Name: 엔지니어링 키메라 항원 수용체-비바이러스성 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 사용하여 곰팡이 감염을 표적으로 하는 자연 살해 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 배우세요 Sleeping Beauty 트랜스포존 시스템을 사용하여 Aspergillus fumigatus를 표적으로 하는 CAR-NK 세포를 생성하는 방법. 이 비바이러스성 유전자 전달 기술은 침습성 진균 감염 치료를 위한 즉시 사용 가능한 세포 치료제 개발에 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>곰팡이 병원체를 표적으로 하기 위한 CAR-NK 세포를 얻기 위한 잠자는 숲속의 미녀 접근법

<ol><li>Fang, W., Latgé, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe+profile%3A+Aspergillus+fumigatus%3A+A+saprotrophic+and+opportunistic+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen.</a> Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>15 ML 원뿔형 바닥 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERILE</td></tr><tr><td>50 ML 원뿔형 바닥 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227270</td><td>PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE</td></tr><tr><td>6 및 96-Well- 세포 배양 플레이트</td><td>Corning Inc. LifeSciences</td><td>83-3736/ 83-3474</td><td>TC 처리된 다중 웰 플레이트, 평평한 바닥, 최적의 세포 부착을 위해 처리, 감마선 조사로 멸균, 비발열성</td></tr><tr><td>7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td>유세포 분석 분석에서 생존 불가능한 세포를 배제하기 위한 사용하기 쉬운 핵산 염료</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-human EGFR</td><td>Antibody Biolegend</td><td>352918</td><td>Clone AY13</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads UltraPure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-637</td><td>UltraPure MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin 항체</td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatus</td><td>ATCC</td><td>46645</td><td></td></tr><tr><td>생물권 필터 팁 (20 및 100 &mu; 엘)&nbsp;</td><td>사르슈테트</td><td>70.3030.365 / 70.3030.275</td><td></td></tr><tr><td>둘베코&프라임; s 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8537</td><td>&nbsp; 수정됨, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합, 내독소, 테스트</td></tr><tr><td>ELISA MAX 디럭스 세트 인간 IFN-&감마;</td><td>Biolegend</td><td>430104</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염 용액 (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>분자생물학용, 0.5&nbsp; H2O, DNase, RNase, NICKase 및 프로테아제의 M, 검출되지 않음, 0.2 &mu; M이 필터링되었습니다.</td></tr><tr><td>FACS clean</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACS Flow Sheath Fluid</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACS Rinse Solution</td><td>BD Bioscience</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>멸균 필터, 세포 배양에 적합, 사용 전 열 비활성화</td></tr><tr><td>Gibco, MEM &alpha;, 뉴클레오시드</td><td>써모피셔 Scientific</td><td>22571020</td><td>페놀 레드, 리보뉴클레오시드, 디옥시리보뉴클레오시드, 소듐바이카보네이</td></tr>트 <tr><td>호스 세럼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050122</td><td>멸균 여과, 사용 전 열 비활성화</td></tr><tr><td>Human IL-2 IS, 연구 등급</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-742</td><td>연구 등급. ED50은 &le입니다. 0.3 ng/mL, &ge의 활성에 해당; 3 &번; 106 IU/mg입니다.</td></tr><tr>Streptomyces conglobatus에서 나온 <td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>, 사이토카인 분비에 대한 양성 대조군으로 사용됨&nbsp;</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마-알드리치</td><td>W368401</td><td>세포 배양 MACS</td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&nbsp; 컬럼 및 플런저, 멸균 포장</td></tr><tr><td>NK-92</td><td>DSMZ</td><td>ACC 488</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfektionssystem 100&nbsp; &뮤; L-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>MPK10096 Resuspension Buffer R, 전해 버퍼 E2, 100 &mu; L 네온 팁, 네온 전기천공법 튜브</td></tr><tr><td>Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>는 사이토카인 분비에 대한 양성 대조군으로 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>폴리스티렌 둥근 바닥 튜브,</td><td>유세포 분석에 사용되는</td>5mL <td>BD Bioscience</td><td>S-452400</td></tr><tr><td>반응 튜브, 1.5ML</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7,26,90,001</td><td>PP, 투명, 캡 부착, 주입 눈금 포함. 사용 전에 멸균 처리됩니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>72400021</td><td>GlutaMax I,&nbsp; 페놀 레드, HEPES, 멸균 여과</td></tr><tr><td>TipOne 1000 &mu; L XL 졸업 필터 팁</td><td>StarLab</td><td>S1122-1730</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터 C60&nbsp;</td><td>Labotect</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HydroFLEX 마이크로플레이트 워셔&nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoQuant Infinite M200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS 분리기&nbsp;</td><td>밀테니 바이오텍</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

엔지니어링 키메라 항원 수용체-비바이러스성 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 사용하여 곰팡이 감염을 표적으로 하는 자연 살해 세포

