Name: Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 배우세요 지질 마이크로버블 제조 및 방사성 동위원소 라벨링 방법을 통해 95% 이상의 라벨링 효율을 달성하는 기술입니다. 이 프로토콜은 물리화학적 특성을 유지하며 다양한 제형에 적용 가능합니다.

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마이크로버블은 단백질, 폴리머 또는 대부분의 경우 지질 껍질에 의해 안정화된 가스 코어를 가진 미크론 크기의 초분자 테라노스틱 제제입니다(그림 1A). 혈류량으로 주입될 때, microbubbles는 그들의 가스 중핵 1,2의 해체 이전에 분 긴 timeframe 동안 초음파에 의해 검출될 수 있는 가스/액체 공용영역을 유지합니다. 결과적으로, 마이크로버블의 첫 번째 임상적 사용은 실시간 초음파 영상 조영제였다3. 치료용 집속 초음파(FUS)의 발명으로 마이크로 버블 임상 유틸리티가 확장되었습니다. 저주파 FUS에 의해 자극될 때, microbubbles는 진동하고 일시적인 관 투과성에서 국소 조직 절제 4,5에 배열하는 표적으로 한, 조정 가능한 기계적인 힘을 생성한다. 그 결과, 지난 20년 동안 마이크로버블-FUS는 혈액뇌장벽(BBB) 개방, 종양(예: 췌장암, 뇌암, 간 전이성 암) 약물 및 이미징 프로브 전달, 신경퇴행성 질환 치료 및 암 절제 6,7,8,9,10,11에 대해 탐구되었습니다.
마이크로버블의 테라노스틱 무기고는 새롭고 흥미로운 방향으로 계속 발전하고 있습니다. 기존의 microbubble-FUS 전달 응용 분야는 상업용 microbubbles와 함께 치료 또는 이미징 화물의 공동 투여에 의존합니다. 마이크로버블 쉘/생물학적 상호 작용을 이해하고, 맞춤형 비상업적 마이크로버블 제형을 탐색하고, 마이크로버블 쉘에 직접 적재된 화물로 올인원 테라노스틱 마이크로버블을 생성함으로써 마이크로버블-FUS 전달 능력을 향상시키는 데 관심이 높아지고 있습니다 12,13,14. 실제로, 지질 microbubble 약 납품 학문의 대략 40%는 그런 포탄 적재된 microbubbles15를 이용한다. 이미징 및 약물 전달 외에도 microbubble-FUS는 암 방사선 요법을 강화하고(16), 초음파 역학 요법을 통해 양성 쉘 적재 제제의 항종양 효과를 활성화하는 데 유망한 것으로 나타났습니다17,18.
microbubble 암 신청에 있는 이 전통적인 그리고 확장된 방향은 microbubble 포탄에 방사성 tracer를 표기해서 전략적으로 전진될 수 있습니다. 올인원(all-in-one) 화물 적재 마이크로버블의 영역에서, 이러한 방사선 라벨링은 1) 이러한 적재된 마이크로버블 쉘의 온/오프 타겟 생체분포의 골드 스탠다드, 정량적 평가를 촉진하고, 2) 온-타겟 전달을 극대화하기 위해 마이크로버블 구성의 최적 선택을 알리는 약동학 구조-활성 관계를 도출하고, 3) 전략적이고 적절한 이미지 유도 적용 및 치료 계획(예: 조직 표적 유형, 선량 측정, off-target 안전 문제를 완화하기 위한 약물 선택, 기존 공동 치료 패러다임과 비교한 유용성) all-in-one 화물 적재 시스템15,19. 전임상 단계에서 마이크로버블 쉘 운명에 대한 이러한 이해는 더 광범위한 마이크로버블-FUS 작용 메커니즘을 조명할 수도 있습니다. 예를 들어, 마이크로버블 쉘에서 표적 세포로의 지질 전달은 FUS 기반 초음파전달 12,20에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 따라서 이러한 전달을 이해하고 최적화하면 초음파 처리와 관련된 전임상 및 임상 마이크로버블-FUS 요법(체외 형질주입, 약물 전달, 종양 절제, 방사선 감작 및 초음파 역학 요법 20,21,22,23,24,25). 이중 초음파 및 방사선 이미징 시설은 또한 기존의 이중 제제 설계가 아닌 단일 제제에서 FUS 혈관 개방 및 치료 모니터링(예: BBB 개방 역학)을 가능하게 합니다26. 같은 맥락에서, 지질 마이크로버블 방사성 표지는 마이크로버블-FUS + 방사성의약품 공동 전달 플랫폼에 대한 올인원 단일 제제 마이크로버블-FUS/방사선 요법 대안으로 작용할 수 있습니다27.
