Name: 제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 학습하세요 제브라피시에서 형광 단백질 태그를 이용한 저발현 단백질 시각화 방법을. 이 프로토콜은 donor 구축 과정을 단순화하여 단백질 위치와 발현 연구에 활용할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>CRISPR/Cas9 Knock-In을 사용한 제브라피시 유충의 형광 단백질 태깅

<ol><li>Brittijn, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+regeneration%3A+new+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
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<li>Luo, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+of+zebrafish+using+a+seamless+integration+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy.</a> FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> Elife. 9, e53968(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tagging+strategies+for+illuminating+expression+profiles+of+genes+with+different+abundance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish.</a> Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).</li>
<li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li>
<li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+based+protocol+for+detecting+indel+mutations+induced+by+TALENs+and+CRISPR%2FCas9+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish.</a> PLoS One. 9 (6), e98282(2014).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+39.9+protein+is+necessary+for+coordinated+activation+of+slow-twitch+muscle+and+normal+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish.</a> J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).</li>
<li>Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+expression+analysis%2C+and+functional+characterization+of+connexin44.1%3A+a+zebrafish+lens+gap+junction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein.</a> Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).</li>
<li>Urushibata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+speed+in+zebrafish+embryos+using+different+incubation+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures.</a> Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+digestion+and+ligation-mediated+PCR+used+for+flanking+sequence+walking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking.</a> Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1000 &마이크로; 엘&nbsp; 팁</td><td>모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>모든 조작용</td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>다양한 용액의 보관 및 원심분리용</td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브(RNase-free)</td><td>모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>RNase-free 용액의 저장 및 원심분리용</td></tr><tr><td>10 &micro; L 팁</td><td>모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>모든 조작에 대해</td></tr><tr><td>10 &마이크로; L 팁 (RNase-free)</td><td>모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>RNase-free 조작용</td></tr><tr><td>1000 &micro; 엘&nbsp; 팁 (RNase-free)</td><td>모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>RNase-free 조작용</td></tr><tr><td>1-페닐 2-티오우레아 (PTU)</td><td>시그마</td><td>P7629</td><td>멜라닌 형성을 억제하고 유충을 투명하게 유지하기 위해</td></tr><tr><td>200 &마이크로; L 팁</td><td>모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>모든 조작에 대해</td></tr><tr><td>200 &마이크로; L tips (RNase-free)</td><td>Any brand</td><td>N/A</td><td>RNase-free manipulations</td></tr><tr><td>2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)</td><td>Vazyme</td><td>P213-03</td><td>PCR sgRNA 효율 테스트용</td></tr><tr><td>35mm dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td> 이미징용 <td>Any brand</td><td>N/A</td><td>제브라피쉬를 개별적으로 또는 임시로 사육하기 위해</td></tr><tr><td>Acc65I</td><td>NEB</td><td>R0599S</td><td> 효소 분해</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마</td><td>695092</td><td>TAE 완충액 준비용</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Biofroxx</td><td>8211GR500</td><td>LB 플레이트용</td></tr><tr><td>암피실린, 나트륨 염</td><td>Sangon</td><td>A610028</td><td>LB 플레이트용</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>배아 완충액 준비용</td></tr><tr><td>모세관</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td>주입용 바늘 생성용</td></tr><tr><td>캐필러리 튜브</td><td>모든 브랜드</td><td>ID (내경) = 0.1 mm</td><td>1-nL 드롭릿 정량화용</td></tr><tr><td>CRISPRscan</td><td>CRISPRscan</td><td>&nbsp; http://www.crisprscan.org/</td> <td>sgRNA 디자인</td></tr><tr><td>DH5&alpha를 위해;</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td>변형용</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마</td><td>E6758</td><td>용해 