Fluorescent end-labeling and encapsulation of long RNAs for single-molecule FRET-TIRF microscopy(단일 분자 FRET-TIRF 현미경을 위한 Long RNA의 형광 말단 라벨링 및 캡슐화)

우리의 연구는 촉매 활성 RNA의 역학과 이러한 역학이 다양한 환경 조건에서 어떻게 변하는지에 중점을 둡니다. 우리는 단일 분자 FRET를 사용하여 단가 및 2가 정중선, 샤페론 단백질 및 군집제와 같은 요인이 RNA 역학에 미치는 영향을 연구합니다. RNA 구조와 기능을 방해하지 않고 donor 및 acceptor fluorophores를 정확하게 통합하는 것은 어려운 일입니다.

또한 큰 동적 RNA의 접힘을 추적하는 것은 어렵습니다. 그러나 확립된 라벨링 및 캡슐화 프로토콜을 통해 시간 경과에 따른 기능적 RNA의 접힘 역학을 모니터링할 수 있습니다. 당사의 프로토콜은 신생리학적 조건에서 실시간으로 대량의 촉매 활성 RNA를 관찰하는 문제를 해결합니다.

RNA와 소포를 공유 결합으로 라벨링하고 캡슐화한 다음 표면에 고정함으로써 단일 분자 TIRF로 RNA 기능을 모니터링할 수 있습니다. 당사는 long catalytic RNAs, 특히 group II introns의 공유 FRET 라벨링에 중점을 둡니다. 이것은 구조적 복잡성으로 인해 어려운 과제입니다.

소포에 캡슐화되면 TIRF 현미경 검사를 위해 RNA를 증발장 내에 유지할 수 있지만 RNA는 자유롭게 떠다닐 수 있습니다. 이러한 방식으로 smFRET은 방해 없이 RNA의 동적 거동을 드러낼 수 있습니다. 우리는 다중 기술 접근 방식을 사용하여 리보솜, 리보스위치 및 기타 조절 RNA의 구조-기능 관계 및 역학에 중점을 두고 자연이 실제로 어떻게 작동하는지 이해하려고 계속 노력할 것입니다.

따라서 생리학적 및 세포적 조건 하에서의 연구를 향해 나아가는 것이 향후 우리 작업의 주요 강조점이 될 것입니다. 먼저, 55 마이크로리터의 이중 증류수에 튜브당 50-75 마이크로그램의 RNA가 들어 있는 관심 RNA를 분취한 다음 45 마이크로리터의 EDC/NHS 아세트산 나트륨 pH 6 혼합물을 RNA에 첨가합니다. 혼합물을 섭씨 25도에서 500RPM으로 흔들면서 4시간 동안 배양합니다.

배양 후 활성 RNA 펠릿을 95마이크로리터의 100밀리몰 걸레 완충액 pH 7.5에 재현탁시킵니다. 그런 다음 활성화된 RNA에 5마이크로리터의 2밀리몰 술폰화 시안닌-3 아민을 첨가하고 섭씨 25도에서 500RPM으로 16시간 동안 배양하여 형광단을 활성화된 5-프라임 인산염에 결합합니다. 다음 날 200마이크로리터의 이중 증류수를 추가하여 분리를 개선합니다.

그런 다음 에탄올 침전으로 RNA로 표지된 5-프라임 인산염을 정제합니다. 정제 후 라벨링된 RNA를 100밀리몰 트리스 HCl 100마이크로리터에 재현탁시키고 섭씨 25도에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 유리 염료를 제거하려면 라벨이 부착된 RNA를 원심 여과를 사용하여 이중 증류수로 세척합니다.

이중 말단 라벨링의 경우, 90 마이크로리터의 용액에 튜브당 약 50-75 마이크로그램의 RNA를 함유한 5-프라임 말단 표지 RNA를 분취하십시오. 5 마이크로 리터의 1 몰 아세트산 나트륨 완충액 pH 5.5를 첨가합니다. 그런 다음 4 마이크로 리터의 갓 준비한 500 밀리몰 메타 시대 나트륨 원액을 추가합니다.

3-프라임 말단 단일 라벨링의 경우 8 마이크로리터의 메타 주기적 스톡 용액을 추가합니다. 용액을 어두운 곳에서 2시간 동안 배양한 후 50% 글리세롤 30마이크로리터를 피펫팅하여 반응을 중지합니다. 30분 배양 후 400마이크로리터의 얼음처럼 차가운 에탄올 아세트산 나트륨 침전 혼합물을 추가합니다.

산화된 RNA 펠릿을 95 마이크로리터의 50밀리몰 아세트산나트륨 완충액 pH 6에 재현탁시킵니다. 이전에 입증된 것처럼 에탄올 침전 및 원심 여과를 통해 dual-end-labeled RNA를 정제합니다. 정제된 RNA를 이중 증류수에 용출합니다.

각 단계 후에 얻은 상층액 및 펠릿 색상을 시각적으로 비교합니다. UV 가시광선 분광 광도계에서 RNA 및 접합체 염료 농도를 계산합니다. 형광 겔 전기영동은 RNA와 형광단의 동시 이동(comigration)으로 나타난 바와 같이 RNA의 성공적인 단일 및 이중 라벨링을 확인했습니다.