Engineering Chimeric Antigen Receptor-Natural Killer Cells Targeting Fungal Infections Using the Non-viral Sleeping Beauty Transposon System

transfection, recovery, enrichment 및 expansion을 포함한 Af-CAR NK-92 세포를 생성하는 전체 과정은 약 14일이 소요됩니다. transfection 후, 세포는 2일에 한 번씩 배양되고 분할됩니다. transfection 후 2일 후 첫 번째 분열 동안 세포 생존율이 감소할 수 있습니다. 일반적으로 세포는 형질주입 후 4일 후에 회복되고 증식을 시작하며 48시간의 배가 시간이 걸립니다.
회수 후 transfection 효율이 측정되며 10-20%에 이를 것으로 예상됩니다( 그림 3에 표시된 대표적인 결과). MACS를 통한 EGFR 양성 세포의 농축은 Af-CAR NK-92 세포의 비율을 95% 이상으로 증가시킵니다( 그림 4에 표시된 대표적인 결과).
95% 이상의 Af-CAR 세포를 배양한 배양액이 기능 분석에 사용되었습니다. 여기에서 A. fumigatus 생식관과 세포를 6시간 동안 공동 배양하고 활성화 마커로 IFN-ɣ 분비를 측정했습니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 Af-CAR 세포는 Mock NK-92 세포(평균 = 75.6 ±± 19.5 pg/mL)에 비해 유의한 사이토카인 분비(평균 = 340.6 86.5 pg/mL)를 보였으며, 이는 Af-CAR 세포의 활성이 상당히 높았음을 나타냅니다(p-값 = 0.03).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig01.jpg"> 
그림 1: Aspergillus fumigatus의 생식관.배양 16시간 후 A. fumigatus의 현미경 이미지. 생식관/작은 균사가 관찰되고 우물 주변에 균일하게 분포합니다. 스케일 바 = 400μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig02.jpg"> 
그림 2: Aspergillus fumigatus 생식관과 NK-92 세포의 공동 배양. 공동 배양의 현미경 이미지. NK-92 세포는 클러스터를 형성하고 A. fumigatus 생식관과 접촉합니다. 스케일 바 = 400μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig03.jpg"> 
그림 3: 형질 주입 마커 EGFR에 대한 염색을 통해 평가한 형질 주입 효율. 5일째, 전기천공 후 NK-92 세포를 7-AAD 및 항-EGFR로 염색했습니다. 결과는 (A) Mock 및 (B) Af-CAR NK-92 세포에 대한 하나의 대표 실험에 대해 표시됩니다. 왼쪽 열은 셀 크기 대 셀 세분성의 점도를 보여줍니다. 게이트는 NK-92 셀에 설정됩니다. 죽은 세포는 7-AAD 라벨링(두 번째 열)을 사용하여 outgate됩니다. 살아있는 EGFR+ 세포의 비율은 세 번째 열에 표시되어 있습니다. 약어: EGFR = 표피 성장 인자 수용체; 7-AAD = 7-아미노악티노마이신 D; CAR = 키메라 항원 수용체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig04.jpg"> 
그림 4: 전이유전자를 발현하는 NK-92 세포를 농축한 후 세포 표면 염색 결과. 왼쪽에는 모의 셀이 표시됩니다. 오른쪽에는 Af-CAR-NK 셀이 표시됩니다. 빨간색 히스토그램은 염색되지 않은 세포를 나타냅니다. 파란색 히스토그램은 해당 염색된 세포를 나타냅니다. 게이트는 EGFR+ 셀에 설정됩니다. 숫자는 양성 세포의 백분율을 보여줍니다. 약어: EGFR = 표피 성장 인자 수용체; CAR = 키메라 항원 수용체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig05.jpg"> 
그림 5: Aspergillus fumigatus 생식관에 의해 활성화된 NK 세포의 사이토카인 분비. 다이어그램은 공동 배양 6시간 후 ELISA로 측정한 진균과의 공동 배양에서 Af-CAR 및 Mock 세포의 IFN-ɣ 분비 결과를 나타냅니다. 표시된 데이터는 독립적으로 수행된 3개의 실험(n = 3)의 평균 ± SD입니다. GraphPad Prism 10을 사용한 Welch의 t-검정으로 계산한 p-값, * p &lt; 0.05. 약어: NK = 자연살해자; IFN-ɣ = 인터페론 감마; CAR = 키메라 항원 수용체; ELISA = 효소 결합 면역흡착 분석법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>이름</td>
			<td>회사</td>
			<td>재고 집중도</td>
			<td>참조</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트랜스포사제</td>
			<td>SB100X 미니 서클</td>
			<td>플라스미드팩토리</td>
			<td>1 μg/μL</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트랜스포손</td>
			<td>Af-CAR 플라스미드</td>
			<td>자체 제작</td>
			<td>1 μg/μL</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 이 프로토콜에 사용된 DNA.
보충 그림 S1: Af-CAR 트랜스포손의 플라스미드 맵: 플라스미드 벡터의 개략도 및 CAR 트랜스포손의 설계. 약어: EF1 = 연신율-1 알파 프로모터; ORI = 복제의 박테리아 기원; LIR = 왼쪽 반전 반복; RIR: 오른쪽 반전 반복; Cyto = 세포질; Tm = 막횡단. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/figure%20S1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Chimeric antigen receptor (CAR)-based cell therapies have shown impressive efficacy in the treatment of hematological malignancies. Recently, these ...

