Name: Fluorescent end-labeling and encapsulation of long RNAs for single-molecule FRET-TIRF microscopy(단일 분자 FRET-TIRF 현미경을 위한 Long RNA의 형광 말단 라벨링 및 캡슐화) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 단일 분자 FRET-TIRF 현미경을 위한 긴 RNA의 이중 형광 말단 라벨링 및 인지질 소포 캡슐화 방법을 통해 RNA 역학을 실시간으로 관찰하는 기술입니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>smFRET-TIRF 연구를 위한 RNA의 이중 색상 말단 표지 및 소포 캡슐화

<ol><li>Eitan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+dynamic+structural+biology%3A+Challenges%2C+perspectives+and+an+appeal+for+open-science+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices.</a> Elife. 10, e60416(2021).</li>
<li>Taekjip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer at the single-molecule level.</a> Nat Rev Methods Primers. 4, 22(2024).</li>
<li>Ahunbay, E., Steffen, F. D., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+dual+end-labeling+of+large+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical dual end-labeling of large ribozymes.</a> Methods Mol Biol. 2439, 191-204 (2022).</li>
<li>Ahunbay, E., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+Introns%3A+Highly+structured+yet+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia+%28Aarau%29%22%5BJournal%5D)">Group II Introns: Highly structured yet dynamic.</a> Chimia (Aarau). 77 (4), 235-241 (2023).</li>
<li>Steiner, M., Karunatilaka, K. S., Sigel, R. K. O., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+group+II+intron+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of group II intron ribozymes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (37), 13853-13858 (2008).</li>
<li>Karunatilaka, K. S., Solem, A., Pyle, A. M., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+Mss116-mediated+group+II+intron+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of Mss116-mediated group II intron folding.</a> Nature. 467 (7318), 935-939 (2010).</li>
<li>Paudel, B. P., Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+crowding+accelerates+group+II+intron+folding+and+maximizes+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular crowding accelerates group II intron folding and maximizes catalysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (47), 11917-11922 (2018).</li>
<li>Saha, R., Verbanic, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+vesicles+chaperone+an+encapsulated+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid vesicles chaperone an encapsulated RNA aptamer.</a> Nat Commun. 9 (1), 2313(2018).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+surface-tethered+lipid+vesicles+as+a+new+tool+for+single+biomolecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Immobilization in surface-tethered lipid vesicles as a new tool for single biomolecule spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Cisse, I., Okumus, B., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+protein+DNA+interactions+inside+porous+nanocontainers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Fueling protein DNA interactions inside porous nanocontainers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (31), 12646-12650 (2007).</li>
<li>Zelger-Paulus, S., Hadzic, M. C. A. S., Sigel, R. K. O., Börner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+fluorescently+labeled+RNAs+into+surface-tethered+vesicles+for+single-molecule+FRET+studies+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of fluorescently labeled RNAs into surface-tethered vesicles for single-molecule FRET studies in TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 2331, 1-16 (2020).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
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<li>Peng, H., Lelievre, A., Landenfeld, K., Müller, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+stabilizes+intermolecular+association+and+structure+formation+of+functional+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation stabilizes intermolecular association and structure formation of functional RNA and DNA.</a> Curr Biol. 32 (1), 86-96.e6 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>RNA 라벨링</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; mL DNA LoBind 튜브&nbsp;</td><td>에펜도르프&nbsp;</td><td></td><td></td>30108035</tr><tr><td>1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC-HCl 또는 EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11844071</td><td>피어스 EDC, 중량 없음 형식. 