70-080</td><td>1st 항체 면역 블로팅</td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 항체</td><td>ProteinTech</td><td>10841-1-AP</td><td>면역 블로팅을 위한 1st 항체</td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 항체</td><td>ProteinTech</td><td>28283-1-AP</td><td>면역 블로팅을 위한 1st 항체</td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 항체</td><td>ProteinTech</td><td>20986-1-AP</td> 면역 블로팅 폴리비닐리덴 디플루오라이드<td>를 위한 1st 항체</td></tr><tr><td> 멤브레인</td><td>밀리오레</td><td>IPVH00010</td><td>면역 블로팅을 위한 재료</td></tr>, <tr><td>R</td><td>R 개발 핵심 팀</td><td>버전, 4.4.1</td><td>satistical analysis</td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778</td><td>siRNA transfection 시약</td></tr><tr><td>siRNA STX6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HSS115604</td><td>siRNA for transfection</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-05</td><td>Tris 완충액 및 A68 용액용 재료</td></tr>, <tr><td>도데실황산나트륨</td>, <td>후지필름, Wako</td><td>192-13981</td><td>, 시료 완충액용 재료</td></tr>, <tr><td>SPARK Microplate Reader</td>, <td>TECAN,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stealth RNAi, Negative Control Duplexes, Med GC</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>, 12935300</td><td>siRNA 형질주입</td></tr>, <tr><td>Sucrose</td>, <td>Fujifilm, Wako</td><td>193-00025</td><td>A68 용액</td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 계수기용 재료, 열전사 프린터</td><td>Bio-Rad</td><td>1450109J1</td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>thermobath</td><td>TOKYO RIKAKIKAI</td><td>MG-3100</td><td>배양</td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>DNA 형질주입 시약</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td>, <td>Mirus Bio</td><td>MIR2300</td><td>DNA 형질주입 시약</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-75</td><td>Tris 버퍼, 샘플 버퍼 및 A68 용액용 재료</td></tr><tr><td>Trypan Blue Dye 0.40%</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>361706</td><td>P1 EV 분획</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>P2 EV 분획</td></tr><tr><td>Vectastain ABC 표준 키트</td><td>Vector Laboratories 수집 중&nbsp;</td><td>PK-4000</td><td>면역 블로팅</td></tr><tr><td>세척 병</td><td>As One</td><td>1-4640-02</td><td>세척</td></tr>막<tr><td>&mu;-슬라이드 8 웰 하이</td><td>ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 내 lc3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 lc3-ii 방출 평가

