세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가
2024년 10월 18일
여기에서는 면역블로팅을 통해 세포외 소포체(EV)에서 자가포식 마커 LC3-II 수준을 간결하게 평가하는 방법론을 제시합니다. EV에서 LC3-II 수준, 자가리소좀 형성 및 오메가솜 형성에 대한 분석은 자가포좀-리소좀 융합이 억제될 때 LC3-II 양성 EV의 방출에서 STX6의 새로운 역할을 시사합니다.
우리의 연구는 ALS 또는 FTLD-TDP와 같이 세포질에 핵 단백질 TDP-43이 축적되는 것을 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 질환에 중점을 둡니다. 우리는 TDP-43 병리가 어떻게 프리온과 같은 방식으로 뇌를 통해 퍼지는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 우리는 이전에 세포외 소포체를 통한 TDP-43의 방출이 자가포식 조절 장애에 의해 매개된다는 것을 발견했습니다.
FTLD-TDP의 Progranulin는 이 과정을 촉진합니다. 다음 과제는 자가포식이 TDP-43을 포함하는 세포외 소포체의 생산 및 방출을 어떻게 조절하는지 밝히는 것이며, 이는 ALS 또는 FTLD-TDP에 대한 치료 표적의 발견으로 이어질 수 있습니다. 먼저 배양된 HeLa 세포를 가져다가 세포 카운터를 사용하여 수를 세고 배양 배지가 들어 있는 6cm 플레이트에 10을 10배로 파종하여 세포 6개의 거듭제곱을 합니다.
섭씨 37도에서 이산화탄소 5%와 습도를 조절하여 24시간 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 20마이크로몰 siRNA 용액을 준비합니다. 저농도 튜브에 100 마이크로리터의 환원 혈청 배지와 3 마이크로리터의 siRNA를 혼합하여 용액 A를 준비합니다.그런 다음 저농도 튜브에 100 마이크로리터의 환원 혈청 배지와 5 마이크로리터의 transfection 시약을 혼합하여 용액 B를 준비합니다.그런 다음 용액 A와 용액 B를 혼합한 다음 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
이제 용액 A와 B의 혼합물을 HeLa 세포 배양에 사용되는 배지에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 다음날 PBS로 세포를 세척하고 세포를 0.25% 트립신 500마이크로리터와 1밀리몰 EDTA 용액에 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 5분 동안 습도를 조절합니다. 다음으로, 배양 배지 2.5ml를 세포에 추가하고 20마이크로리터 피펫 팁이 부착된 파스퇴르 전사 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
세포를 세는 후 10cm 접시에 1 곱하기 10을 6 개의 세포의 거듭 제곱으로 파종하고 앞서 설명한 것처럼 부화합니다. 배양이 끝나면 비히클 또는 100 나노몰 바필로마이신 A1을 함유한 배양 배지를 준비합니다. 그런 다음 세포를 차량 또는 100 나노몰 바필로마이신 A1을 함유한 배지에 노출시키고 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 10cm 플레이트에서 모든 배양 배지를 수집합니다.
수집된 매체를 15밀리리터 튜브에 넣고 3, 000G에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. P1 extracellular 소포 분획을 고립시키기 위하여는, 3에 원심분리 후에 상층액을 분리 관으로 000 G 옮기십시오. 20, 000 G에 튜브를 1시간 동안 섭씨 4도에서 원심분리기.
P2 extracellular 소포 분획의 고립을 위해, 20에 원심분리법 후에 상층액을 매우 분리기 관으로 000 G를 옮긴다. 110, 000 G에 1 시간 동안 4 섭씨 온도에 그것을 분리하십시오. 실험실 물티슈로 튜브 내부의 과도한 수분을 닦아낸 후 원심분리 튜브에 남아 있는 펠릿을 50마이크로리터의 2회 시료 완충액에 재현탁시켜 P1 세포외 소포체 분획을 준비합니다.
그런 다음 디캔팅으로 상층액을 제거합니다. 실험실 물티슈로 튜브 내부의 과도한 수분을 닦아내고 초원심분리 튜브에 남아 있는 펠릿을 50마이크로리터의 2회 샘플 버퍼에 재현탁시켜 P2 세포외 소포체 분획을 준비합니다. P1 및 P2 세포외 소포체 분획을 섭씨 100도에서 열 블록에서 10분 동안 배양합니다.
배양 배지를 10cm 플레이트에서 15mm 튜브로 옮긴 후 PBS로 10cm 접시의 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포를 0.25% 트립신 2밀리리터와 1밀리몰 EDTA 용액에 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 5분 동안 습도를 조절합니다. 세포에 8ml의 성장 배지를 추가합니다.
200마이크로리터 피펫 팁이 부착된 파스퇴르 이송 피펫을 사용하여 세포를 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 000G에서 원심분리합니다. 그런 다음 흡입기를 사용하여 상층액을 제거합니다.
세포 펠릿 및 1에 PBS를 추가하고 4개의 섭씨 온도에 5 분 동안 000 G를 분리한다. PBS를 제거한 후, 1 % sarcosil을 함유 한 A68 완충액 1 밀리리터에 세포 펠릿을 초음파 처리합니다. 300 마이크로리터의 세포 용해물을 100 마이크로리터의 4회 시료 완충액과 혼합합니다.
혼합물을 섭씨 100도에서 열 블록에서 10분 동안 배양하여 세포 분획을 준비합니다.
