Name: 감염 관련 유전자 발현을 연구하기 위한 낭포성 섬유증 응집체 생물막 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 배우세요 낭포성 섬유증 폐 감염을 모사하는 다균 생물막 모델을 통해 유전자 발현 및 항생제 내성을 분석하는 방법을. 이 연구는 항균 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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HL, DN 및 JF는 낭포성 섬유증의 항균 치료제 개발을 위한 증거 기반 전임상 프레임워크인 전략 연구 센터(SRC)에 대한 보조금 지원을 받았습니다(PIPE-CF; 프로젝트 번호 SRC 022)는 영국 낭포성 섬유증 트러스트(UK Cystic Fibrosis Trust)와 미국 낭포성 섬유증 재단(US Cystic Fibrosis Foundation)으로부터 지원을 받았습니다. TH는 MRC Discovery Medicine North Doctoral Training Partnership PhD 학생의 지원을 받습니다. 우리는 CF Trust and CF Foundation(SRC022)과 MRC DiMEN DTP 제도의 자금 조달을 인정합니다

1. 단일 종 생물막의 제조
<ol>
	<li>동결 비드 스톡 배양에서 P. aeruginosa PAO1을 Lysogeny Broth (LB) 한천에 줄무늬를 만들고 37 °C에서 24 시간 동안 배양하여 살립니다.</li>
	<li>줄무늬 플레이트에서 단일 콜로니를 취하여 5mL LB 배지에 첨가하여 PAO1의 야간 배양을 준비합니다. 하룻밤 (18 시간) 배양 한 다음 0.05 (1 x 108 CFU / mL에 해당)의 OD600으로 희석하고 Palmer, et al.16에 따라 제조 된 SCFM2에서 1:100으로 더 희석합니다.</li>
	<li>180μL의 접종물을 바닥이 둥근 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 추가합니다. 식민지 형성 단위(CFU)에 의한 계수를 위해 생물학적 삼중체로 생물막을 준비합니다. 생물학적 복제물당 총 3회의 복제는 qPCR에 대해서만 수행됩니다. 3개의 개별 웰에 매체 컨트롤에 사용할 180μL의 멸균 SCFM2를 추가합니다. 
	참고: 둥근 바닥 플레이트는 전체 생물막을 주변 성장 배지에 균일하게 노출시킬 수 있는 우수성으로 인해 기존의 평평한 바닥 플레이트와 달리 선택되었습니다17.</li>
	<li>생물막이 24시간 동안 형성되도록 하고 37°C에서 배양하고 75rpm으로 진탕합니다.</li>
</ol>
2. 다종 생물막의 제조
<ol>
	<li>위에서 설명한 바와 같이 냉동 비드 스톡 배양물에서 P. aeruginosa PAO1 및 S. aureus SH1000을 되살립니다. Saboraud 포도당 한천에 단일 비드를 줄무늬로 만들고 37°C에서 24시간 동안 배양하여 냉동 비드 스톡 배양에서 C. albicans CAF2.1을 되살립니다.</li>
	<li>줄무늬 플레이트에서 단일 콜로니를 취하고 LB 5mL를 추가하여 SH1000 및 CAF2.1의 야간 배양을 준비합니다(각 유기체에 대해 별도의 야간 배양). 18시간 동안 밤새 배양합니다. LB의 S. aureus SH1000 및 C. albicans CAF2.1의 야간 배양을 각각 1 x10 9 및 1.2 x10 7 CFU/mL와 같은 0.1의 OD600 값으로 표준화합니다17,18.</li>
	<li>S. aureus 및 C. albicans를 희석하여 SCFM2에서 각각 1 x 106 및 1 x 105 CFU/mL 농도로 두 종을 포함하는 단일 접종물을 형성합니다.</li>
	<li>162μL의 접종물을 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 추가합니다. 식민지 형성 단위(CFU)에 의한 계수를 위해 생물학적 삼중체에 생물막을 접종합니다. 생물학적 복제물당 총 3회의 복제는 qPCR에 대해서만 수행됩니다. 3개의 개별 웰에 매체 제어에 사용할 180μL 멸균 SCFM2를 추가합니다.</li>
	<li>생물막이 24시간 동안 형성되도록 하고 37°C에서 배양하고 75rpm으로 진탕합니다.</li>
	<li>줄무늬 플레이트에서 단일 콜로니를 취하여 LB 배지 5mL에 첨가하여 PAO1의 하룻밤 배양을 준비합니다. 하룻밤(18시간) 배양한 다음 OD600에서 0.05(1 x 108 CFU/mL에 해당)를 추가하고 SCFM2에서 1 x 105 CFU/mL로 더 희석합니다.</li>
	<li>14.2μL의 PAO1 접종물을 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 추가하면 PAO1의 최종 접종물이 1 x 104 CFU/mL가 됩니다. 
	참고: 서로 다른 종 간의 접종물 농도의 이러한 차이는 S. aureus와 C. albicans가 P. aeruginosa에 의해 경쟁에서 밀리지 않고 모두 항생제가 존재하지 않는 24시간 생물막의 스폿 도금으로 회수할 수 있도록 하기 위한 것입니다.</li>
	<li>다미생물 생물막이 24시간 동안 형성되도록 하고 37°C에서 배양하고 75rpm으로 진탕합니다.</li>
</ol>
3. 단일 종 및 다중 종 생물막의 DNase 및 항생제 처리
<ol>
	<li>50μg/mL의 최종 농도로 생물막이 포함된 웰에 2μL의 DNase I을 직접 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 배양한 다음 75rpm으로 흔듭니다. 
	참고: 이는 점성이 있는 생물막을 얇게 하여 항균제의 더 나은 침투를 허용하기 위해 추가되며, 낭포성 섬유증을 앓고 있는 많은 사람들이 폐 악화에 대한 관리 전략으로 복용하는 rhDNase(재조합 인간 DNase)의 용량을 반영합니다.</li>
	<li>증류수를 희석제로 사용하여 메로페넴의 항생제 스톡을 2.56mg/mL로 준비합니다. 0.01 mg/mL - 2.56 mg/mL 농도를 달성하기 위해 2배로 연속 희석합니다.</li>
	<li>각 메로페넴 희석액 20 μL를 바이오필름에 첨가하여 1 μg/mL - 256 μg/mL의 투여량 범위를 달성합니다. 항생제 대신 20μL의 증류수를 음성 대조군 생물막에 첨가합니다.</li>
	<li>96웰 마이크로타이터 플레이트를 투명 필름으로 밀봉하고 37°C에서 24시간 동안 배양하고 75rpm으로 진탕합니다.</li>
</ol>
4. 생존 가능한 세포와 대사 활동의 열거
참고: 다음 단계는 CFU 정량화를 위한 생물막에만 적용됩니다.
<ol>
	<li>10μL의 셀룰라아제(100mg/mL, 0.05M 구연산염 완충액)를 생물막에 첨가하고 140rpm으로 진탕하면서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 셀룰라아제는 생물막 내의 셀룰로오스 골격을 파괴하는 데 정기적으로 사용됩니다.<>sup class="xref"19,20,21. 또한 눈에 보이는 덩어리가 없을 때까지 필요한 경우 위아래로 피펫팅하여 생물막을 방해합니다.</li>
	<li>0.02% 레사주린 용액 10μL를 첨가하여 시험용 생물막의 대사 활성을 평가하고 생물막을 제어하고 37°C에서 1시간 동안 배양하고 140rpm에서 진탕합니다.</li>
	<li>마이크로플레이트 리더에서 540nm의 excitation 파장과 590nm의 방출 파장을 사용하여 각 well의 형광을 측정합니다.</li>
	<li>blank 배지 샘플에서 형광 값을 빼서 배경 형광을 보정하고 백분율 감소를 (F항생제 처리된 생물막의 평균/F음성 대조군 평균) x 100%로 계산합니다.</li>