마이크로 버블의 취약성은 그러한 라벨링에 대한 사소한 도전입니다. 기존의 모든 방사성 표지 전략은 마이크로 버블의 안정성과 크기를 교란시키는 것으로 알려진 정제 방법론에 의해 제한되며, 일부는 비효율적이고 불안정한 방사성 표지 28,29,30,31,32를 특징으로 합니다. 정제 요구 사항으로 인해 프로토콜이 더 길어집니다. 수명이 짧은 방사성 동위원소(예: 18F t1/2 1.8 h,28,29 99mTc t1/2 6 h,3268Ga t1/2 1 h31)의 사용과 결합하면 방사성 동위원소 붕괴와 관련된 비효율성이 발생하고 방사선 이미징 및 치료 계획 기간이 제한됩니다. 총체적으로 이러한 한계는 짧고 대표성이 없는 방사선 이미징, 부정확한 약동학 데이터, 비효율적인 종양 방사성 동위원소 전달의 위험을 초래합니다.  
이 보고서에서는 포르피린의 강력하고 안정적인 금속 킬레이트 기능을 활용하여 이러한 한계를 극복합니다. 포르피린은 다양한 금속을 수용할 수 있는 고도로 공액된 평면 고리와 중앙 배위 부위를 가진 유기 헤테로사이클릭 거대분자입니다. 여기에는 구리-64(t1/2 12.7 h)와 같은 수명이 긴 방사성 동위원소, 양전자 방출 단층촬영(PET)을 이용한 방사성 의약품 및 γ 계수 타당성33이 포함된다. 지질 골격에 접합될 때, 포르피린은 초분자 구조에 쉽게 통합될 수 있으며 이후에 부모의 표지되지 않은 입자33,34의 특성을 유지하면서 속도, 높은 킬레이트화 효율 및 혈청 안정성으로 구리-64로 표지될 수 있습니다. 또한, 포르피린은 입자 파괴 시 복원되는 나노 및 미세 입자의 모듈식 자체 담금질로 형광 활성입니다. PET 및 γ 계수에 대한 보완적인 판독으로 벌크 및 현미경 껍질 운명 분석을 모두 용이하게 합니다(그림 1A)15.
