소용량 챔버에서 고해상도 호흡 측정

이 연구에서 우리는 0.5밀리리터로 보정된 작은 부피 챔버가 Oroboros 플랫폼에서 2밀리리터의 클래식 부피에 대해 얻은 정확도를 손상시키지 않고 호흡 측정에 사용될 수 있는지 조사하고자 합니다.

소용량 챔버의 개발과 정밀 OXPHOS 분석을 사용한 엄격한 품질 관리를 통한 고해상도 호흡 측정법에 의한 평가는 개발, 새로운 혁신, 즉 12챔버 O2k 호흡계, 2위, OXPHOS 분석에 적용되는 복잡한 프로토콜에서 물질의 자동 적정을 위한 로봇을 향한 길을 열었습니다. 이러한 응용 분야는 미토콘드리아 분석, 미토콘드리아 질환 진단, 미토콘드리아 기능에 대한 약물의 이점과 미토콘드리아 기능을 비자발적으로 방해하는 오프 표적 효과에 초점을 맞춘 약물 개발 평가를 더욱 확장하는 데 매우 중요할 것입니다. 우리 팀이 30여 년 전에 고해상도 호흡 측정법을 개발했을 때 미토콘드리아, 미토콘드리아, 미토콘드리아라는 패러다임이 있었습니다. 근육과 간 미토콘드리아 사이에 차이가 있었을 수도 있지만 그게 전부였습니다. 아무도 이러한 패러다임 밖의 미토콘드리아에 관심을 갖지 않았습니다. 고해상도 호흡 측정을 위해 개발된 프로토콜을 통해 우리는 미토콘드리아 기능의 매우 다양성을 보여주었습니다. 이를 통해 다양한 세포 유형, 조직 및 종의 미토콘드리아 호흡 제어를 새로운 눈으로 평가할 수 있습니다. 30년 전에는 이를 높이 평가하는 출판물이 약 10개 있었습니다. 이제 우리는 이러한 프로토콜을 사용하는 1,500개 이상의 기기를 보유하고 있습니다.

소용량 챔버에는 기존의 2밀리리터 챔버에 비해 4배 적은 샘플이 필요합니다. 호흡수가 낮은 샘플의 경우 동일한 양의 샘플을 사용하여 부피 비산소 플럭스를 증가시켜 측정의 불확실성을 줄일 수 있습니다.

Oroboros R&D 연구소에서 우리 작업의 초점은 기기 개발과 학술 연구를 결합하는 것입니다. 우리는 다중 센서 분석을 통해 미토콘드리아 호흡 기능 및 생유전학 프로파일링을 평가합니다. 즉, 호흡, 산화환원 전위, 막 전위, 칼슘 흡수, 과산화수소 생성 및 생물유전학적 프로필과 미토콘드리아 기능 및 기능 장애에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있는 다양한 기타 매개변수를 측정합니다.