	<li>파괴된 생물막과 플랑크톤 세포를 모두 포함하는 웰의 내용물을 다음과 같이 선택적 한천에 연속적으로 희석하고 스폿 도금하여 열거합니다 
	녹농균(P. aeruginosa 의 계수를 위해 1% 글리세롤과 CN 보충제가 보충된 슈도모나스 선택적 한천
	S. aureus의 계수를 위한 Mannitol salt 한천| 
	효모 펩톤 포도당 한천은 C. albicans의 계수를 위해 페니실린(250 μg/mL), 스트렙토마이신(250 μg/mL, 겐타마이신 설페이트(30 μg/mL) 및 반코마이신(3 μg/mL)을 보충했습니다. 
	참고: 웰의 전체 내용물은 플랑크톤 세포에서 자유 부유 응집체 생물막을 분리하는 문제로 인해 열거됩니다. 그러나 이 접근법은 낭포성 섬유증 폐에 존재하는 상태를 보다 정확하게 반영합니다. 배양 후 뚜껑에 결로 현상이 나타날 수 있습니다. 우물 사이에 오염이 없도록 하려면 멸균 제어 장치를 선택적 한천에 스팟 플레이트로 고정합니다.</li>
	<li>선택적 한천에 스폿 도금한 후, 계수하기 전에 37°C에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.</li>
</ol>
5. RNA 추출을 위한 생물막 제조
참고: 이 시점 이후의 모든 단계는 RT-qPCR 분석만을 위한 생물막에만 적용됩니다.
<ol>
	<li>37°C 인큐베이터에서 바이오필름이 들어 있는 96웰 마이크로타이터 플레이트를 제거하고 1mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 전송할 때 수행된 각 생물학적 반복에 대해 생물막 복제가 풀링되었는지 확인합니다. 이를 통해 RNA 추출을 위한 충분한 바이오매스가 확보될 수 있습니다.</li>
	<li>생물막이 들어 있는 1.5mL 튜브를 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 같은 날에 RNA 추출을 수행하는 경우 6.2.1단계로 진행합니다. RNA 추출이 당일에 수행되지 않는 경우 상등액을 제거하고 -20°C에서 250μL의 RNA 안정화 용액에 펠렛을 보관하십시오. 이 솔루션은 여러 연구에서 박테리아 펠릿을 저장하는 데 사용되었습니다22,23.</li>
</ol>
6. RNA 추출
<ol>
	<li>상용 키트를 사용하여 박테리아 RNA 단일 종 및 다중 종 생물막을 추출합니다. 제조업체의 지침에 따라 버퍼를 준비합니다.</li>
	<li>배양 배지 상등액을 제거하고 폐기합니다. 펠릿을 안정화 용액에 보관한 경우 실온으로 해동하고 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 600μL의 RNA 추출 시약에 펠릿을 재현탁한 다음 2mL 주사기에 부착된 0.2mm 바늘을 사용하여 수동으로 절단합니다(5x-10x 흡입 또는 펠릿이 완전히 파괴될 때까지).</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 RNA 정제 단계를 수행합니다.</li>
	<li>UV 분광기, RNA BR Assay Kit 및 튜브를 사용하여 RNA를 정량화합니다. Assay kit를 사용한 RNA의 검출 가능 한계는 10 - 1200 ng/μL이므로 이 프로토콜에 대한 RNA의 최소 허용 수율은 10 ng/μL입니다.
	<ol>
		<li>샘플 및 표준물질에 필요한 튜브 수를 설정합니다(2개의 표준물질 필요).</li>
		<li>샘플 수당 199μL의 완충액과 1μL의 시약을 추가하여 작업 용액을 준비합니다(+ 2개의 표준물질 및 2개의 오류 표준물질).</li>
		<li>190 μL의 작업 용액과 10 μL의 표준물질 1 및 표준물질 2를 별도의 튜브에 추가합니다.</li>
		<li>199 μL의 작업 용액과 1 μL의 RNA 샘플을 별도의 튜브에 추가합니다. 30초 동안 소용돌이친 다음 어두운 곳에 5분 동안 보관하십시오.</li>
		<li>형광측정기에서 RNA > Broad range RNA를 선택하고 지침을 따릅니다.</li>
		<li>분광 광도계를 사용하여 RNA의 품질을 평가합니다. 분광광도계에 1 μL의 DNase/RNase-Free Water를 피펫팅하여 분광광도계를 비웁니다. 보푸라기가 없는 천으로 물기를 닦아내고 흡광도 비율을 260/280nM로 설정합니다. 분광 광도계에 1 μL의 RNA를 피펫팅합니다. RNA가 순수하면 260 및 280 nM 사이에서 단일 피크가 관찰되고 ~ 2.0의 비율이 표시됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cDNA Synthesis Kit를 사용하여 추출된 RNA를 상보적 DNA(cDNA)로 변환합니다. 50 ng/μL를 초과하는 RNA 샘플의 경우 먼저 DNase/RNase-Free Water를 사용하여 50 ng/μL로 희석합니다.
	<ol>
		<li>튜브를 사용하여 표 1에 따라 cDNA 반응 혼합물을 준비합니다.</li>
		<li>뒤에 오는 조건을 사용하여 열 Cycler에 있는 관을 두십시오: 5 분 동안 25 °C, 30 분 동안 42 °C, 5 분 동안 85 °C. cDNA를 즉시 이용하거나 -20 °C에 얼어 저장하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. qPCR
<ol>
	<li>qPCR 마스터 믹스를 사용하여 qPCR을 수행합니다. 다음 algD 및 하우스키핑 유전자(16S) 프라이머를 사용하십시오(표 2). 
	참고: 프라이머는 녹농균의 전체 게놈 염기서열을 참조하여 NCBI-primer Blast 온라인 도구를 사용하여 설계된 다음 상업용 공급업체를 통해 합성했습니다. 프라이머는 NCBI-primer Blast 도구를 사용한 염기서열 일치를 통해 다미생물 생물막의 특이성을 검증했습니다.</li>
	<li>20 μL의 프라이머를 480 μL의 DNase/RNase-Free 물에 희석하여 프라이머를 4 μM(4 pm/μL)로 희석합니다. 이들은 여러 용도로 동결 할 수 있습니다.</li>
	<li>표 3. 의 지침에 따라 qPCR 마스터 믹스의 작업 용액을 준비합니다.
	참고: algD 작업 용액에는 메로페넴 농도당 3x 생물학적 반복 및 3x 기술 반복, 6x 음성 대조군 및 2x 오류에 대한 충분한 솔루션이 포함되어 있습니다. 16S 작업 솔루션에는 알려진 RNA 농도의 2x 표준물질 및 2x 오류에 대한 충분한 솔루션이 포함되어 있습니다.</li>
	<li>18μL의 algD 작업 용액을 적절한 qPCR 반응 튜브에 추가합니다. 여기에는 algD 발현 분석을 위한 총 36개의 튜브와 음성 대조군을 위한 6개의 튜브가 포함됩니다.</li>
	<li>각 qPCR 반응 튜브에 2μL의 RNA를 추가하거나 음성 대조군에 2μL의 DNase/RNase-Free Water를 추가합니다.</li>
	<li>18μL의 16S 작업 용액을 적절한 qPCR 반응 튜브에 추가합니다. 여기에는 총 2개의 튜브가 포함됩니다. 알려진 농도의 RNA 2μL를 qPCR 반응 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>95°C에서 2분, 95°C에서 15초(40사이클), 60°C에서 1분 조건에 따라 qPCR을 수행합니다.</li>
	<li>앞에서 설명한 대로 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 qPCR 결과를 분석합니다24. algD 발현을 분석할 때 0 μg/mL에서 algD 발현을 각 생물막 조성에 대한 대조군으로 사용하고 처리되지 않은 배양액과 관련된 접힘 변화 발현을 고려하십시오.</li>
</ol>