매장&nbsp; -20 > C</td></tr><tr><td>3-모르폴리노프로판-1-설폰산(MOPS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>69947</td><td>BioUltra, 분자생물학, &ge; 99.5% (적정)</td></tr><tr><td>아세트산(빙하)</td><td>시그마-알드리치</td><td>1.00063</td><td>100%, 분석용 무수 EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>원심 여과 장치&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>VS0132</td><td>Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 &mu; L</td></tr><tr><td>Cyanine5 하이드라지드 (Cy5-하이드라지드)</td><td>Lumiprobe</td><td>23070</td><td>5 mg, CAS 번호 1427705-31-4&nbsp;</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>New England Biolabs</td><td>12611P</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR 화학 물질</td><td>20821.296P</td><td>절대 &ge; 99,8%</td></tr><tr>분자생물학을 위한 <td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5516</td><td>, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>염산(HCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>1.00317</td><td>연기 37%, 분석용 EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>N-hydroxys숙신이미드 (NHS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>130672</td><td>98%</td></tr><tr><td>아세트산나트륨(NaOAc)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8750</td><td>무수, ReagentPlus, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>메타주기산나트륨(NaIO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Life Technologies</td><td>20504</td><td>Pierce 제품 라인</td></tr><tr><td>Sulfo-Cyanine3 아민(sCy3-아민)</td><td>Lumiprobe</td><td>213C0</td><td>5 mg, CAS 번호 2183440-43-7</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Biosolve</td><td>200923</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>챔버 준비</ 강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>440140</td><td>99%</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>분석용 시그마-알드리치</td><td>1.00014</td><td>EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>비오틴-폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 발레레이트(비오틴-PEG-SVA, bPEG) 및 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙시니미딜 발레레이트(mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td>BIO-PEG-SVA, MW 5,000 및 MPEG-SVA, MW 5,000 - 콤보 키트</td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>Carl Roth</td><td>H876.2</td><td>24 x 24 mm, 0.13-0.16&nbsp; mm 두께</td></tr><tr><td>Deconex 11 범용</td><td>Borer Chemie AG</td><td>17416492</td><td>실험실 유리 세척 용액</td></tr><tr><td>다이아몬드 코팅 코어 드릴 비트</td><td>Crystalite Corporation</td><td></td><td>1mm 두께</td></tr><tr><td>다이아몬드 드릴러</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR 화학 물질</td><td>20821.296P</td><td>절대 &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>유리 코플린 염색 항아리 커버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미징 스페이서</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>SecureSeal, 8 웰,&nbsp; 9&nbsp; mm &시간; 0.12&nbsp; mm</td></tr><tr><td>산소 플라즈마 클리너</td><td>Zepto One</td><td></td><td>Diener</td></tr><tr><td>수산화칼륨 (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>분자 생물학, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>석영 슬라이드</td><td>G. Finkenbeiner, Inc.</td><td></td><td>7.5&nbsp; 엑스&nbsp; 2.5&nbsp; cm, 1mm 두께</td></tr><tr><td>중탄산 나트륨 (NaHCO3)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>BioXtra, 99.5-100.5%</td></tr><tr><td>Lipid cake preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16:0 Biotinyl Cap PE, bPE(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)(나트륨염), C53H98N4O11PNaS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870277P</td><td>-20에서 1년 동안 안정 &데그; C</td></tr><tr><td>14:0 PC, DMPC (1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 또는 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, C36H72NO8P)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL microcentrifuge tubes, Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>Autoclave로</td></tr><tr><td>500&nbsp; mL 슐렝크 플라스크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Merck</td><td>1.02445</td><td>분석용 EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>캡슐화를 통한 표면 고정</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (트롤록스)</td><td>Thermo Fischer</td><td>53188-07-1</td><td>97%</td></tr><tr><td>3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, 분자 생물학, &ge; 99.5%(적정). +4 &deg에 저장하십시오. 어둠 속에서 C.</td></tr><tr><td>접착 씰 탭</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>629200</td><td></td></tr><tr><td>카탈라제</td><td>시그마-알드리치</td><td>9001-05-2,</td><td>소 간에서 추출한 C30, 수성 현탁액, 10,000-40,000 단위/mg 단백질</td></tr><tr><td>D-포도당</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7528</td><td>&ge; 99.5% (GC), BioXtra</td></tr><tr><td>압출기 폴리카보네이트(PC) 멤브레인</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005-1EA</td><td>0.1 &mu; m,</td></tr><tr><td>가열 블록이 있는 19mm 압출기 세트</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>포도당 산화효소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-37-0</td><td>from Aspergillus niger, Type VII,&nbsp; 동결건조 분말, &ge; 100,000 units/g 고체 (산소가 첨가되지 않음)</td></tr><tr><td>염화마그네슘 (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3, 분자 생물학용 M1028</td><td>, 1.00 M & 0.01 M 용액</td></tr><tr><td>폴리에스터(PE) 드레인 디스크, 멤브레인</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>230300</td><td>10mm</td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>BioUltra, 분자생물학용, &ge; 99.5 % (AT)</td></tr> <tr><td>수산화 칼륨 (KOH)</td> 분자 생물학 용 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fischer</td><td>434301</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent end-labeling and encapsulation of long rnas for single-molecule fret-tirf microscopy(단일 분자 fret-tirf 현미경을 위한 long rna의 형광 말단 라벨링 및 캡슐화)