개요
본 연구는 신경퇴행성 질환에서 TDP-43의 역할과 세포외 소포체(EVs)를 통한 TDP-43의 방출을 조사합니다. 이 연구는 TDP-43 방출을 조절하는 오토파지의 관여를 강조하며, 이는 잠재적으로 ALS 및 FTLD-TDP의 치료 표적으로 이어질 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 신경퇴행성 질환
배경
- TDP-43는 신경퇴행성 질환과 관련된 핵 단백질입니다.
- ALS 및 FTLD-TDP는 세포질 내 TDP-43 축적을 특징으로 합니다.
- TDP-43 병리학을 이해하면 질병 전파 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.
- 세포외 소포는 TDP-43 방출에 역할을 합니다.
연구 목적
- 자가포식이 TDP-43 함유 EV의 생성 및 방출을 어떻게 조절하는지 규명하기 위함입니다.
- ALS 및 FTLD-TDP의 잠재적 치료 표적을 탐색하기 위함입니다.
- TDP-43 방출에서 progranulin의 역할을 조사하기 위함입니다.
사용된 방법
- HeLa 세포의 세포 배양.
- 세포 계수기를 이용한 세포 수 측정.
- 실험을 위한 배양액 내 세포 파종.
- 오토파고좀 마커 수준 평가를 위한 면역블롯팅.
주요 결과
- LC3-II 양성 EV 방출에서 STX6의 역할 규명.
- 자가포식소체-리소좀 융합 억제 효과 분석.
- TDP-43 방출 시 자가포식 조절 장애의 증거.
- EV를 통한 TDP-43 방출에 대한 Progranulin의 촉진 작용.
결론
- 자가포식(Autophagy)은 TDP-43 방출 조절에 매우 중요합니다.
- 자가포식을 표적으로 하는 것은 ALS 및 FTLD-TDP의 새로운 치료 방안을 제공할 수 있습니다.
- 관련 기전을 완전히 이해하기 위해서는 추가적인 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
세포외 소포체(EVs)를 통한 LC3-II 방출의 정량적 평가는 신경퇴행성 질환의 진행과 연관된 과정인 오토파지 의존적 단백질 수송에 대한 기전적 통찰을 제공합니다. 본 프로토콜은 바이오 제약 팀이 병리적 단백질 확산의 분자적 결정 요인을 조사할 수 있게 하여, 신경퇴행성 질환 포트폴리오의 타겟 검증 및 리스크 조정 기반의 개발 진전을 지원합니다. 이러한 접근 방식은 오토파지 조절과 EV 매개 바이오마커 방출의 접점에서 예측 신뢰도를 강화합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- EV 매개 단백질 수출에서 자가포식 관련 유전자의 기능적 평가가 가능합니다.
- STX6와 같은 후보 타겟이 LC3-II 수송에 미치는 영향을 분리함으로써 기전적 위험 제거(de-risking)를 지원합니다.
- 신경퇴행성 질환과 관련된 경로에 대한 가설 기반의 조사를 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 세포 및 EV 분획에서 LC3-II를 정량화하기 위한 재현 가능한 면역블롯 기반 워크플로를 제공합니다.
- bafilomycin A1을 사용하여 오토파고좀-리소좀 융합 억제를 벤치마킹하는 분석 대조군을 설정합니다.
- 후속 스크리닝 응용 분야를 위한 EV 분리 및 마커 정량화의 표준화를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련 섭동 하에서 EV 관련 LC3-II를 정량화함으로써 중개 바이오마커 전략과 일치합니다.
- 자가포식 조절 개입의 기전적 발견부터 전임상 검증까지의 연속성을 지원합니다.
- 신경퇴행성 모델에서 병리적 단백질의 세포 외 확산을 평가하기 위한 플랫폼을 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 프로토콜은 오토파지와 EV 생물학에 대한 정량적이고 기전적인 판독을 가능하게 함으로써, 발견에서 전임상 단계로 이어지는 연속 과정에 통합됩니다.
- 발견 생물학: EV를 통한 LC3-II 배출을 조절하는 표적 유전자에 대한 귀무가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 조건 간 비교 분석을 위해 표준화된 정량적 면역블롯 결과물을 제공합니다.
- 분석: 경로 및 소포 특이성을 확인하기 위한 직교 마커로서 LC3-II와 TSG101의 측정을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 기전적 발견을 단백질 응집 및 확산과 관련된 질환 모델로 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 오토파지 및 EV 연구 프로그램에 적용 가능한 모듈형 워크플로우를 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 오토파지 및 EV 경로의 표적 검증에 대한 예측 신뢰도를 높임.
- 운영적 가치: 재현 가능하고 확장 가능한 연구를 위해 EV 분리 및 LC3-II 정량화 과정을 표준화함.
- 전략적 가치: 단백질 확산의 기전적 역할을 명확히 하여 신경퇴행성 질환 표적에 대한 진행/중단(go/no-go) 결정에 정보를 제공함.
- 포트폴리오 영향: 신경퇴행성 질환 파이프라인 내 오토파지 조절 후보 물질의 위험 조정 우선순위 선정을 가능하게 함.
실행 시 고려 사항
- 세포 배양, siRNA 형질전환 및 면역블롯팅 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- EV 분리를 위한 고속 및 초원심분리 인프라 접근이 필요합니다.
- 시료 준비 및 마커 정량화를 위해 팀 간의 엄격한 표준화가 필수적입니다.
- 다양한 세포 모델에 적용 가능하나, 일차 세포 또는 질환 관련 시스템의 경우 최적화가 필요할 수 있습니다.
- LC3-II 및 TSG101 결과 해석 시 경로 특이성과 실험 대조군을 반드시 고려해야 합니다.