Anti-Infective Efficacy in Cystic Fibrosis with Aggregate Biofilm Models

저자는 공개할 것이 없습니다.

이러한 결과는 CF 환자의 폐 악화 관리에 자주 사용됨에도 불구하고 메로페넴이 단일 종 또는 다종 생물막 모델에서 녹농균의 성장에 유의한 영향을 미치지 않았음을 보여줍니다. P. aeruginosa의 회복은 다종 생물막에서 S. aureus에 대해서도 볼 수 있듯이 128μg/mL 및 256μg/mL 메로페넴으로 처리한 후 두 모델 모두에서 관찰되었습니다. 그러나 이러한 증가는 미미했습니다. 메로페넴을 투여했을 때 C. albicans의 감소는 항균제의 스트레스에 반응하여 박테리아에 의해 생성되는 곰팡이에 대한 적대적인 조건 때문일 수 있습니다. P. aeruginosa가 단일 종 생물막으로 성장했을 때 메로페넴 농도 간의 algD 발현에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 그러나 256μg/mL 메로페넴으로 처리했을 때 다종 생물막에서 algD 발현이 유의하게 더 높았으며, 이는 이러한 조건에서 알지네이트 생산이 증가할 수 있음을 시사합니다. 생물막 조성과 메로페넴 농도 사이에서 관찰된 algD 발현의 차이는 관련 요인의 존재가 감염 관련 유전자 발현에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 보여주며 항생제 대안을 개발하고 테스트할 때 항균제 사용 및 다균 감염 상태를 고려하는 것의 중요성을 강조합니다.
모델의 유용성에도 불구하고 성공적인 적용을 위해서는 몇 가지 고려 사항이 있습니다. S. aureus 및 C. albicans가 그람 음성에 의해 경쟁할 위험이 있기 때문에 생물막 내에서 S. aureus 및 C. albicans의 형성은 P. aeruginosa에 감염되기 전에 필수적입니다. 이 생물막 모델에서 C. albicans는 항생제가 없는 경우에도 S. aureus 및 P. aeruginosa에 비해 생존율이 현저히 낮기 때문에 열악한 파트너로 보입니다. 이는 효모가 자원을 놓고 경쟁하거나 생물막27,28 내의 종간 상호 작용에 의해 부정적인 영향을 받는다는 것을 시사합니다. 직접적인 항진균 활성이 없는 항생제에도 불구하고 메로페넴 존재 하에서 C. albicans가 없다는 것은 메로페넴에 대한 S. aureus의 스트레스 반응이 C. albicans가 살기 어려운 환경을 만들 수 있다는 생각을 뒷받침합니다 29,30. 그러나 균주 선택은 다미생물 생물막 모델에서 회수할 수 있는 C. albicans의 양에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. PAO1 대신 P. aeruginosa, LESB58을 사용할 때 다른 경향이 관찰됩니다(보충 그림 1). LESB58을 사용하면 C. albicans는 모든 농도의 메로페넴에서 회수 가능하며 실제로 항균제의 결과로 P. aeruginosa의 농도가 감소하여 군집 구성이 변경됨에 따라 약간의 증가를 보입니다. 그러나 이러한 차이에도 불구하고 PAO1은 비교 연구를 위한 일관되고 잘 특성화된 기준선을 제공하는 실험실 참조 균주이기 때문에 이 모델에서 사용됩니다. 이러한 일관성은 재현성과 생물막 내의 상호 작용에 대한 신뢰할 수 있는 결론을 도출하는 데 매우 중요합니다.
배지의 점성 특성으로 인해 SCFM2에서 성장한 박테리아에서 다량의 RNA를 추출하는 것은 어려울 수 있습니다. 따라서 RNA 추출 전에 0.2mm 바늘로 생물막을 파괴하는 것은 RNA 수율을 높이고 RT-qPCR을 위해 충분한 농도(≥10ng/μL)를 추출하는 데 중요한 단계입니다. RNA는 분해에 매우 취약하므로31 추출 후 RNA를 사용하는 모든 다운스트림 활동이 얼음 위에서 수행되도록 합니다. RNA, cDNA 및 qPCR 프라이머를 정기적으로 동결-해동하면 제품 분해 가능성이 높아질 수 있습니다. 따라서 가능한 한 제한해야 합니다. 이러한 모델을 적용할 때 또 다른 일반적인 과제는 RNA 추출 또는 qPCR 분석 중 오염 위험입니다. 이러한 위험은 RNA 추출 전에 DNA 분해 용액을 장비에 분사하고 절차 전반에 걸쳐 DNase/RNase-Free 피펫 팁을 사용하여 최소화할 수 있습니다. DNase/RNase-Free 물을 정기적으로 교체하면 qPCR 분석 내에서 오염 위험을 줄이는 데 도움이 됩니다.
이 프로토콜은 급성 및 만성 감염 동안 P. aeruginosa의 주요 독성 인자로 설명되는 알지네이트 생산의 필요성으로 인해 관심 유전자로서 algD에 초점을 맞추기로 선택했습니다32. 따라서 알지네이트는 항독성 치료제의 표적으로 점점 더 많이 연구되고 있습니다33,34. 이 모델은 algD의 발현을 평가하는 데 사용되었지만 다양한 항독성 약물 표적에 대한 다른 P. aeruginosa의 발현을 평가하는 데 적용될 수 있습니다. 메로페넴은 항생제가 알지네이트 생합성 유전자의 발현에 영향을 미친다는 증거로 인해 이 연구에서 활용되었으며, 특히 P. aeruginosa가 C. albicans35의 존재 하에서 성장할 때 더욱 그렇습니다. 또한, 메로페넴은 종종 녹농균 호흡기 감염을 치료하고 관리하기 위해 임상적으로 처방되며, 이는 이 모델 내에서 관련 사용을 강조합니다36. 그러나 이러한 모델에서는 다양한 항생제를 추가하거나 이중 치료도 가능합니다. 이 모델 내에 항생제를 통합하면 카바페넴에 대한 P. aeruginosa에 의한 포린 매개 내성 발달과 같은 박테리아 내성 메커니즘의 진화적 변화를 연구하는 데 이 모델을 사용할 수 있습니다37. 이 다미생물 생물막 모델은 다른 관련 종, 예를 들어, Rothia sp. 및 Streptococcus sp.와 같은 공생 박테리아를 포함하도록 적응될 수 있으며, 또는 검사되는 약물 후보의 요구 사항을 반영하기 위해 Aspergillus sp.와 같은 다른 감염 유발 미생물로 대체될 수 있다.
