Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

마이크로버블은 고유한 암 영상 및 치료 기능을 갖춘 가스로 채워진 초음파에 민감한 입자입니다. 진화하는 유틸리티는 애플리케이션 중심의 추적 가능한 마이크로버블을 구축함으로써 전략적으로 발전할 수 있습니다. 우리는 표지되지 않은 미표지, 방사성 표지, 형광 및 다중 모드 미세기포의 맞춤형 생성을 허용하는 지질 미세기포 제조 프로토콜을 개발하여 이 목표를 촉진하는 것을 목표로 합니다.

효율적이고 안정적인 마이크로버블 무선 라벨링을 달성하는 것은 사소한 과제가 아닙니다. 지질 미세 기포는 깨지기 쉬우므로 제조 후 방사선 표지 접근법에서 열, 시간 및 정제 단계를 거치면 물리적 화학적 특성과 안정성이 교란될 수 있습니다. 반면, 조립식 무선 라벨링에는 특수 장비와 증가된 방사선 노출이 필요합니다.

우리는 방사성 동위원소 킬레이션이 마이크로버블 활성화 전이지만 지질 현탁액 형성 후에 발생하는 새로운 하이브리드 프로토콜을 개발하여 이러한 문제를 극복합니다. 이 원팟 접근 방식은 처음으로 입자 물리적 화학적 특성을 보존하는 고효율, 정제가 필요 없는 마이크로버블 무선 라벨링을 용이하게 합니다. 주요 추가 이점은 프로토콜의 다양성입니다. 이는 맞춤형 마이크로버블 제조 중에 통합될 수 있으며 상업적으로 이용 가능한 것과 같이 미리 형성된 마이크로버블 지질 현탁액에 적용할 수 있습니다. 다양한 미세기포 지질 및 킬레이트제 조성물에 성공적으로 적용될 수 있으며 그에 따라 맞춤형 방사성, 형광 또는 삼모드 미세기포를 생성할 수 있습니다.

이러한 특성을 함께 사용하면 기계론적 통찰력을 발전시키고 마이크로버블 약동학 연구, 다중 모드 이미징, 치료 계획 및 시너지 요법 활성화를 포함한 여러 영역에서 마이크로버블 중심 초음파 요법의 발전을 지원할 수 있는 마이크로버블 지질 껍질의 다중 모드 대표 추적이 가능합니다.