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Research

연구

JoVE Journal

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이 비디오는 1차 자연살해(NK) 세포의 Cas9 리보핵단백질 매개 유전자 변형 기술을 보여줍니다. CRISPR RNA(crRNA)와 trans-activating crRNA(tracrRNA)를 염기쌍으로 하여 형성된 가이드 RNA(gRNA)에 결합된 Cas9 엔도뉴클레아제로 구성된 Cas9 리보핵단백질은 전기천공법을 통해 1차 자연살해세포에 도입됩니다. 리보핵단백질은 표적 부위에서 숙주 DNA를 표적화하고 절단하여 세포 복구 기계를 통한 표적 유전자의 변형을 통해 유전자 녹아웃을 유도합니다.

CRISPR Cas9을 이용한 자연살해세포의 유전자 편집 기법

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이 연구의 목표는 기본 자연적인 살인자 (NK) 세포에서 성공적인 유전자 변환에 대 한 허용 하는 기술을 공식화 했다. 인간의 lentiviral 변환 dextran 중재 또는 더 높은 유전자 식 효율성에 마우스 기본 NK 세포 결과. 이 방법은 유전자 변환의 NK 세포 유전자 조작을 향상 방대 하 게 됩니다.

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

이 프로토콜 transcriptionally 규제 잠자는 미녀 시스템에 의해 인간 게놈에 관심사의 유전자의 안정적인 통합을 달성 하는 방법을 설명 합니다. 결함이 lentiviral 벡터, 인간의 세포, 생체 외에서 변환 및 불리고 세포에 분자 분석 결과의 통합의 준비 보고 됩니다.

효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

여기, 선물이 유전자 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 기본 또는 확장 된 인간의 자연 킬러 (NK) 세포를 수정 하는 프로토콜. 이 프로토콜을 사용 하 여 인간 NK 세포 성장 인자-b 수용 체 2를 변형 (TGFBR2) 및 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 결핍을 생성 했습니다.

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

여기에서는 말초혈액자연살해(PBNK), 간 조직으로부터 NK세포, 말초혈액단핵세포(PBMC) 또는 제대혈(CB)에서 유래한 키메라 항원 수용체(CAR)-NK세포를 확장시키는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 확장된 NK 세포의 최적화된 순도 외에도 221-mIL-21 영양세포를 사용하는 NK 및 CAR-NK 세포의 확장을 보여줍니다.

멤브레인 결합-IL-21-변형 B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 확장 방법

여기에서는 다양한 악성 종양에 대한 사멸을 개선하여 인간 iPSC 유래 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자연 살해 세포를 분화하고 확장하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 자연살해(NK)에 최적화된 iPSC 유래 CAR-NK 세포의 분화 및 증식과 다양한 종양 세포주에 대한 항종양 활성의 측정을 보여줍니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 키메라 항원 수용체 발현 자연 살해 세포의 발전

이 프로토콜은 암 면역 요법을 위한 비통합 mRNA를 사용하여 일시적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 자세한 절차를 설명하고 CAR-T 세포 및 세포 독성 기능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

암 면역 요법을 위해 mRNA를 사용하여 일시적인 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하는 비바이러스 접근법

CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 homology-mediated end joining (HMEJ) DNA repair pathway를 통해 1차 인간 T 세포에서 큰 multicistronic 구조체의 고효율 표적 knock-in을 달성하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 cGMP 적응 프로토콜로 조작된 T 세포는 우수한 세포 증식, 세포 독성 및 사이토카인 생산을 유지합니다.

대형 DNA 주형의 상동성 매개 말단 결합을 통한 일차 인간 T 세포의 비바이러스 공학

이 프로토콜은 mRNA 전기천공에 의한 일차 T 세포의 분리, 활성화, 증식, 일시적 형질전환 등 원차 T 세포 배양의 필수 단계를 설명합니다. 또한, 표현형, 활성화 마커, 생존 가능성 및 키메라 항원 수용체(CAR) 발현의 유동 세포 분석을 위한 워크플로우 및 항체 패널도 제안됩니다.

1차 인간 T 세포의 분리, 배양 및 일시적 형질인화를 통해 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

배우세요 Sleeping Beauty 트랜스포존 시스템을 사용하여 Aspergillus fumigatus를 표적으로 하는 CAR-NK 세포를 생성하는 방법. 이 비바이러스성 유전자 전달 기술은 침습성 진균 감염 치료를 위한 즉시 사용 가능한 세포 치료제 개발에 활용됩니다.

엔지니어링 키메라 항원 수용체-비바이러스성 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 사용하여 곰팡이 감염을 표적으로 하는 자연 살해 세포

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