CF 폐를 모방하는 다미생물 생물막 모델은 이전에 개발되었습니다38. 여기에 설명된 모델은 소량의 미생물 배양에 적합한 설정을 사용하여 처리량을 증가시키기 위해 이전 작업을 기반으로 합니다. 이는 사용 가능한 재료가 제한될 수 있는 새로운 화합물을 테스트하는 데 유리합니다. 모델이 소규모이고 정적이기 때문에 폐의 미호기성 환경을 보다 밀접하게 반영하기 위해 다양한 산소 가용성에서 생물막을 성장시킬 수 있습니다39,40. 재현성의 용이성과 비용 효율성의 이유로 이 연구에서 보고된 생물막은 호기성 성장이었습니다.
이 연구에서 얻은 귀중한 통찰력에도 불구하고 몇 가지 한계를 인정해야 합니다. 첫째, 숙주 세포의 부재는 직접적인 포유류 세포 표적을 가진 독성 인자 연구에 대한 유용성을 제한합니다. 이는 독성 인자 연구에 적합한 시험관 내 모델을 구축하는 데 따른 과제를 설명하고 만성 감염의 적대적인 환경을 복제하는 모델의 추가 개발의 필요성을 강조합니다. 또한, 독성 인자로 간주되지만 알지네이트는 생물막의 핵심 특징이며 실험실과 환경 모두에서 P. aeruginosa 에 의해 생성됩니다. 항생물막제를 연구하기 위해 시험관 내 모델을 사용하는 것은 표적이 진핵 세포에 직접적인 작용을 하는 항외독소제와 같은 다른 항독성 요법을 연구하기 위해 모델을 사용하는 것보다 덜 어려울 수 있습니다41.
PAO1의 P. aeruginosa(녹농균 ) 균주의 선택은 시험관 내 모델의 재현성 및 표준화에 적합하지만, 만성 감염으로부터의 분리주를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 환자 샘플에서 분리된 균주와 함께 이 모델을 사용한 향후 실험은 호흡기 틈새에 적응된 균주에 대한 항균제의 효과를 관찰하기 위해 수행될 것입니다.
이 시험관 내 모델에서 객담 모방물로 SCFM2를 사용하면 항생제 치료 과정 동안 기도 관련 환경에서 배양된 응집체 생물막의 행동 변화를 표준화하고 복제 가능하게 관찰할 수 있습니다. SCFM2는 생물막 형성을 지원하는 중요한 요소인 세포외 DNA(eDNA)와 뮤신을 포함하기 때문에 SCFM의 원래 버전보다 선택되었습니다. 그러나 p-아미노벤조산, NAD+, 아데닌, 구아닌, 크산틴 및 하이포크산틴42를 포함하는 SCFM3 및 철분 결핍 버전인 SCFM4와 같은 합성 객담 배지의 다른 변종도 사용할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, Ruhluel과 동료들이 개발한 낭포성 섬유증 폐 매체(CFLM) 및 낭포성 섬유증 부비동 매체(CFSM)와 같은 합성 가래 배지를 사용하면 기도를 구획화하여 다양한 환경에서 다미생물 생물막에 대한 항독성 치료제의 거동과 효과를 시각화할 수 있습니다.
AlgD는 알지네이트의 생합성 경로에서 핵심 효소이지만, 발현 수준만으로는 알지네이트 생산의 지표로 간주되어서는 안 됩니다. 전사 후 및 번역 후 변형과 같은 다른 요인과 조절 메커니즘은 생성되는 알지네이트의 양에 영향을 미쳐 생물막 형성 감소, 환경 스트레스에 대한 감수성 증가, 알지네이트 생산이 감소하는 항생제 감수성 향상으로 이어질 수 있습니다12,14. 알지네이트 단백질을 표적으로 하는 몇 가지 항독성 치료제가 개발 중이며, 이 모델은 효능을 결정하는 데 적합하지 않고 알지네이트 생산 또는 기능적 판독을 직접 측정하는 것이 더 유익할 것입니다44. 또한 일부 항독성 요법은 알지네이트 생합성 또는 조절의 다양한 단계를 표적으로 삼을 수 있으므로 알지네이트 생산을 측정하면 독성 인자에 대한 요법의 순 효과를 직접 포착할 수 있습니다44. 그럼에도 불구하고, 현재 연구에서 항독성 요법 중 일부는 주요 알지네이트 유전자를 표적으로 하며, 이와 같은 유전자 발현 모델은 그러한 요법의 효과를 연구하는 데 적절할 것입니다13,14. 이와 같은 기술은 고처리량 스크리닝에도 쉽게 적용될 수 있어 여러 샘플이나 조건을 신속하게 평가할 수 있으며, 이는 잠재적인 항독성 화합물의 초기 스크리닝과 관련된 대규모 연구에 유용합니다.
전반적으로, 단일 종 및 다종 생물막 모델은 CF 적절한 조건에서 녹농균의 감염 관련 유전자의 발현을 연구하는 데 유용한 도구를 나타냅니다. 조절제 요법의 대규모 출시는 CF 건강 관리 환경에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 CF 조절제의 다양한 임상적 이점에도 불구하고 연구에 따르면 슈도모나스의 클론 계통이 순환할 때까지 존재하고 있으며, 이는 녹농균 폐 감염을 관리하기 위한 새로운 치료법이 여전히 필요하다는 것을 강조합니다45,46. 논의된 한계에도 불구하고 이러한 모델의 적용은 약물 개발 파이프라인의 발견 단계에서 CF 폐 틈새 내에서 화합물의 효과와 이 환경 내에서 알려진 항생제와 새로운 항독성 화합물의 상호 작용을 평가하는 데 유용할 수 있습니다.