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

이전 연구에서 나타난 바와 같이, Baf 처리는 EV가 풍부한 분획에서 TSG101(P1: P &lt; 0.01, P2: P = 0.012, EZR19에서 양방향 ANOVA로 결정) 및 LC3-II(P1: P &lt; 0.01, P2: P &lt; 0.01, EZR19의 양방향 ANOVA에 의해 결정됨)의 수치를 증가시켰다. 특히, Baf 처리는 EV 분획에서 STX6(P1: P &lt; 0.01, P2: P &lt; 0.01, EZR19의 양방향 ANOVA에 의해 결정됨)를 증가시켰으며, 이는 STX6가 EV의 구성 요소일 수 있음을 시사합니다. 증식하는 세포 핵 항원(PCNA)은 EV 분획에서 관찰되지 않았습니다. 세포 분획에서 STX6의 면역블로팅(Immunoblotting)은 siRNA knockdown으로 STX6 수준이 절반으로 감소한 것으로 나타났습니다(그림 1B). STX6 knockdown은 차량 및 Baf 처리 조건 모두에서 세포 및 EV 분획의 TSG101 수준에 영향을 미치지 않았습니다(그림 1C). 그러나 STX6 knockdown은 비히클 처리 조건에서 세포 분획의 LC3-II 수준을 증가시켰지만 Baf 처리 조건에서는 증가시키지 않았습니다. STX6 넉다운은 또한 Baf 처리 조건에서 EV 분획의 LC3-II 수준을 증가시켰습니다(그림 1D). 이러한 결과는 면역블로팅을 통해 EV에서 LC3-II를 검출하는 데 사용되는 방법이 knockdown 효율이 크지 않더라도 충분히 민감하다는 것을 시사합니다. 또한 이러한 결과는 STX6 knockdown이 Baf 처리 하에서 세포 내 자가포식 개체 수를 증가시키고 자가포식 관련 소포의 세포 외 방출을 향상시킨다는 것을 나타냅니다.
STX6 knockdown이 세포 내 자가포식 및 자가리소좀 수에 영향을 미치는지 여부를 추가로 조사하기 위해 자가포식 마커 mCherry-LC3 및 리소좀 마커 LAMP1-GFP를 사용하여 자가포좀 및 리소좀을 시각화했습니다. 컨포칼 라이브 셀 이미징은 LAMP1-GFP 및 mCherry-LC3를 발현하는 HeLa 세포에서 GFP 및 mCherry 양성 소포를 나타냈습니다(그림 2A). 자가포좀은 GFP 및 mCherry 양성 소포로 확인되었으며, 자가포좀은 GFP 음성 및 mCherry 양성 소포로 확인되었습니다. STX6 knockdown은 비히클 처리 조건에서 자가포식소체와 자가리소좀의 수를 증가시켰습니다(그림 2B,C). 그러나 STX6 knockdown은 Baf 처리 조건에서 자가포식소체 및 자가리소좀 수에 영향을 미치지 않았습니다(그림 2B,C).
STX6 knockdown으로 인한 세포 내 자가포식 수의 증가가 향상된 자가포식 형성에 의한 것인지 확인하기 위해 자가포식 형성에 필요한 과정인 오메가솜 형성을 오메가솜 마커 GFP-ATG13 신호 강도를 사용하여 검사했습니다. 컨포칼 라이브 셀 이미징은 GFP-ATG13의 조립 이미지를 제공하여 오메가솜 형성을 나타냅니다(그림 3A). STX6 넉다운은 GFP-ATG13 신호 강도를 감소시켰습니다(P = 0.023, EZR19의 양방향 ANOVA에 의해 결정됨). STX6 knockdown은 차량 처리 조건에서 GFP-ATG13 신호 강도에 큰 영향을 미치지 않았지만 Baf 처리 조건에서는 신호를 크게 감소시켰습니다(그림 3B). 종합적으로 이러한 결과는 STX6 knockdown이 자가포식 관련 소포의 축적과 관련된 LC3-II 양성 소포의 방출을 증가시킨다는 것을 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig01.jpg"> 
그림 1: 비히클 또는 Baf 처리 하에 대조군 또는 STX6 siRNA로 transfection된 HeLa 세포의 세포, P1 및 P2 분획의 면역블로팅 결과. HeLa 세포는 대조군 또는 STX6 siRNA로 transfection한 후 24시간 동안 비히클(DMSO) 또는 100nM Baf로 처리했습니다. 세포, P1(20,000 × g 펠릿) 및 P2(110,000 × g 펠릿) 분획을 분리하였다. (A) STX6, TSG101, LC3 및 PCNA를 보여주는 각 분획의 대표 면역블로팅 이미지. (B-D) (B) STX6, (C) TSG101 및 (D) LC3-II에 대한 농도 분석은 면역블롯 이미지로부터 수행하였다. 신호 강도는 vehicle 또는 Baf로 처리된 대조군 또는 STX6 siRNA-transfection된 세포로 정규화되었습니다. 막대 그래프는 S.E.M.(N = 3)± 평균값을 나타냅니다. *는 Excel의 양측 쌍을 이루지 않은 t-검정에 의해 P &lt; 0.05를 나타냅니다. 약어: STX6 = 구문 6; Baf = 바필로마이신 A1; DMSO = 디메틸 설폭사이드; TSG101 = 종양 감수성 유전자 101; LC3 = 미세소관 관련 단백질 1A/1B 경쇄 3B; PCNA = 증식 세포 핵 항원; S.E.M. = 평균의 표준 오차. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig02.jpg"> 
그림 2: 비히클 및 Baf 처리 조건에서 대조군 또는 STX6 siRNA로 transfection된 Lamp1-GFP 및 mCherry-LC3를 동시 발현하는 HeLa 세포의 컨포칼 이미지 분석. (A) LAMP1-GFP 및 mCherry-LC3를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포의 컨포칼 이미지를 대조군 또는 STX6 siRNA로 48시간 동안 transfection한 후 DMSO 또는 400nM Baf에 4시간 동안 노출시켰습니다. 눈금 막대 = 20 μm. (B,C) (B) 자가포식좀(LAMP1-GFP 음성 및 mCherry-LC3 양성 점) 및 (C) 자가포식좀(LAMP1-GFP 및 mCherry-LC3 이중 양성 점)의 정열화는 피지 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 막대 그래프의 데이터는 S.E.M.(N = 3)± 평균값으로 표시됩니다. *는 P&lt; 0.05를 나타내며, Excel의 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정을 기반으로 합니다. 약어: Lamp1 = 리소좀 관련 막 단백질 1; LC3 = 미세소관 관련 단백질 1A/1B 경쇄 3B; STX6 = 구문 6; Baf = 바필로마이신 A1; GFP = 녹색 형광 단백질; S.E.M. = 평균의 표준 오차. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig03.jpg"> 
그림 3: GFP-ATG13을 발현하는 HeLa 세포의 컨포칼 이미징으로, 대조군 또는 STX6 siRNA로 transfection하고 vehicle 또는 Baf 처리를 거쳤습니다. (A) HeLa 세포를 대조군 또는 STX6 siRNA로 transfection한 후 pEGFP-C1-hAtg13 transfection하고 DMSO 또는 400nM Baf로 4시간 동안 처리했습니다. 척도 막대 = 20 μm. (B) 상대 신호 강도는 각 조건의 신호를 Baf로 처리된 대조군 siRNA-transfection된 세포의 신호로 정규화하여 측정하였다. 막대 그래프는 데이터를 평균 ± S.E.M.(N = 3)으로 표시합니다. *는 Excel의 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정에 의해 P &lt; 0.05를 나타냅니다. 약어: hAtg13 = 인간 자가포식 관련 유전자 13; STX6 = 구문 6; Baf = 바필로마이신 A1; DMSO = 디메틸 설폭사이드; S.E.M. = 평균의 표준 오차. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: 대조군 siRNA로 transfection하고 Baf로 처리한 HeLa 세포의 세포, P1 및 P2 분획의 면역블롯 분석. HeLa 세포는 control siRNA로 transfection하고 100nM Baf에 24시간 동안 노출시켰습니다. 그런 다음 세포, P1(20,000 × g 펠릿) 및 P2(110,000 × g 펠릿)의 분획을 준비했습니다. ULK1 및 PCNA의 대표적인 면역블롯 이미지로, 비교를 위해 각 분획의 수치를 보여줍니다. 약어: Baf = bafilomycin A1; ULK1 = kinase 1을 활성화하는 자가포식과 같은 unc-51; PCNA = 증식 세포 핵 항원. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385_Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