[해설자] 시작하려면 Small Volume 또는 SV 챔버를 Oroboros에 장착합니다. 그런 다음 Oroboros를 켜고 연결을 클릭하여 Oroboros를 DatLab 소프트웨어에 연결합니다. 챔버를 완전히 건조시킨 후 피펫을 사용하여 SV 챔버에 0.54밀리리터의 물을 추가합니다. 그런 다음 교반기를 켭니다. 챔버를 닫기 전에 마개의 O-링을 적셔 모세관을 건조하게 유지하십시오. 부피 교정 링을 푼 다음 액체가 마개 모세관을 채우고 상부 모세관 끝의 용기에 반월판이 형성될 때까지 마개를 아래쪽으로 삽입합니다. 볼륨 교정 링을 조여 위치를 고정하고 연속 삽입을 위해 보정된 볼륨 일관성을 보장합니다. 시작하려면 호흡 매체 MiR05로 챔버를 채우십시오. DatLab 소프트웨어를 시작합니다. 기기 배경 테스트에 적합한 프로토콜을 선택합니다. 교반 회전 속도를 550RPM, 챔버 부피를 0.5밀리리터, 데이터 기록 간격을 2초, 실험 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 교반기 테스트 및 공기 교정을 실행합니다. 키를 누른 상태에서 커서를 움직여 산소 농도 플롯에 R1 표시를 설정합니다. 때때로 제로 산소 교정을 수행합니다. 공기 교정 중에 O2-Zero 분말을 50밀리몰 인산염 완충액에 SV의 경우 2.5밀리몰 농도로 용해시켜 신선한 디티오나이트 나트륨 원액을 준비합니다. 공기 교정을 완료한 후 챔버를 닫습니다. 약 60분에서 120분 동안 산소 신호를 모니터링하여 산소 농도가 공기 포화도에서 약 150마이크로몰로 감소하도록 합니다. 산소 기울기 음의 플롯에 J01에서 J04로 표시된 4개의 표시를 설정합니다. 선택적으로, 해밀턴 주사기를 사용하여, 디티오나이트 나트륨 용액을 적정하여 산소 농도를 100마이크로몰로 조정하고, 표시 J05를 설정한다. DatLab에서 기기 산소 배경 기울기를 계산하려면 플럭스 기울기를 선택합니다. 그런 다음 산소 배경 보정 창을 열고 산소 배경 데이터의 소스로 활성 파일을 선택합니다. 모든 J0 표시가 선형 회귀 계산에 사용되는지 확인합니다. 그런 다음 산소 배경 보정을 위해 적용을 클릭합니다. 시작하려면 오로보로스 챔버를 탈이온수로 세척하고 신선한 MiR05 배지를 챔버에 추가합니다. 기기 배경 테스트 후 새 DatLab 탭을 열고 인간 혈소판 실험을 위한 SUIT-003 프로토콜을 선택합니다. 프로토콜 사이드바에 표시되는 DatLab 프로토콜 개요를 사용하여 화학 원액을 선택합니다. 그런 다음 화학 물질에 따라 Hamilton 주사기를 선택하십시오. SUIT 프로토콜에 따라 라벨이 있는 주사기 랙에 주사기를 순서대로 놓습니다. 부분 부피 교체의 경우 모세관 사체 부피를 고려하여 개방형 챔버의 실제 부피에서 제거된 부피 V와 동일한 부피 V를 계산합니다. 그런 다음 완전히 삽입된 스토퍼를 제거하고 랙에 놓습니다. 세포 유형 및 스톡 세포 현탁액의 농도에 따라 챔버에서 MiR05에서 계산된 부피 V를 제거합니다. 이제 알려진 세포 농도를 가진 동등한 부피의 스톡 세포 현탁액을 챔버에 피펫팅합니다. 대조적으로, 완전한 부피 교체를 위해서는 챔버에서 전체 매체를 빨아들입니다. 분리된 심장 미토콘드리아 스톡 0.54밀리리터를 SV 챔버에 추가합니다. 챔버를 닫고 과도한 샘플을 빨아들입니다.amp스토퍼 용기에서 용액. 기질 언커플러 억제제 적정 또는 SUIT 프로토콜을 시작하려면 DatLab에서 이벤트 창을 열어 적정량을 시각화합니다. Hamilton 마이크로 주사기를 사용하여 화학 원액을 챔버에 적정합니다. 그런 다음 DatLab에서 이벤트를 설정합니다. 적정 후 플럭스 안정화를 허용합니다. 데이터 분석을 위해 플롯의 대표적이고 안정적인 부분에 표시를 설정합니다. 공기 포화도에서의 배경 산소 플럭스는 2.0밀리리터 챔버에 비해 0.5밀리리터 챔버에서 3.9배 더 높았으며, 이는 이론적으로 예상되는 부피별 배경 산소 플럭스의 4배 차이와 일치합니다. 기기 배경 플럭스의 가변성은 두 챔버 볼륨에서 거의 동일했습니다. 살아있는 혈소판, 투과화된 섬유아세포 및 분리된 미토콘드리아의 호흡수는 적절한 배경 보정이 적용되었을 때 두 챔버 유형 모두에서 밀접한 상관관계가 있었습니다. 산소 플럭스는 재산소화 후 0.5밀리리터 챔버보다 2밀리리터 챔버에서 더 빨리 안정화되었습니다. 복합체 III 억제 후 잔류 산소 소비량은 두 챔버 간에 일관적이었으며 기기 검출 한계와 일치했습니다.