낭포성 섬유증(CF)은 백인 인구 내에서 가장 흔한 상염색체 열성 질환입니다1. 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR) 유전자의 돌연변이는 호흡기 내 점액의 과잉 생산을 포함하여 일련의 임상 증상을 초래합니다. 손상된 이온 수송은 이 점액을 탈수하게 하며, 그 결과 점액 섬모 시스템에서 적절하게 제거되지 않아 만성 폐 감염에 대한 감수성이 증가합니다1. CF 폐의 미생물학은 기회주의적 병원체의 뚜렷한 그룹으로 구성되며, Haemophilus influenzae와 Staphylococcus aureus는 CF에 감염된 유아와 어린이의 폐를 감염시키는 주요 유기체로 간주되며, 이러한 유기체의 감소와 이후 Burkholderia spp. 또는 성인기에 Pseudomonas aeruginosa로 집락화됩니다.1,2,3,4입니다. 박테리아 종 외에도 진균 미생물도 CF 폐 환경에서 흔하며, Candida spp와 Aspergillus spp는 가장 일반적으로 격리된 진균 종에 속합니다3,4,5. 이러한 유기체가 CF 폐 감염에서 중요한 역할을 하지만, 배양 기술과 배양 독립적 방법의 발전으로 CF 폐 감염이 단일 박테리아 종에 국한되는 경우는 거의 없다는 것이 밝혀졌으며, 따라서 CF lung1,6의 복잡한 다미생물 특성이 강조되었습니다.
이러한 지식에도 불구하고, 만성 폐 감염에 사용하기 위한 항생제의 개발 및 테스트를 위한 현재의 시험관 내 및 생체 내 방법은 CF 폐 틈새7와 완전히 유사하지 않으며, 단일 종 배양에 대한 약물의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하는 데 중점을 두고 있습니다. 이는 CF 폐 병리학의 핵심 구성 요소인 감염성 미세환경을 제한적으로 고려합니다8. 따라서 방법은 일반적으로 박테리아의 성장을 플랑크톤 배양으로 포함하며, 이는 CF 폐 내 박테리아의 성장 상태를 반영하지 않을 가능성이 높습니다. 이는 일반적으로 다른 박테리아 및 곰팡이 종을 추가로 포함하는 생물막 응집체로 나타나는 녹농균에 특히 중요합니다9. 이러한 요인은 만성 폐 감염에 대한 항생제를 검사할 때 문제를 일으키고 CF 폐 환경 내에서 항생제 감수성 검사 방법과 항균 활성 간의 차이를 강조합니다9,10. 이러한 문제는 MIC 분석이 활성의 지표가 아니고 숙주-병원체 상호 작용에 대한 이해를 제공하지 않는 항병독성 치료제와 같은 항생제 대안을 스크리닝할 때 악화됩니다11.
세포외 다당류인 알긴산염은 폐 틈새 내 녹농균 생물막의 핵심 구성 요소이며 항생제 및 면역제에 대한 박테리아 내성을 증가시키고 표면 접착력을 향상시킵니다12. 알긴산염은 항독성 치료제 개발을 위한 매력적인 표적이며, 알긴산 생합성의 핵심 유전자인 algD를 표적으로 하는 것과 같이 알긴산 생합성을 표적으로 하는 여러 치료법이 개발되었습니다13,14. 이러한 치료제는 낭포성 섬유증 환자에서 항생제 요법과 함께 사용하여 녹농균 생물막을 파괴하여 박테리아를 플랑크톤 상태로 전환시킬 수 있습니다. 이는 생물막 세포외 기질의 파괴로 인해 항생제가 박테리아 표적에 도달하는 능력을 증가시키기 때문에 항생제 효능을 증가시킵니다15. 그러나 체외 활성의 증거에도 불구하고 CF 폐 틈새 내에서 이러한 치료제의 작용은 불분명합니다.
여기에 제시된 응집체 생물막 모델은 CF 폐 내에서 녹농균과 함께 일반적인 공동 집락자인 S. aureus 및 C. albicans를 추가하여 이러한 문제를 해결하는 역할을 합니다. 또한 녹농균(P. aeruginosa)이 호흡기 환경에서 볼 수 있듯이 생물막 응집체에서 자랄 수 있습니다. 성장을 위한 영양 환경으로 SCFM2(Synthetic Cystic Fibrosis Media 2)를 모방한 객담을 사용하면 뮤신, 세포외 (e)DNA 및 CF lung16 내에서 볼 수 있는 것을 복제하는 아미노산 프로파일을 포함한 숙주 영향을 추가할 수 있습니다.
CF 폐의 상태를 더 자세히 포착하기 위해 폐가 악화되는 기간 동안 CF 환자에게 자주 처방되는 항생제인 메로페넴에 생물막을 노출시킵니다. 이 모델 내에서 항생제의 사용은 항독성제가 처방될 수 있는 임상 조건을 복제하는 수단으로 권장되며, 예를 들어, 악화 시 호흡기 증상을 관리하기 위해 항생제 치료와 결합된 복합 요법으로 권장됩니다. 또한, 메로페넴을 포함하면 감염 관련 조건에서 항생제 노출에 대한 녹농균 전사 반응을 평가할 수 있습니다. 이 모델은 CF 폐 내에서 어떤 요인이 적절한 약물 표적이 될 것인지에 대한 정보를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델은 또한 토브라마이신과 같은 다른 관련 항생제를 포함하고 다른 관심 유전자의 발현을 평가하기 위해 수정될 수 있습니다.
여기서, 이 응집체 다미생물 모델은 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스의 존재와 다양한 농도의 메로페넴(1, 16 및 256 μg/mL)이 녹농 균에 의한 algD 발현에 미치는 영향을 평가하는 데 사용됩니다.메로페넴은 주로 녹농균(P. aeruginosa) 폐 감염을 치료하기 위해 처방되며, S. aureus 또는 C. albicans에는 직접적인 영향을 미치지 않으며, 이 두 동거 종의 MIC는 >256μg/mL입니다.
이 연구는 SCFM2 내의 숙주 인자 및 공동 집락 미생물과 같은 관련 요인이 녹농균 감염 관련 유전자의 발현에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 대한 이해를 높이고 만성 CF 호흡기 감염에 사용하기 위한 항독성 치료제의 개발 및 테스트를 위한 기반을 제공할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>멀티웰 플레이트를 위한 숨쉬기 쉬운 밀봉 멤브레인&nbsp;</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td></td><td></td>Z763624</tr><tr><td>분젠 버너</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>셀룰라아제 (100 mg/mL)</td><td>Cambridge Bioscience&nbsp;</td><td>HY-B2220-5g</td><td></td></tr><tr><td>CN 보충제&nbsp;</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>1.07624</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free 물</td><td>VWR</td><td>J60610. </td><td></td>XC</tr><tr><td>겐타마이신 설페이트(30 &micro; g/mL)</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 (1 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15514029</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR 마스터 믹스&nbsp;</td><td>프로메가&nbsp;</td><td>A6101</td><td></td></tr><tr><td>iScript Cdna 합성 키트&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 (250 U/mL)</td><td>Scientfic 실험실 용품</td><td>P3032-10MU</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 형광측정기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Qubit RNA BR 어세이 키트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10210</td><td></td></tr><tr><td>큐빗 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>레사주린 용액(0.02 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R12204</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Soln</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신(250 &micro; g/mL)</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>열 순환기 (우리는 T100 열 순환기를 사용했습니다)</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Vancomycin (3 &micro; g/mL)</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td></td><td></td>1709007</tr></tbody></table>