evaluation-lc3-ii-release-via-extracellular-vesicles-relation-to

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

삼투성 스트레스에는이 과정을 발표 하는 신경 전달 물질의 양과 exocytosis 영향을 줍니다. 전송 전자 현미경 검사 법 함께 전기 화학 방법 결합 수 있습니다 사용 하는 방법을 exocytosis 활동, 소포 quantal 크기, 출시 하는 신경 전달 물질의 양과에 extracellular 삼투성 압력의 효과 연구 설명 동안 exocytosis.

분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

여기 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 측정 하기 위한 간단 하 고 잘 검증 된 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 전체 셀룰러 LDH 수준에 비해 sedimentable 셀 분수에 젖 산 효소 (LDH)의 비율을 측정에 기반.

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구

여기에서, 우리는 골관절염을 위한 모형으로 이용된 연골 이병 에서 그들의 이동 그리고 upup를 감시하기 위하여 혈소판 lysate 유래 세포외 소포를 레이블을 붙이는 프로토콜을 제시합니다.

연골 내의 마이그레이션 및 섭취 모니터링을 위한 세포외 소포 라벨링

세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

AlPcS2a 매개 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)는 살아있는 세포에서 세포내 소포(IV)의 시공간 손상을 연구하기 위한 강력한 도구입니다.

세포내 소포 파열의 기능을 연구하기 위한 광역학적 접근

이 프로토콜의 목표는 LC3 면역형광 및 LC3 도트 정량화를 통해 췌장암 및 췌장 전초 세포의 자가포식 수준을 결정하는 것입니다.

LC3 면역형광법을 사용하여 두 가지 다른 췌장 세포 모델에서 자가포식 수준 평가

제안된 프로토콜에는 세포 배양 상층액에서 세포외 소포를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

암 세포주에서 유래한 낮은 내독소 함량 세포외 소포의 분리

여기서는 세포 초미세 구조와 관련된 희귀 단백질의 국소화를 조사하기 위한 도구로서 내인성 형광 표지를 기반으로 하는 최적화된 절편 상관 광전자 현미경을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법의 힘은 바필로마이신 처리 없이 굶주린 세포에서 내인성 LC3의 초구조적 국소화에 의해 입증되었습니다.

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

학습하세요 HeLa 세포를 이용한 LC3-II 양성 세포외 소포 방출 평가 방법을 통해 TDP-43 관련 신경퇴행성 질환의 자가소화 조절 메커니즘을 탐구하세요. 이 기법은 ALS 및 FTLD-TDP 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가

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