포르피린-지질을 킬레이트로 사용함으로써 이러한 특성을 활용하여 기존 마이크로버블 방사성 표지 방법과 관련된 한계를 극복하는 새로운 단일 냄비, 정제가 필요 없는 마이크로버블 방사성 표지 방법(그림 1B, C)을 생성했습니다. 이 프로토콜은 &gt;95%의 구리-64 킬레이트화 효율을 달성하고, 라벨링 후 정제가 필요하지 않으며, 미세버블 물리화학적 특성을 보존합니다. 그것은 그들의 활성화 (숫자 1B) 전에 지질 microbubbles의 "지상 위로" 제작으로 쉽게 통합될 수 있습니다. 그것은 다재다능하 아실 지질 사슬 길이 (C16에 C22), 책임 (중립성과 음이온성), 및 라디오 둘 다 형광 활동을 가진 microbubbles를 생성하는 porphyrin 지질 구성 (1 mol%, 10 mol%, 30 mol%)를 가진 관례와 상업적인 microbubble 정립의 맞은편에 성공적으로 적용될 수 있습니다. 그 적응력은 포르피린을 넘어서기도 합니다. 원-팟 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 대체 킬레이터(예: 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트(DTPA)-지질) 및 형광단(예: DiI)을 사용하도록 수정할 수 있습니다. 또한 "스파이킹" 접근 방식을 통해 미리 만들어진 microbubble 제형에 라벨을 붙이도록 수정할 수 있습니다. 그러므로, 이 방법은 기계론의, 화상 진찰 및 치료 microbubble-FUS 신청 전진을 위해 유용한 맞춤형, traceable (라디오, 형광성, 또는 이중 방사선/형광성 활동적인) microbubbles의 생산을 가능하게 합니다. 아래 프로토콜은 지질 마이크로버블의 제조, 원팟 방사성 표지 프로토콜의 적용, 필요한 방사성 표지 및 물리화학적 특성 특성화, 잠재적 변형에 대해 설명합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67431/67431fig01v4.jpg"> 
그림 1: 마이크로버블 제조 및 방사성 표지 프로토콜. (A) pyropheophorbide-a-lipid 형태의 포르피린 지질은 이 프로토콜 내에서 다중 모드 킬레이터 역할을 합니다. 구리-64(i)에 킬레이트화된 단량체로서 PET 및 이미징 기능이 있습니다. 그것의 형광은 입자 형태 (마이크로 버블 (ii) 및 용해 후 나노 자손 (iii))으로 담금질되고 입자 파괴 (iv)로 담금질됩니다. (B) 이 보고서에 설명된 지질막 수화/활성화 프로토콜은 처음부터 지질 마이크로버블을 생성하고 (C) 지질 현탁액 형성과 마이크로버블 활성화 사이의 원팟 방사성 표지의 통합. 이 그림은 Rajora et al.15의 허가를 받아 각색되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67431/67431fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>64CuCl2</td><td>Washington University School of Medicine, Mallinckrodt Institute of Radiology N</td><td>/A</td><td>소량(< 10 & 마이크로; L) 0.1N HCl</td></tr><tr><td>아세트산&nbsp</td>에 용해;<td>모든 회사</td><td></td><td>&ge95% 순도</td></tr><tr><td>알루미늄 호일 모든</td><td>회사</td><td></td><td></td></tr> 암<tr><td>모늄 아세테이트</td> 모든 <td>회사</td><td></td> 순<td>도: &ge; 98%</td></tr><tr><td>균형 - 분석</td><td>모든 회사</td><td></td><td>0.1mg까지 측정 가능</td></tr><tr><td>목욕 초음파 발생기</td><td>모든 회사</td><td></td><td>69 oC</td></tr><tr><td>CC 조리개 - 30 미크론까지 가열 가능</td><td>Beckman Coulter</td><td>A36391</td><td>입자 직경 범위: 0.6-18 um</td></tr><tr><td>CC 전해질</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td>Isoton II 희석제</td></tr><tr><td>CC 소프트웨어</td><td>Beckman Coulter</td><td>Multisizer 4e</td><td></td></tr><tr><td>호환 가능한 미세 원심분리기 튜브가 있는 원심분리기 필터 장치(0.5 mL 30,000 MWCO)</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC503096</td><td>Amicon Ultra - 0.5 mL</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 - 15 mL 캡 포함</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>모든 회사</td><td></td> 순<td>도: &ge99.8%&nbsp;</td></tr><tr><td>Coulter 카운터</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43905</td><td>Multisizer 4e Coulter 카운터</td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td>VWR 마이크로 커버 유리</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td>모든 회사</td><td></td> 산화<td>되지 않았는지 확인</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>큐벳 쿼트, 1cm 경로 길이</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td></tr> 큐<tr><td>벳 - CC 측정용 10mL 플라스틱</td><td>Beckman Coulter</td><td>A35471</td><td>Coulter Counter Accuvette ST</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>모든 회사는</td><td></td><td>초순수 정화 시스템</td></tr><tr><td>DiI(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>를 <td></td>통해 얻을 수 있습니다. 