감염 관련 유전자 발현을 연구하기 위한 낭포성 섬유증 응집체 생물막 모델

Cystic Fibrosis Aggregate Biofilm Model to Study Infection-relevant Gene Expression

낭포성 섬유증 환자의 만성 폐 감염을 치료하는 데 사용되는 새로운 항균 치료제에 대한 표준 전임상 검사 방법은 적대적인 폐 틈새 시장의 환경 조건을 반영하지 않습니다. 현재의 환원주의적 테스트 조건은 낭포성 섬유증, 폐 틈새 시장에 적합한 조건에서 활성에 대한 증거 없이 전임상 파이프라인을 따라 화합물의 진행으로 이어질 수 있습니다. 전통적인 항생제를 연구하는 데 사용되는 여러 접근법은 항정족수 감지제 및 시데로포어 억제제와 같은 항독성 치료제를 포함한 항생제 대안에 적합하지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 응집체 생물막 모델을 문서화하여 단일 종 및 다중 종 배양(황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스)에서 저항성 및 감염 관련 유전자 발현을 비교하고, algD를 예로 들어 콜로니 형성 단위(CFU) 감소 및 유전자 발현의 변화를 조사합니다. 이 모델은 화합물 양이 제한될 수 있는 약물 개발 파이프라인의 발견 단계에서 새로운 화합물을 연구할 수 있도록 작고 정적인 부피의 박테리아 배양에 최적화되었습니다. 단일 종 P. aeruginosa 생물막은 합성 낭포성 섬유증 배지 2(SCFM2)에서 24시간 동안 형성된 후 다른 농도(1, 16 및 256μg/mL)에서 메로페넴으로 처리하기 전에 추가로 24시간 동안 형성되었습니다. SCFM2에서 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 함께 성장시킨 후 녹농균(P. aeruginosa)을 추가로 24시간 동안 접종하고 메로페넴(meropenem)으로 처리하여 다미생물 생물막을 확립했습니다. 전임상 검사에서 화합물 효능 측정과 임상 시험 결과 사이에 직접적인 연관성이 없다는 것은 현재 실험실 스크리닝 도구의 적용 가능성에 대한 의문을 제기합니다. 이 모델을 통해 내성 및 독성에 기여하는 유전자를 포함하여 P. aeruginosa 유전자 발현에 대한 관련 요인의 영향을 이해하여 이러한 격차를 해소할 수 있습니다.