FRET 효율은 금속 이온이 있을 때 증가하여 RNA 접힘을 나타내며, 이는 donor emission의 감소와 acceptor emission의 증가로 이어졌습니다. 미세유체 챔버를 준비하려면 다이아몬드 드릴러를 사용하여 석영 슬라이드에 4개의 구멍을 뚫어 두 개의 채널을 형성합니다. 뚫린 석영 슬라이드와 약 두 배의 커버슬립을 덮개가 있는 유리 코플린 염색 병에 넣습니다.

슬라이드와 커버슬립을 이중 증류수에 5분 동안 초음파 처리합니다. 다음으로, 섭씨 50도에서 30 분 동안 10 % 실험실 유리 제품 세척 용액에 항아리를 초음파 처리합니다. 항아리를 이중 증류수로 헹군 후 1몰 수산화칼륨 용액에 30분 동안 초음파 처리하고 하룻밤 동안 용액에 그대로 둡니다.

증류수로 반복 헹굼 및 초음파 처리 한 후 질소 가스 흐름을 사용하여 슬라이드와 커버 슬립을 건조시킵니다. 건조된 슬라이드와 커버슬립을 산소 플라즈마 클리너로 30분 동안 처리합니다. 깨끗한 슬라이드와 커버슬립을 3% AP 테스트 에탄올 용액이 들어 있는 Coplin 염색 용기에 넣고 1분 동안 초음파 반응을 한 다음 30분 동안 배양합니다.

슬라이드와 커버슬립을 절대 에탄올과 이중 증류수로 각각 세 번 헹구고 질소 가스 흐름으로 건조시킵니다. 다음으로, 빈 피펫 팁 상자에 이중 증류수를 반쯤 채워 습한 상자를 준비합니다. 처리할 면이 위를 향하도록 슬라이드를 상자 안에 놓습니다.

갓 준비한 bPEG/mPEG 혼합물 30마이크로리터 방울을 슬라이드 중앙에 추가하여 두 채널을 모두 덮습니다. 깨끗한 커버슬립으로 물방울을 덮고 습기가 많은 상자를 닫습니다. PEGylation을 위해 어두운 곳에서 밤새 상자를 배양합니다.

다음 날, PEG 부동태화 및 비오틴화 슬라이드와 커버슬립을 이중 증류수로 헹구고 처리된 표면의 소수성 변화를 관찰합니다. 슬라이드에 양면 스티커를 부착하여 스티커가 관심 영역을 덮도록 합니다. 그런 다음 커버슬립을 슬라이드 위에 조심스럽게 놓고 PEGylated 표면이 서로 마주보도록 정렬합니다.

조립된 챔버를 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브에 질소 가스를 채웁니다. 시작하려면 멸균 바늘을 사용하여 멸균 깨끗한 2밀리리터 튜브의 뚜껑에 안쪽에서 바깥쪽으로 구멍을 뚫습니다. 109 마이크로리터의 bPE-DMPC 혼합물을 튜브에 추가합니다.

마이크로튜브 보관 상자의 판지 셀 파티션 삽입물을 500밀리리터 슐렝크 플라스크에 넣어 튜브 홀더 역할을 합니다. 긴 핀셋을 사용하여 지질 혼합물이 들어있는 튜브를 튜브 홀더에 조심스럽게 넣습니다. 밤새 질소 가스의 낮은 흐름으로 클로로포름을 증발시킵니다.

건조된 지질층을 얻은 후 튜브를 파라필름으로 밀봉하여 구멍을 덮습니다. 100나노미터 폴리카보네이트 멤브레인과 10mm 폴리에스테르 드레인 디스크를 사용하여 압출기를 조립합니다. 주사기와 멤브레인을 깜박임 방지 버퍼로 평형을 유지합니다.

dual-end-labeled RNA를 anti-blinking buffer와 혼합한 후, 섭씨 30도에서 RNA anti-blinking buffer 혼합물로 지질 케이크를 수화시킵니다. 1, 400 RPM에서 5분 동안 흔든 다음 700 RPM에서 15분 동안 흔듭니다. 13, 000 G에 2 분 동안 혼합물을 분리하고, 반대로 번쩍이는 완충액의 250 마이크로리터를 가진 상청액을 묽게 한다.

주사기에 RNA 지질 현탁액을 채우고 가열 블록에서 섭씨 30도에서 35회 압출하여 이중 말단 표지된 RNA를 100나노미터 직경의 인지질 소포에 캡슐화합니다. 실온에서 200 마이크로리터의 5X 표준 버퍼로 챔버를 두 번 플러시합니다. 50 마이크로리터의 밀리리터당 20마이크로리터 스트렙타비딘 용액으로 챔버를 채우고 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 200 마이크로리터의 표준 완충액과 100 마이크로리터의 깜박임 방지 완충액으로 챔버를 세척합니다. 75 마이크로리터의 소포 현탁액을 추가하고 캡슐화된 RNA를 표면에 고정화하기 위해 10분 동안 배양합니다. 고정화 후 갓 준비된 이미징 버퍼 200마이크로리터로 챔버를 세척합니다.

데이터 수집을 위해 챔버를 TIRF 현미경에 장착하고 교대 레이저 여기로 smFRET 데이터를 획득합니다. TIRF 현미경을 사용한 단일 분자 FRET 이미징은 개별 RNA 분자를 추적하고 FRET 효율성의 실시간 변화를 감지했습니다. Dynamic Single-Molecule trace는 donor와 acceptor 신호 사이의 반상관 변동을 보여주었으며, 이는 RNA의 확증적 변화를 나타냅니다.