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

관심 있는 915-nt RNA, 효모 미토콘드리아 Sc.ai5γ group II intron의 부위 특이적 단일 및 이중 형광 라벨링을 제시합니다. FRET 형광단 쌍은 5'-인산염의 EDC/NHS 활성화와 3'-리보스의 주기적 산화를 통해 RNA 말단에 배치된 후 각각의 염료 부착이 뒤따릅니다. 그런 다음 그림 4A와 같이 형광 겔 전기영동으로 RNA-dye 접합체를 검증했습니다. 아가로스 겔에서 RNA와 fluorophores의 동시 이동은 성공적인 라벨링을 확인합니다. 다음으로, 그림 4B에서 볼 수 있듯이 앙상블 형광 분광법을 사용하여 이중 표지된 그룹 II 인트론을 특성화했습니다. 에너지 전달, 즉 FRET는 공여체 염료의 여기 시 관찰되어 RNA의 이중 표지를 입증했습니다. 특히, FRET의 거리 의존적 특성과 일관되게 금속 이온이 있는 상태에서 그룹 II 인트론 RNA의 접힘은 공여체 방출(녹색 화살표)의 감소와 이에 따른 수용체(빨간색 화살표) 방출의 증가로 입증된 바와 같이 FRET 효율의 증가로 이어졌습니다. 이는 이 FRET 라벨링이 리보자임의 구조적 변화를 추적한다는 것을 나타냅니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig04.jpg"> 
그림 4: RNA-dye conjugates의 특성 분석. (A) 단일 및 이중 형광 표지된 RNA의 분석 겔 기반 분석은 2% 아가로스 겔에서 염료와 RNA의 동시 이동을 보여줍니다. 이중 표지된 샘플에서 형광단의 공동 국소화는 각각 532nm 및 635nm 조명에서 시각화된 Cy3(상단, 녹색) 및 Cy5(중간, 빨간색) 채널의 병합된 이미지(하단)에서 노란색 띠로 표시됩니다. 1번 레인: 5'-sCy3는 RNA만 라벨링, 2번 레인: 3'-Cy5는 RNA만 라벨링, 3번 레인: 듀얼 엔드(5'-sCy3 및 3'-Cy5) 라벨링 RNA. (B) 앙상블 형광 분광법은 이중 라벨링을 확인합니다. donor excitation 시 에너지 전달(λex = 515 nm, λem = 670 nm)은 두 염료가 RNA에 성공적으로 결합되었음을 확인합니다. 회색 곡선은 pre-catalytic RNA의 방출 프로파일을 나타내고, 검은색 곡선은 접힌 그룹 II 인트론 RNA에서 증가된 FRET 효율성을 보여줍니다(70°C에서 500mM KCl로 3분 동안 배양, 5분 동안 42°C로 냉각한 후 100mM MgCl2 첨가). 이 그림은 Ahunbay et al.에서 각색되었습니다.3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
형광 이중 표지된 야생형 그룹 II 인트론을 손에 넣으면, 우리는 이제 단일 분자 수준에서 그 역학을 탐구할 수 있는 위치에 있습니다. 인지질 소포에 캡슐화되면 표지된 RNA는 smFRET-TIRF에 대한 단일 분자 분해능을 달성하기 위해 매우 낮은 표면 밀도로 현미경 표면에 고정됩니다. 그림 5A에서 볼 수 있듯이 여러 개별 분자를 동시에 추적할 수 있습니다. TIRF 현미경을 사용하면 FRET 효율성과 시간 경과에 따른 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 그림 5B 는 라벨링되고 캡슐화된 RNA의 정적 및 동적 단일 분자 FRET 추적을 보여줍니다. 일반적인 동적 트레이스는 FRET 효율을 변동시키는 donor 신호와 acceptor 신호 간의 반상관 관계를 나타냅니다. donor excitation에 대한 acceptor 방출이 증가하면 donor 방출도 그에 따라 감소하며, 이는 염료 간 거리의 동적 변화를 나타냅니다. 이 반상관관계는 RNA 분자의 구조적 변화를 시사합니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig05.jpg"> 
그림 5: smFRET에 의해 밝혀진 그룹 II 인트론 RNA의 매우 동적인 거동. dual-end labeled group II intron RNA는 인지질 소포에 캡슐화되어 있고 objective-based TIRF microscope로 이미징하기 위해 표면에 고정됩니다. (A) 532nm 여기 시 donor 방출(sCy3, 녹색) 및 acceptor 방출(Cy5, 빨간색)을 나타내는 개별 표지된 RNA 분자의 병합된 이미지. (B) (왼쪽) donor 및 acceptor 강도가 시간이 지남에 따라 변동하지 않는 static RNA 분자와 donor 및 acceptor intensities가 anticorrelate와 함께 FRET 효율이 노란색으로 표시된 동적 RNA 분자의 일반적인 smFRET 궤적. 단일 분자는 MASH-FRET17을 사용하여 국소화되고 분석됩니다. Direct excitation, bleed-through 및 γ-factor 보정이 적용됩니다. 약어: smFRET = single-molecule Förster Resonance Energy Transfer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Fluorescent end-labeling and encapsulation of long RNAs for single-molecule FRET-TIRF microscopy(단일 분자 FRET-TIRF 현미경을 위한 Long RNA의 형광 말단 라벨링 및 캡슐화)