그림 1A에 표시된 결과는 meropenem 처리 시 테스트한 모든 용량에서 유의미한 감소가 관찰되지 않았으며, 이를 통해 단일 종 Pseudomonas 바이오필름의 회복력이 높음을 강조합니다. meropenem에 노출되지 않은 음성 대조군은 8.31 ± 0.07 Log10CFU/mL의 회복률을 보인 반면, 생존 세포의 최대 감소는 16 µg/mL에서 발생하여 8.06 ± 0.10 Log10CFU/mL의 회복률을 나타냈습니다. 그러나 이러한 수준의 내성은 예상된 결과인데, 문헌에 따르면 P. aeruginosa 바이오필름은 부유 세포보다 meropenem에 훨씬 더 강한 내성을 가지며, MIC가 2 µg/mL인 부유 세포와 달리 바이오필름에 대해 살균 효과를 나타내기 위해서는 &gt;256 µg/mL의 농도가 필요하기 때문입니다25,26.
그림 1B는 메로페넴에 노출되지 않은 대조군 바이오필름과 비교하여, 각 항생제 농도별 P. aeruginosa 단일 배양 바이오필름의 대사 활성 평균 감소 백분율을 보여줍니다. 형광의 감소는 대사 활성의 저하를 의미하며, 이는 생존 세포의 감소를 나타내는 대리 지표로 간주됩니다. 메로페넴 처리 배양물은 대사 활성이 증가(음의 감소 백분율로 표시)한 것으로 나타났으며, 이는 살균 활성이 없거나 매우 제한적임을 나타냅니다.
CFU 회수량의 증가 없이 대사 활성만 증가한 것은 항생제 노출에 대한 박테리아의 대사 반응을 나타낼 수 있습니다. 단일 종 및 다종 바이오필름(그림 2) 간에 P. aeruginosa의 전반적인 성장은 약간만 차이가 났으며, 항생제가 없을 때 단일 종 바이오필름에서 회수된 생존 세포는 다종 바이오필름에서 관찰된 것보다 0.74 ± 0.17 Log10CFU/mL 더 높았습니다. S. aureus는 다종 바이오필름에서 6.95 ± 0.11 Log10CFU/mL로 회수되었으며, C. albicans는 1.66 ± 2.88 Log10CFU/mL로 회수되었습니다. 그러나 C. albicans는 meropenem이 첨가되지 않은 곳에서만 존재했으며, 항생제가 투여된 어떤 바이오필름에서도 회수되지 않았습니다. C. albicans 단일 배양을 대상으로 실험실에서 수행한 이전 MIC 분석에서 meropenem의 MIC 값이 &gt;256 µg/mL로 나타나 meropenem이 Candida에 직접적인 영향을 미치지 않는다는 것이 입증되었으므로, 함께 서식하는 다른 종인 S. aureus 및 P. aeruginosa가 항생제 노출에 대해 보이는 박테리아 스트레스 반응이 진균에게 적대적인 환경을 조성했을 가능성이 큽니다.
P. aeruginosa 바이오필름이 단일 배양 및 공동 군집 병원균과 함께 배양된 경우 모두 최대 256 µg/mL의 meropenem 농도에서도 생존 세포 회복률의 감소를 보이지 않았으므로, 이는 임상에서 이러한 만성 감염을 퇴치하기 위해 항독성 치료법과 같은 대체 치료제의 필요성을 강조하며, 이러한 치료제는 항균제와 병용하여 세균 부하를 효과적으로 감소시킬 수 있을 것입니다.
P. aeruginosa PAO1 단일 종 바이오필름에서의 algD 발현 
SCFM2에서 배양하고 서로 다른 농도의 meropenem (1, 16, 256 µg/mL)에 노출시킨 P. aeruginosa PAO1의 algD 발현을 SYBR-Green RT-qPCR을 이용하여 평가하였다. 이후 16S 를 대조 유전자로 사용하여 2-ΔΔCt 방법으로 발현량을 분석하였다(그림 3). algD 의 발현은 사용된 meropenem 농도 간에 유의미한 차이가 없었으며, 이는 PAO1이 단일 종 바이오필름으로 성장할 때 algD 발현이 meropenem의 존재에 의해 크게 영향을 받지 않음을 시사한다.
algD ~에서의 발현 P. aeruginosa PAO1 다종 바이오필름 
의 발현 algD 또한 ~에서 평가되었다 P. aeruginosa 다음으로 구성된 바이오필름 내에서 배양된 PAO1 S. aureus SH100 및 C. albicans 공동 정착 유기체의 존재가 다음의 발현에 영향을 미치는지 평가하기 위해 CAF2.1를 사용하여 algD 또는 PAO1의 메로페넴에 대한 반응에서도 마찬가지였습니다. ~에서 유의미한 차이는 없었습니다. algD 발현이 0- 사이에서 관찰되었습니다.16 µg/mL 메로펜엠 노출. 하지만, 256 µg/mL, ~의 발현 algD 다른 항생제 농도와 비교하여 유의하게 더 높았으며 (0 µg/mL 대비 256 µg/mLp = 0.0075, 1 µg/mL 대비 256 µg/mL p = 0.035, 16 µg/mL 대비 256 µg/mL (p = 0.0048) 대조군 조건보다 약 7배 더 높게 (그림 4). 이는 ~가 존재하는 환경에서 배양되었을 때, S. aureus 그리고 C. albicans, ~의 발현이 증가하였습니다. algD meropenem의 최고 농도에서, ~했을 때와 비교하여 P. aeruginosa 단독으로 배양되었을 때와 비교하여, 이는 다종 미생물 환경에서 알지네이트 생성이 증가함을 시사한다. ~에서 차이가 나타남에도 불구하고 algD 단일 종 및 다종 바이오필름 간의 발현 차이로 인해, 이러한 발현 증가가 특정 종의 존재로 인해 발생하는 것인지 여부는 불분명하며 (S. aureus 또는 C. albicans) 또는 두 미생물 모두가 관여하는 상호작용이 이러한 유전자 발현 변화를 유도하고 있는지 확인합니다.
이러한 결과는 치료제와 환경이 유전자 발현에 미치는 영향을 이해하는 것이 중요하며, 특히 향후 독성 타겟 치료제의 테스트 맥락에서 그러함을 강조합니다.
<img alt="농도에 따른 P. aeruginosa, S. aureus 및 C. albicans의 세균 성장 억제 막대 그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 1"> 
그림 1~로 구성된 단일 종 바이오필름 Pseudomonas aeruginosa PAO1바이오필름을 SCFM2에서 24시간 동안 배양한 후, 다음으로 처리하였다. 50 µg/mL DNase I로 1시간 동안 처리한 후, 다양한 농도의 meropenem으로 24시간 동안 추가 처리하였다. (A) 평균 로그값10CFU/mL. 점선은 2-log 감소(99% 감소와 동일)를 나타냅니다. P. aeruginosa 음성 대조군으로부터의 회수율. (B) 상대 형광 단위의 감소 백분율. 점선은 형광의 50% 감소를 나타내며, 이 선 위의 첫 번째 지점이 MIC50 값으로 간주됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="그래프의 메로페넴(Meropenem) 농도 대비 세균 성장(A) 및 형광 감소(B)" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 2"> 
그림 2~로 구성된 다종 바이오필름 Pseudomonas aeruginosa PAO1, 황색포도상구균 SH1000 및 Candida albicans CAF2.1바이오필름을 SCFM2에서 24시간 동안 배양한 후, 다음으로 처리하였다. 50 µg/mL DNase I로 1시간 동안 처리한 후, 다양한 농도의 meropenem으로 24시간 동안 추가 처리하였다. 점선은 2-log 감소(99% 감소와 동일)를 나타낸다. P. aeruginosa 음성 대조군에서의 회복률. 유의성은 이원 분산 분석(two-way ANOVA)으로 결정되었으며, **** p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="상대적 발현량 대 농도(µg/ml)의 막대 그래프로, 통계 분석 결과(ns)를 나타냄." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 3"> 
그림 3: P. aeruginosa PAO1 단일 종에서 추출한 algD 의 발현. 바이오필름을 SCFM2에서 24시간 동안 배양하고, 50 µg/mL DNase I로 1시간 동안 처리한 후, 다양한 농도의 meropenem (0, 1, 16, 256 µg/mL)에 노출시켰다. 유전자 발현은 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 분석하였다. 분석에는 하우스키핑 유전자인 16S 가 사용되었다. 유의성은 Tukey의 다중 비교 검정으로 결정하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="농도 대비 상대적 발현량의 막대 그래프; 통계적 유의성; 유전자 발현 분석" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 4"> 
그림 4: 발현 algD ~로 구성된 다종 생물막에서 추출된 P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 및 C. albicans CAF2.1바이오필름을 SCFM2에서 배양한 후, 다음으로 처리하였다. 50 µg/mL 1시간 동안 DNase I로 처리하고, 다양한 농도(0, 1, 16, 256 µg/mL)로 24시간 동안 추가 배양하였다. 유전자 발현은 $2^{-\Delta\Delta Ct}$법을 이용하여 분석하였다. 하우스키핑 유전자는 16S 분석에 사용되었다. **p &lt; Tukey의 다중 비교 검정으로 결정된 p < 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >cDNA 반응당 부피 (μL)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >5X iscript Reaction mix</td >
			<td >4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >iscript Reverse Transcriptase</td >
			<td >1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Water</td >
			<td >14</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2.5ng RNA</td >
			<td >1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >총 반응 부피</td >
			<td >20</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
표 1: cDNA 마스터 믹스의 작동 용액. cDNA 반응당 필요한 성분 및 부피.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>유전자</td>
			<td>정방향 프라이머</td>
			<td>역방향 프라이머</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>algD</td>
			<td>CGCCGAGATGATCAAGTACA</td>
			<td>TGTAGTAGCGCGACAGGTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16S</td>
			<td>ACCGCATACGTCCTACGG</td>
			<td>CGAAGACCTTCTTCACACACG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: algD 및 16S 정방향 및 역방향 qPCR 프라이머.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >반응당 부피 (µL)</td >
			<td >algD 작업 부피 (µL)</td >
			<td >16S 작업 부피 (µL)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >GoTaq qPCR Master Mix (2X)</td >
			<td >10</td >
			<td >440</td >
			<td >40</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >정방향 프라이머</td >
			<td >1</td >
			<td >44</td >
			<td >4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >역방향 프라이머</td >
			<td >1</td >
			<td >44</td >
			<td >4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >DNase/RNase-Free Water</td >
			<td >6</td >
			<td >264</td >
			<td >24</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >총합</td >
			<td >18</td >
			<td >792</td >
			<td >72</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
표 3: qPCR 마스터 믹스 작업 용액. algD 및 16S qPCR 마스터 믹스 용액에 필요한 구성 성분 및 부피.
보충 그림 1: Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000 및 Candida albicans CAF2.1로 구성된 다종 바이오필름. 바이오필름을 SCFM2에서 24 h(n = 3) 동안 배양한 후, 50 µg/mL DNase I로 1 h 동안 처리하고, 다양한 농도의 meropenem으로 24 h 동안 추가 처리하였다. 점선은 음성 대조군 대비 P. aeruginsoa 회수율의 2-log 감소(99% 감소와 동일)를 나타낸다. 통계 분석은 two-way ANOVA로 수행되었다. *p=0.0242, ** p=0.0013, **** p &lt;0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/Supplementary_Figure_1_RE.tif" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 연구는 낭포성 섬유증 폐 환경을 반영하는 녹농균 유전자 발현을 평가하기 위해 응집체 다미생물 생물막 모델을 개발하고 RNA 추출 프로토콜을 최적화하기 위한 프레임워크를 설명합니다. 응용 분야에는 항균 효과 평가 및 낭포성 섬유증과 관련된 조건에서 항생제 대안 연구가 포함됩니다.