[해설자] 마이크로 피펫 사용을 시작하려면 기포 형성을 피하면서 바이알에 선택한 미세 기포 지질 필름의 가장자리를 따라 AA-PGG 용액 1밀리리터를 추가합니다. 바이알 입구를 캡으로 부분적으로 덮고 퍼플루오로펜탄 또는 PFP 라인을 삽입할 수 있는 충분한 공간을 남겨 둡니다. PFP를 액체 위의 20초 동안 바이알의 헤드스페이스로 흐르고 바이알의 뚜껑을 닫습니다. 바이알의 아래쪽 절반을 섭씨 70도에서 80도의 수조에 1분 동안 담그십시오. 그런 다음 섭씨 30도 목욕 초음파 발생기에서 69초 동안 바이알을 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 바이알을 닦고 실온으로 식히십시오. 바이알의 헤드스페이스를 PFP 가스로 다시 채웁니다. 그런 다음 바이알의 뚜껑을 덮고 파라필름으로 가장자리를 밀봉합니다. 결정화 접시에 섭씨 60도의 수조를 설치하려면 접시에 자석 교반 막대를 놓고 온도 조절이 가능한 뜨거운 교반판에 놓습니다. 열 프로브를 물에 삽입하여 온도를 모니터링하고 교반 속도를 조정하여 약하지만 눈에 보이는 깔때기를 만듭니다. 집게를 사용하여 0.1 일반 염산에 염화구리 형태의 구리 64가 들어 있는 밀봉된 바이알을 용량 교정기로 옮깁니다. 구리 64 활동과 시간을 기록합니다. 집게를 사용하여 용량 교정기에서 바이알을 제거하고 납이 함유된 용기에 넣습니다. 밀리리터당 메가베크렐 단위의 값을 계산하려면 용량 교정기에 표시된 활성을 구리 64의 부피로 나눕니다. 지질 현탁액의 뚜껑을 열고 바이알 홀더에 고정합니다. 그런 다음 구리 64 바이알의 뚜껑을 열고 집게로 바이알을 다룹니다. 마이크로피펫을 사용하여 40 내지 250 메가베크렐의 활성에 해당하는 부피의 구리 64 용액을 지질 현탁액으로 옮깁니다. 납작한 고무 끝이 있는 집게를 사용하여 방사성 지질 현탁액을 위아래로 최소 5회 회전시켜 구리(64)를 현탁액에 혼합합니다. 바이알이 오른쪽이 위로 향하는 상태에서 바이알을 안정시키면서 캡을 부드럽게 튕깁니다. 조심스럽게 바이알의 뚜껑을 부분적으로 열고 바늘이 장착된 PFP 라인을 삽입합니다. 바이알 헤드스페이스를 PFP로 20초 동안 채웁니다. 그런 다음 바이알을 캡을 닫고 파라필름으로 밀봉합니다. 용량 교정기를 사용하여 바이알 활성을 측정하고 시간을 기록합니다. 그런 다음 바이알의 아래쪽 절반이 열에 노출되도록 바이알을 폼 바이알 홀더에 넣습니다. 홀더를 섭씨 60도의 교반 수조에 담그고 1시간 동안 가열합니다. 한편, iTLC 스트립을 준비하려면 유리 극세사 크로마토그래피 종이를 스트립으로 자릅니다. 스트립을 섭씨 80도의 유리 건조 오븐에서 가열하여 활성화합니다. 1시간 후 수조에서 바이알을 꺼내 티슈 페이퍼로 가장자리를 닦습니다. 고무 끝이 있는 집게를 사용하여 바이알을 위아래로 돌립니다. 바이알이 똑바로 세워진 상태에서 바이알을 안정시키면서 캡을 튕깁니다. 파라필름을 제거하고 캡 주위를 닦아 갇힌 물을 제거합니다. 활성화된 iTLC 스트립의 하단 중앙에서 1cm에서 1-2마이크로리터의 지질 현탁액을 찾습니다. 그 부분을 말리십시오. 마이크로피펫을 사용하여 200마이크로리터의 iTLC 용리액을 10밀리리터 시험관 바닥에 추가합니다. 납 용기에 튜브를 보관합니다. 얼룩덜룩한 iTLC 스트립을 튜브에 추가하고 용리액이 스트립 상단에서 약 1cm에 도달할 때까지 현상시킵니다. 그런 다음 집게를 사용하여 개발된 스트립을 제거하고 수직으로 잡습니다. 감마 카운터 호환 5밀리리터 플라스틱 튜브 위에 스트립을 3등분으로 자릅니다. 푸시 캡을 튜브에 삽입합니다. 감마 카운터를 사용하여 튜브가 포함된 스트립과 빈 제어 튜브를 측정하여 구리 64 활성을 감지합니다. 분당 카운트를 기록하고 다른 판독값에서 제어 튜브 활동을 빼서 배경 방사선을 수정합니다. 그런 다음 분당 수정된 카운트를 기반으로 방사성 화학 순도를 계산합니다. 다음으로, 라디오 표지 지질 현탁액 바이알의 뚜껑을 열고 8.89마이크로리터의 정상 수산화나트륨 1개를 현탁액에 첨가합니다. 바이알을 캡핑하고 회전시킨 후 바이알을 가볍게 두드려 캡 공간에 갇힌 현탁액을 제거하고 헤드 공간을 PFP 가스로 채웁니다. 바이알을 기계식 셰이커에 놓고 4,530RPM에서 45초 동안 활성화하여 유백색 미세 기포 현탁액을 생성합니다. 실온으로 수동 냉각되면 바이알을 부드럽게 뒤집어 마이크로버블 현탁액을 재현탁합니다. 바이알을 평평한 표면에 놓고 2분 동안 기다립니다. 한편, 1밀리리터 플라스틱 주사기에 18게이지 바늘을 장착하고 공기를 흡입하고 안팎으로 흡입하여 주사기를 배출합니다. 2분 후 바이알의 뚜껑을 빠르게 열고 바이알 바닥에서 400-550마이크로리터의 현탁액을 끌어옵니다. 바늘의 가장자리를 조심스럽게 닦고 미세 기포 현탁액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브에 캡을 씌운 후 용량 교정기에서 최종 미세 기포 생성물의 활성을 측정하고 시간을 기록해 둡니다. 활성도 값을 디캔팅된 부피로 나누어 밀리리터당 메가베크렐 단위의 활성을 구합니다. 시작하려면 10-200마이크로리터의 마이크로버블 현탁액을 호환되는 마이크로 원심분리기 튜브의 0.5밀리리터, 30,000분자량 차단 원심분리기 필터 장치에 추가합니다. 현탁액을 실온에서 10분 동안 12,000G에서 원심분리합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브와 캡 사이의 연결을 자릅니다. 캡을 CAPS로 표시된 20밀리리터 섬광 바이알에 넣습니다. 필터 장치를 TUBE 2로 표시된 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. Infranatant가 포함된 첫 번째 마이크로 원심분리기 튜브를 TUBE 1로 표시된 20밀리리터 섬광 바이알에 넣습니다. TUBE 2의 필터 장치에 200마이크로리터의 이중 증류수를 추가합니다. 필터 장치를 12,000G에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 마지막 필터 장치 이송 후 200마이크로리터의 증류수를 TUBE 3의 필터 장치에 추가하고 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브의 캡을 절단하여 캡 섬광 바이알에 추가하고 필터 장치를 UNIT라고 표시된 새 20밀리리터 섬광 바이알로 옮깁니다. TUBE 3을 새 20밀리리터 유리 섬광 바이알에 넣습니다. 5개의 섬광 바이알을 캡핑하고 빈 대조군으로 빈 캡이 있는 섬광 바이알 1개를 준비합니다. 감마 카운터에서 6개의 섬광 바이알을 측정하여 구리 64 활성을 감지합니다. 다른 바이알 측정값에서 블랭크 컨트롤을 뺍니다. 라디오 라벨링 또는 킬레이트화 효율을 계산합니다.