모든 <td>회사</td><td></td> 분말 형태</tr><tr><td>선량 교정기</td><td>모든 회사</td><td></td> 구<td>리-64</td></tr><tr><td>를 읽을 수 있습니다.DPPA(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-인산염(나트륨염))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>830855P</td><td>분말 형태</td></tr><tr><td>DPPC(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355P</td><td>분말 형태</td></tr><tr><td>DPPE-MPEG(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-5000](암모늄염))Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>880200P</td><td>분말 형태</td></tr><tr><td>DTPA-지질(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-디에틸렌트리아민펜타아세트산(암모늄염))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790106P</td><td>분말 형태</td></tr><tr><td>EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)모든</td> <td>회사</td><td></td><td></td>감</tr><tr><td>마 카운터</td><td>모든 회사</td><td></td> 구리-64 감마 계수 튜브 푸시 캡<td>을 읽을 수 있음</td></tr><tr><td></td><td>Globe Scientific</td><td>22-171-665</td><td>플랜지 12mm 튜브용 플러그 캡</td></tr><tr><td>감마 계수 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>55.1579</td><td>5 mL, 75 x 12 mm, PS</td></tr><tr><td>유리 비커 - 250 mL</td><td>모든 회사</td><td></td> 최대 <td>100 oC의 온도를 견딜 수 있음</td></tr><tr><td>유리 건조 오븐</td><td>모든 회사</td><td></td><td>80 oC까지 가열 가능</td></tr><tr><td>유리 마이크로리터 주사기 - 25, 50, 100, 1000 & 마이크로; L</td><td>모든 회사</td><td></td><td>유기 용매와 호환 가능</td></tr><tr><td>유리 섬광 바이알 - 20 mL</td><td>VWR</td><td>66022-081</td><td>VWR&reg; 신틸레이션 바이알, 붕규산 유리, 스크류 캡 포함, 펄프 호일 라이너 포함</td></tr><tr><td>유리 바이알 - 0.5 드람</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>VWR 바이알 1/2 드램, 검은색 페놀 스크류 캡 및 폴리비닐 표면 펄프 라이너 포함</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>G7757-1L</td><td>순도:&nbsp; &ge; 99.0%&nbsp;</td></tr><tr><td>눈금이 매겨진 피펫/건</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>핫/교반 플레이트</td><td></td><td></td><td>자동 온도 제어를 위한 온도 프로브 장착</td></tr> 염<tr><td>산 - 0.1 N</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTLC 플레이트</td><td>애질런트</td><td>A120B12</td><td>&nbsp; iTLC-SA 크로마토그래피 용지</td></tr><tr><td>실험실 조직</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td>미디어</tr><tr><td>진공 여과 장치</td><td>모든 회사</td><td></td><td>0.22 미크론 기공 크기, PES 멤브레인, 500mL 깔때기 용량</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>모든 회사</td><td></td><td>순도: &nbsp; &ge; 99.8%, HPLC 등급, ACS 사양 충족</td></tr><tr><td>미세 원심분리기 튜브 비멸균 - 1.5mL</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 미세 원심분리기 튜브 - 1.5 mL</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td>마이크로</tr><tr><td>피펫 - p1000, p200, p20, p10</td><td>모든 회사</td><td></td> 보<td>정된</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Superfrost Plus 현미경 슬라이드 사전 세척</td></tr><tr><td>바늘 - 18 G</td><td></td><td></td><td>멸균</td></tr><tr><td>파라필름</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>DPBS, 변형, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>PFP</td><td>FluoroMed</td><td>APF-N40HP</td><td>순도:&nbsp; &ge; 99.8%</td></tr><tr><td>PFP 라인</td><td>모든 회사</td><td></td> 직경 <td>1/4인치 플라스틱 호스 절단 길이 약 50cm</td></tr><tr><td>PFP 레귤레이터 스</td><td>웨즈</td>락 <td>SS-1RF4 및 SS-4HC-1-4</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 표준 4 및 7</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p1000, p200, p10용 피펫 팁 - 비멸균</td> 모든 <td>회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p1000, p200, p10용 피펫 팁 - 멸균 모든</td><td>회사</td><td></td><td></td>플라스틱</tr><tr><td>주사기 - 1mL</td><td>모든 회사</td><td></td><td>멸균</td></tr><tr><td>프로필렌 글리콜</td><td>BioShop</td><td>PRO888.500</td><td>순도 : &nbsp; > 99.5 %</td></tr> <tr><td>파이로 지질</td><td>N / A</td><td></td><td>사내에서 제작</td></tr><tr><td>고무 팁 겸자</td><td>모든 회사</td><td></td> 가는 <td>끝과 평평 / 사각형 가장자리의 혼합 권장</td></tr><tr><td>가위 모든</td><td>회사</td><td></td><td></td>수</tr><tr><td>산화 나트륨 - 1 N</td><td>모든 회사</td> 수산화 나트륨 - 10 N 모든 회사 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광형광계</td><td>모든 회사</td><td></td><td>410nm 여기 및 600-850nm 방출 가능</td></tr><tr><td>분광형광계 소프트웨어</td><td>Horiba</td><td>FluorEssence</td><td></td></tr><tr><td>분광계</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td>주</tr><tr><td>사기 - 1mL</td><td>모든 회사</td><td></td> 일<td>회용, 플라스틱, 멸균</td></tr> 주<tr><td>사기 필터 - 0.2미크론 기공 크기</td><td>모든 회사</td><td></td><td>멤브레인 재질: PES 또는 암모늄 아세테이트/아세트산 및 PBS와 호환되는 기타 시험</td></tr><tr><td>관 - 10mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 건조기/진공</td><td>모든 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td>515030-0508</td><td>프로토콜에서 기계식 바이알 셰이커라고 함</td></tr><tr><td>무게 종이</td><td>모든 회사</td><td></td><td>제품 손실을 방지하려면 계량지를 3x3cm 정사각형으로 자르는 것이 좋습니다</td></tr></tbody></table>

fabricating and labeling microbubbles with fluorescent and radioactive tracers

Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

방사성 표지된 마이크로버블을 제조할 때 정량화할 수 있는 주요 결과는 방사성 화학적 순도와 방사성 표지 효율입니다. 이 프로토콜은 각각 iTLC와 검증된 원심 절차를 사용하여 각각을 특성화합니다. 그림 2A 는 총 지질의 1 mol%, 10 mol% 또는 30 mol%의 조성에서 숙주 지질이 pyro-lipid를 치환한 상용 마이크로버블 모방 제형에서 평균 방사화학적 순도와 ≥95%의 효율이 달성되었음을 보여줍니다. 1 mol% 및 10 mol% 파이로 지질 제형은 이러한 값을 달성하기 위해 더 농축된 지질 현탁액(0.15 mL 대 1 mL)이 필요했습니다. 현재 프로토콜에서 달성된 높은 방사성 화학 순도와 킬레이트 효율은 사후 라벨링 정제의 필요성을 상쇄했습니다.
이는 전체 중성 또는 음이온 표면 전하를 가진 C16, C18 및 C22 사슬 길이 지질로 구성된 대체 제형의 경우에도 마찬가지였습니다(<strong class="...

Microbubbles are lipid-shelled, gas-filled particles that have evolved from vascular ultrasound contrast agents into revolutionary cancer therapy ...

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