Standard pre-clinical testing methods for novel antimicrobial therapeutics used to treat chronic lung infections in people with cystic fibrosis do not ...

cystic-fibrosis-aggregate-biofilm-model-to-study-infection-relevant

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Beaudoin, T. 외 챔버 커버글라스 모델을 이용한 가래가 바이오필름 형성에 미치는 영향을 시각화하기. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 환자 유래 낭포성 섬유증 가래가 박테리아 바이오필름 형성에 미치는 영향을 평가하는 시험관 내 방법을 시연합니다. 챔버 슬라이드, 형광 염색, 공초점 현미경을 사용하여 가래로 성장한 바이오필름에서 두께 증가, 구조 변화, 생존 가능한 바이오매스 증가를 밝혀내어 숙주 구성 요소가 바이오필름 발달에 미치는 역할을 강조합니다.

낭포성 섬유증 환자의 가래에 의해 유도된 박테리아 바이오필름의 공초점 영상

이 프로토콜은 슬라이드 챔버 모델을 사용하여 숙주 인자에 노출된 후 생물막 발달의 시각화를 설명합니다. 이 모델을 사용하면 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 생물막 매개변수를 분석할 뿐만 아니라 생물막 개발을 직접 시각화할 수 있습니다.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

점액은 낭포 성 섬유증의기도가 (CF) 환자는 미생물 병원균이 번창 할 수있는 이상적인 환경이다 연결. 원고들은 화학 조건의 질병 및 방법 변경의 원인이 모방 미생물 역학을 구동 할 수있는 환경에서 CF 폐 마이크로 바이 옴을 연구하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

WinCF 모델 - 폐렴의 미생물학을 연구하기 위해 점액으로 촘촘하게 밀집된 Bronchiole의 저렴하고 견고한 소우주

이 워크플로우는 낭포성 섬유증을 가진 개별의 폐에 있는 세균성 생물막의 확립된 ex vivo 모형을 사용하여 항생제 감수성 시험을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 모델의 사용은 MBEC의 임상 타당성을 향상시킬 수 (최소한의 생물 막 박멸 농도) 에세이.

낭포성 섬유증 폐에 있는 슈도모나스 아에루기노사 및 황색포도상구균 생물막의 Ex vivo 모형에 있는 항생제 효능 시험

이 프로토콜은 박테리아 종간 상호 작용의 영향을 탐구하는 데 사용할 수 있는 낭포성 섬유증(CF) 폐 관련 4종 다미생물 생물막 모델을 설명합니다.

커뮤니티 표현형을 조사하기 위한 낭포성 섬유증 관련 다미생물 생물막 성장

이 방법론을 통해 연구 및 임상 실험실에서 항균성 감수성 테스트를 위해 낭포성 섬유증에서 다미생물 생물막 모델을 구축할 수 있습니다. 이 모델은 다양한 출력에 걸쳐 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발

이 절차는 murine 골수에서 조혈 세포 기본 문화를 확립하고 진 Pulser MXCell의 electroporation 시스템을 사용 transfection하여 다음 방법을 설명합니다.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

electrophysiologic 연구 신생아 마우스 척수의 고립의 데모.

척수 전기 생리학

이 절차를 빠르게 쉽게 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs) 또는 기타 기본 세포에 가장 적합한 electroporation 조건을 식별하는 유전자 Pulser MXcell의 electroporation 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 문제 해결을위한 고려 사항도 관련 비디오 설명합니다.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

이 절차는 셀 라인을 transfect 실시간 PCR에 의해 유전자 발현에 따라 어려움에 siRNA를 도입하는 빠르고 쉬운 흐름을 설명합니다. 자동 셀 카운터의 사용, 멀티 잘 electroporation 판 및 자동 전기 영동 역은 고가의 로봇 처리가 필요없이 신속하고 신뢰성있는 결과를 제공합니다.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

배우세요 낭포성 섬유증 폐 감염을 모사하는 다균 생물막 모델을 통해 유전자 발현 및 항생제 내성을 분석하는 방법을. 이 연구는 항균 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

감염 관련 유전자 발현을 연구하기 위한 낭포성 섬유증 응집체 생물막 모델

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