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

이 연구 결과는 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 이중 가닥 DNA의 반복 역학을 측정하는 상세한 실험 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 J 인자라는 반복 확률 밀도를 추출하는 방법에 대해 설명합니다.

단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

단일 분자 형광 에너지 전달은 리보소말 단백질 합성 시 tRNA 역학을 추적하는 방법입니다. 개별 리보솜을 추적함으로써, 불동성 집단 집단이 식별되어 메커니즘에 빛을 비추게 됩니다. 이 방법은 다른 많은 복잡한 생물 시스템에서 동적 기능 관계를 밝히기 위해 일반적으로 생물학적 형성 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 단일 분자 방법은 평균 효과로 인해 기존의 앙상블 방법에 의해 접근할 수 없는 비비율 제한 단계 및 낮은 인구밀도키 중간체를 관찰할 수 있다.

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

이 연구는 비천연 아미노산(UAA) 통합을 통한 부위 특이적 표지를 사용하여 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 실험을 수행하는 자세한 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 smFRET 샘플 준비, 실험 및 데이터 분석을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화

다이나민 슈퍼패밀리 단백질의 기능은 GTP 가수분해와 결합된 구조적 변화에 의존합니다. 시스템은 다양한 뉴클레오티드 로딩 상태에서 dynamin-like GTPase atlastin의 구조적 역학을 모니터링하기 위해 smFRET(single-molecule FRET) 기술을 사용하여 설명됩니다.

Dynamin-like GTPase Atlastin의 구조적 역학을 관찰하기 위한 Single-molecule FRET 이미징

이 프로토콜의 목표는 시험관 내에서, 생체 포유류 세포 및 3차원 세포 모델에서 재현 가능한 RNA 영상 워크플로우를 위해 Riboglow 프로브의 정량적 형광 수명 측정을 가능하게 하는 것입니다. 우리는 편향되지 않은 형광 수명 측정을 추출하기 위한 샘플 준비, 프로브 전달, 데이터 수집 및 정량적 분석 워크플로우를 개괄합니다.

생포유류 세포 및 3차원 세포 모델에서 형광 평생 영상 기초로 리보글로우 프로브를 시험 관 내에서 특성화하기

배우세요 단일 분자 FRET-TIRF 현미경을 위한 긴 RNA의 이중 형광 말단 라벨링 및 인지질 소포 캡슐화 방법을 통해 RNA 역학을 실시간으로 관찰하는 기술입니다.

Fluorescent end-labeling and encapsulation of long RNAs for single-molecule FRET-TIRF microscopy(단일 분자 FRET-TIRF 현미경을 위한 Long RNA의 형광 말단 라벨링 및 캡슐화) (동영상) | JoVE Journal

Fluorescent end-labeling and encapsulation of long RNAs for single-molecule FRET-TIRF microscopy(단일 분자 FRET-TIRF 현미경을 위한 Long RNA의 형광 말단 라벨링 및 캡슐화)

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