엔지니어링 키메라 항원 수용체-비바이러스성 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 사용하여 곰팡이 감염을 표적으로 하는 자연 살해 세포

우리의 연구는 침습성 진균 감염에 대한 기성품 CAR 세포 치료제 개발에 중점을 두고 있습니다. 우리는 최적의 치료 결과를 달성하기 위해 최상의 표적, CAR 설계 및 면역 세포 조합을 식별하는 것을 목표로 합니다. 자체 연구를 포함한 최근의 개발은 아스페르길루스 푸미가투스를 표적으로 하는 CAR T 세포 치료제 개발에 중점을 두고 있습니다.

이러한 조작된 세포는 전임상 모델에서 진균 부담을 크게 줄이고 항진균 면역을 제어하며 전체 생존을 개선함으로써 유망한 결과를 보여주었습니다. 현재 이 분야의 대부분의 연구는 바이러스 벡터 또는 수면 미용 전이 시스템을 사용하여 매우 제한된 표적 세트에 특이적인 CAR T 세포를 생산하는 데 집중되어 있습니다. 주요 과제는 최적의 진균 표적을 식별하고 임상 응용 분야에 효과적이고 확장 가능한 즉시 사용 가능한 세포 제품을 생산하는 것입니다.

이 프로토콜을 통해 비바이러스 CAR-NK 세포를 생성하기 위한 비용 효율적이고 확장 가능한 방법에 대한 필요성을 해결하고 있습니다. 이는 새로운 항진균 표적을 스크리닝하기 위한 접근 가능한 접근 방식을 제공하여 진균 감염에 대한 기성품 CAR-NK 세포 요법을 향한 근본적인 단계를 제공합니다. 시작하려면 현미경으로 NK-92 세포에 깨끗한 배경의 클러스터가 있는지 확인하고, 각 조건에 대해 웰당 2ml의 세포 배양 배지를 6웰 플레이트에 추가한 다음 플레이트를 5%의 이산화탄소가 함유된 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 넣습니다.

6개의 NK-92 세포의 전원으로 8 곱하기 10을 15ml 원뿔형 바닥 튜브에 넣고 200G에서 튜브를 3의 가속 및 감속으로 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버린 후 세포 펠릿이 들어있는 튜브에 최대 15ml의 예열 된 PBS를 채우고 다시 원심 분리기를 사용하십시오. 원심분리 중에 8마이크로그램의 Af-CAR 플라스미드 DNA와 4마이크로그램의 SB100X 미니서클을 하나의 반응 튜브에 피펫팅하고 두 번째 튜브 DNA를 모의 대조군 역할을 할 수 있도록 자유롭게 유지합니다.

transfection 시스템의 경우 첫 번째 튜브에 3ml의 전해 완충액을 추가하고 피펫 스테이션에 넣습니다. 원심분리 후, 상층액을 부드럽게 버리고 세포 펠릿을 200마이크로리터의 재현탁액에 재현탁액에 재현탁합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 세포 현탁액을 두 개의 반응 튜브 각각에 넣고 부드럽게 혼합합니다.

transfection system 피펫을 사용하여 첫 번째 반응 튜브로부터 DNA 세포 혼합물을 피펫팅하고, 피펫 스테이션의 튜브에 수직으로 transfection 피펫을 삽입합니다. 첫 번째 펄스를 1, 650볼트로 설정하고 펄스 시간을 20밀리초 동안 설정한 후 start를 눌러 펄스를 시작합니다. 첫 번째 펄스 후 두 번째 펄스를 500볼트로 설정하고 펄스 시간을 100밀리초로 설정하고 두 번째 펄스를 시작합니다.

두 번째 펄스가 완료되면 피펫 스테이션에서 피펫을 천천히 제거합니다. 즉시 2ml의 예열된 세포 배양 배지가 들어 있는 준비된 배양 플레이트의 한 웰로 세포를 옮기고 플레이트를 원을 그리며 부드럽게 움직여 세포를 고르게 분포시킵니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 플레이트를 5%의 이산화탄소로 배양합니다.

30분의 배양 후 인터루킨-2를 밀리리터당 150 국제 단위의 최종 농도로 웰에 첨가합니다. 먼저 NK-92 세포를 원하는 플라스미드로 transfection합니다. 세포를 15ml 원추형 바닥 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 세포를 원심 분리하고 완충액을 사용하여 100 마이크로 리터 당 6 세포의 힘으로 1-2 곱하기 10의 농도로 희석합니다. 6개 세포의 거듭제곱에 10 곱하기 10당 1마이크로리터의 항 EGFR-T 비오틴을 추가하고 용액이 고르게 분포되도록 부드럽게 혼합합니다. 섭씨 4도에서 25분 동안 튜브를 배양합니다.

배양 후 튜브에 최대 10ml의 완충액을 채웁니다. 다음으로 튜브를 200G에서 가감속 3으로 5분간 원심분리하고 원심분리 후 상층액을 버립니다. 그런 다음 8마이크로리터의 콜드 버퍼를 추가한 다음 6개 세포의 거듭제곱에 10을 곱하기 당 2마이크로리터의 항비오틴 마그네틱 비드를 추가합니다.

튜브를 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 세포를 세척하려면 튜브에 최대 10ml의 완충액과 원심분리기를 채웁니다. 상층액을 버린 후 500마이크로리터의 완충액에 세포를 재현탁합니다.

최대 자석에 LS 컬럼을 넣고 3ml의 버퍼로 세척합니다. 버퍼가 컬럼을 통해 완전히 마이그레이션된 후 cell suspension을 추가합니다. 컬럼을 세척한 후 자석에서 컬럼을 제거하고 깨끗한 15ml 원추형 바닥 튜브에 넣습니다.

컬럼에 5ml의 완충액을 추가하고 플런저를 사용하여 EGF-R 양성 세포를 최대한 빨리 씻어냅니다. 회수 후 형질주입 효율은 10-20%에 도달하고 최대 농축으로 Af-CAR-NK-92 세포 순도가 95% 이상으로 증가먼저 자기 활성화 세포 분류 기술을 사용하여 농축된 전이유전자 발현 NK-92 세포를 얻습니다. 그런 다음 배지에서 밀리리터당 5 코니디아의 거듭제곱에 대해 2.5 곱하기 10의 농도로 Aspergillus fumigatus conidia 현탁액을 준비합니다.

100마이크로리터의 분생포자 현탁액을 96웰 배양 플레이트의 각 웰에 분배하고 플레이트를 섭씨 25도에서 16시간 동안 배양합니다. 2일차에 모의 세포와 플라스미드 형질주입된 NK-92 세포를 배지로 2회 세척하고 곰팡이가 포함된 플레이트의 웰당 배지 당 100마이크로리터의 배지에 4개의 NK-92 세포의 거듭제곱에 5배의 10을 추가하여 공동 배양합니다. 섭씨 37도의 가습 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 최소 6시간 동안 배양합니다.

플레이트를 300G에서 5분 동안 원심분리한 후 바닥을 건드리지 않고 각 웰에서 100마이크로리터의 상층액을 수확합니다. 마지막으로 상등액을 반응 튜브로 옮겨 ELISA를 수행합니다. Af-CAR-NK-92 세포는 aspergillus fumigatus 생식관과의 공동 배양 동안 모의 NK-92 세포에 비해 훨씬 더 높은 인터페론 감마 분비를 보여주었습니다.