Name: 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 키메라 항원 수용체 발현 자연 살해 세포의 발전 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 학습하세요 iPSC 유래 CAR NK 세포 분화 및 확장 프로토콜을 통해 항종양 활성을 향상시키는 방법을. 비바이러스 유전자 통합과 CRISPR-Cas9 기술을 활용하여 안전하고 확장 가능한 암 면역치료 세포를 생산합니다.

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<table><tbody><tr><td>aAPC&nbsp;</td><td>딘 A. 리 연구실&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>a-MEM 배양 배지&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>Cat#12634</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-DYKDDDDK (FLAG 태그)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>고양이#637308</td><td></td></tr><tr><td>APC-안티-휴먼 TRA-1-81&nbsp;</td><td>써모피셔</td><td>17-8883-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD16</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#302015</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD43&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 560198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD45&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-GPC3</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#DB100B</td><td></td></tr><tr><td>APC-NKG2D&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이# 558071&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 녹색 검출 시약&nbsp;</td><td>써모 피셔&nbsp;</td><td>Cat#C10423</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace 바이올렛 세포 증식 키트&nbsp;</td><td>써모 피셔&nbsp;</td><td>Cat#C34571</td><td>세포 추적 형광 염료&nbsp;</td></tr><tr><td>CryoStor 솔루션&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html</td><td>동결 보존 매체</td></tr><tr><td>CTS NK Xpander</td><td>Gibco</td><td>A5019001</td><td></td></tr><tr><td>CTS NK-Xpander Medium</td><td>Life Technologies</td><td>Cat#A5019001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루브산</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human NK 세포 농축 키트&nbsp;</td><td>스템셀 테크놀로지스&nbsp;</td><td>Cat#19055</td><td></td></tr><tr><td>에탄올아민</td><td>시그마 알드리치</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>고양이# 10437010</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CD94&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#555888</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#555029</td><td></td></tr><tr><td>골기스탑&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>Cat#554724</td><td></td></tr><tr><td>Ham의 F-12 영양 믹스, GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>말 세럼&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>고양이#16050130</td><td></td></tr><tr><td>인간 세럼&nbsp;</td><td>AB Sigma-Aldrich</td><td>Cat#BP2525100</td><td></td></tr><tr><td>인간 줄기 세포 NucleofectorTM 키트&nbsp;</td><td>론자&nbsp;</td><td>Cat# VPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>인간: HePG2 세포&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>Cat#HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>인간: HePG2-td-토마토-luc 세포&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman 연구실</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>인간: iPS 세포&nbsp;</td><td>댄 S. 카우프만 연구실&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>인간: SNU-449 세포&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat#CRL-2234</td><td></td></tr><tr><td>Human: SNU-449-td-tomato-luc 세포&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman 연구실</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay&nbsp;</td><td>에센바이오사이언스&nbsp;</td><td>Cat#4440</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>MP Biomedicals&nbsp; 인간 혈청, AB형</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>ICN2938249</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress 소프트웨어&nbsp;</td><td>ACEA 바이오사이언스&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805</tr><tr><td>PE/Cy7 anti-human SSEA-4 항체&nbsp;</td><td>바이오레전</td>드 <td>330420</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD16&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#560995&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD226</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#559789</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD34&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>Cat# 555822&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD45&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이# 555483&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD94&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#555888&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-cy7-CD56&nbsp;</td><td>바이오레전드</td><td>고양이# 318318&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-FAS 리간드&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#564261&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp30</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 558407</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp44&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#558563&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#331908</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#557991&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>말초 블러드 버피 코트&nbsp;</td><td>샌디에이고 혈액 은행 (https://www. sandiegobloodbank.org/)&nbsp;</td><td></td><td>해당 없음</td></tr><tr><td>PE-TRAIL&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>고양이#565499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO&nbsp;</td><td>브랜든 모리어리티 랩&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pMAX-GFP 플라스미드</td><td>Lonza</td><td>N/A</td><td>GFP 양성 대조군&nbsp;</td></tr><tr><td>프리즘 9</td><td>그래프패드&nbsp;</td><td>버전 9</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>PX165</td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 버퍼 (10x)</td><td>Biolegend</td><td>Cat#420301</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 bFGF basic&nbsp;</td><td>R& D 시스템&nbsp;</td><td>Cat#4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 BMP-4&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#120-05</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FLT-3 리간드&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-19</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-15&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-15</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-02</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-3&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#200-03</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-7&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-07</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 결절 단백질</td><td>R& D 시스템&nbsp;</td><td>Cat#3218-ND-025</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 SCF&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-07</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TGF-&베타; 1</td><td>PeproTech</td><td>Cat#100-21</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 VEGF&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 100-20</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>소듐 셀렌나이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medium</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>5270</td><td>EB 형성 매체</td></tr><tr><td>STEMdiff APEL2 매체&nbsp;</td><td>스템셀 테크놀로지스&nbsp;</td><td>Cat#05270</td><td></td></tr><tr><td>Super piggyBac Transposase 발현 벡터</td><td>SBI</td><td>Cat#PB210PA-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX AADvanced Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S10274, S10349</td><td>Dead cell staining solution kit</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 키메라 항원 수용체 발현 자연 살해 세포의 발전

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

anti-GPC3-CAR iPSC 유래 NK 세포 분화 및 증식의 개략도 개략도는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래한 anti-GPC3-CAR 엔지니어링 NK 세포의 체외 분화와 GPC3 CAR 구조를 운반하는 piggyBac 벡터의 개략도를 보여줍니다. 초기에는 변형되지 않은 iPSC가 GPC3 CAR(키메라 항원 수용체)을 인코딩하는 piggyBac 벡터로 transfection됩니다. transfection 후 이러한 GPC3 CAR 발현 iPSC는 클론으로 증식된 다음 기능적 CAR iPSC 유래 NK 세포로 분화됩니다. 이러한 조작된 NK 세포는 이후 시험관 내 및 생체 내 기능 분석을 통해 다양한 종양 세포주에 대한 항종양 활성을 평가합니다(그림 1).
다양한 단계에서 WT 및 anti-GPC3-CAR 엔지...

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of ...

advances-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-chimeric-antigen

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 사용하여 대량 T 세포 인구에서 인간의 NKT 세포를 활성화하고 확장하는 방법을 설명합니다. CD1d 기반 aAPC의 사용은 기능 NKT 세포의 높은 숫자를 생성하기위한 표준화 된 방법을 제공한다.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

이 비디오는 종양 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 생체 외 생성 기술을 보여줍니다. 형질전환 RNA를 운반하는 레트로바이러스 벡터는 인터루킨-2가 보충된 배지에서 비장 세포와 혼합되어 T 세포의 생존과 증식을 촉진합니다. 그런 다음 혼합물을 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅된 플레이트로 옮기고 원심분리하여 바이러스와 세포의 융합을 촉진함으로써 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 종양 항원을 표적으로 하는 표면 결합 CAR을 생산할 수 있도록 합니다.

종양 특이적 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하기 위한 생체 외 기술

간단하고 신뢰할 수있는 방법은 상이한 NK 세포의 서브 세트 내의 탈과립, 사이토 카인 및 케모카인 생산 등의 NK 세포의 기능 세트를 분석하기 위해 여기에 설명된다.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

여기, 생체 외에서 공동 문화 메서드를 재귀적으로 도전 종양 표적으로 T 세포, antitumor T 세포 활동의 phenotypic 및 기능 분석에 대 한 수 있습니다 설명 합니다.

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

여기서, 우리는 CAR-T 세포를 수정하기 위하여 CRISPR Cas 기술을 사용하여 1 차적인 인간 T 세포에 있는 유전자 편집을 위한 프로토콜을 제시합니다.

인간 CRISPR-엔지니어링 CAR-T 셀 생산

여기에서는 말초혈액자연살해(PBNK), 간 조직으로부터 NK세포, 말초혈액단핵세포(PBMC) 또는 제대혈(CB)에서 유래한 키메라 항원 수용체(CAR)-NK세포를 확장시키는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 확장된 NK 세포의 최적화된 순도 외에도 221-mIL-21 영양세포를 사용하는 NK 및 CAR-NK 세포의 확장을 보여줍니다.

멤브레인 결합-IL-21-변형 B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 확장 방법

본 프로토콜은 3D 및 2D 배양 조건 모두에서 인간 확장 전위 줄기 세포 (hEPSC)로부터 경미한 세포 독성을 갖는 CD3- / CD45 + CD56 + 세포를 구별하는 방법을 보여줍니다. 이를 통해 복잡한 미세 환경을 파괴하지 않고 일상적인 표현형 검증이 가능합니다.

인간 확장 잠재적 줄기 세포로부터 자연 살해 세포 생성

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

우리는 비바이러스성 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 사용하여 진균 병원체를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체-자연 살해자(CAR-NK) 세포를 생산하기 위한 transfection 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 항원 특이적 활성화를 평가하기 위해 공학적 세포를 Aspergillus fumigatus 생식관과 공동 배양하고 IFN-γ 분비를 측정했습니다.

엔지니어링 키메라 항원 수용체-비바이러스성 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 사용하여 곰팡이 감염을 표적으로 하는 자연 살해 세포

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

학습하세요 iPSC 유래 CAR NK 세포 분화 및 확장 프로토콜을 통해 항종양 활성을 향상시키는 방법을. 비바이러스 유전자 통합과 CRISPR-Cas9 기술을 활용하여 안전하고 확장 가능한 암 면역치료 세포를 생산합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 키메라 항원 수용체 발현 자연 살해 세포의 발전

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