완충액 및 TAE 완충액 준비용</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>Ensembl</td><td>&nbsp; https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index</td><td>유전자 정보를 찾으려면</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>HUSHI</td><td>64-17-5</td><td>DNA 정제 및 추출용</td></tr><tr><td>엑소뉴클레아제 III</td><td>Takara</td><td>2170A</td><td></td></tr><tr><td>LIC 가스 구동 마이크로 주입기</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>PLI-100A</td><td>마이크로 주입</td></tr><tr><td>용 젤 전기영동 시스템</td><td>WIX</td><td>WIX-EP3000</td><td>젤용 전기 영동</td></tr><tr><td>장갑</td><td>모든 브랜드</td><td>N / A</td><td>모든 조작 포도</td></tr><tr><td>당</td><td>sgdbio</td><td>10010518</td><td>LB 플레이트 용</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sangon</td><td>A501745</td><td>LB 플레이트</td></tr><tr><td>용 gRNA-pMD19-T</td><td>중국 제브라 피쉬 자원 센터 (CZRC)</td> <td>CZP3</td><td>sgRNA 플라스미드 함유 sgRNA 스캐폴드</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>배아 용 완충액 준비</td></tr><tr><td>염화리튬 침전 용액</td><td>Thermofisher</td><td>AM9480</td><td>sgRNA의 침전, RNase-free</td></tr><tr><td>저 융점 아가로 스</td><td>Sangon</td><td>A600015</td><td>4 % 아가 로스 겔 제조</td></tr><tr><td>용 황산 마그네슘</td><td>sgdbio</td><td>20025118</td><td>LB 플레이트 용</td></tr><tr><td>금속 목욕</td><td>모든 브랜드</td><td>N / A</td><td>항온 배양 용</td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>시그마</td><td>M9140</td><td>배아 완충액 준비용</td></tr><tr><td>Microinection 금형</td><td>수제</td><td>N/A</td><td>마이크로주입 중 배아를 보관하기 위한 홈을 생성하기 위해</td></tr><tr><td>Microloader, Femtotips 및 기타 유리 마이크로캐필러리를 채우기 위한 팁, 멸균, 0.5 &ndash; 20 &마이크로; L, 100mm, 라이트 그레이, 192개 (2 랙 &횟수; 96 개)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RNase-free</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>주입용 바늘 생성용</td></tr><tr><td>마이크로피펫</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>모든 조작용</td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Any brand</td><td>N/A</td><td>주입판 및 아가로스 겔 주조용</td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트 (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28004</td><td>PCR 산물 및 분해 산물을 정제하기 위해, RNase-free</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1348</td><td>In-vitro transcription of Cas9 mRNA, RNase-free</td></tr><tr><td>N2</td><td>Any brand</td><td>N/A</td><td>미세주입용</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>배아 완충액 및 용해 완충액 준비용</td></tr><tr><td>NaHCO3</</td><td>sub>Sigma</td><td>S5761</td><td>배아 완충액 제제용</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sangon</td><td>A100173</td><td>TAE 완충액 제제용</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Thermofisher</td><td>R0581</td><td>RNA 관련 조작, RNase-free</td></tr><tr><td>PciI</td><td>NEB</td><td>R0655S</td><td>효소 분해</td></tr><tr><td>PCR 기계</td>용 <td>Any brand</td><td>N/A</td><td>PCR 증폭</td></tr><tr><td>PCR 스트립 튜브</td><td>모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>PCR의</td></tr><tr><td>경우 PCR 튜브</td><td>FEITONGKANG</td><td>blp-200</td><td>PCR</td></tr><tr><td>페트리 접시</td>의 <td>경우 모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>제브라피시 유충 사육용 등</td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>시그마</td><td>P0290</td><td>미세주입용, RNase-free</td></tr><tr><td>피펫 홀더</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-PH1</td><td>미세주입용</td></tr><tr><td>PrimeStar (Premix)</td><td>Takara</td><td>DR040A</td><td>분자 복제용</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck</td><td>539480</td><td>게놈 DNA 추출용</td></tr><tr><td>pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)</td><td>중국 제브라피시 자원 센터(CZRC)</td><td>CZP11</td><td>Cas9 플라스미드 템플릿</td></tr><tr><td>냉장 원심 분리기</td><td>모든 브랜드</td><td>N / A</td><td>RNA 관련 원심 분리</td></tr><tr><td>스케일</td><td>Sartorius</td><td>BCE124-1CCN</td><td>주조 주입 플레이트 및 아가 로즈 젤</td></tr><tr><td>가위</td><td>모든 브랜드</td><td>N / A</td><td>성인 물고기 꼬리 자르기 용</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sangon</td><td>A600485</td><td>용해 완충액 준비</td></tr><tr><td>작은 브러시</td><td>모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>미세주입판에서 부드럽게 움직이는 배아용</td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>Thermofisher</td><td>NanoDrop 2000</td><td>DNA/RNA 농도 측정용</td></tr><tr><td>스테이지 마이크로미터</td><td>모든 브랜드</td><td>DIV (Division) = 0.01 mm</td><td>1-nL 액적 정량화용</td></tr><tr><td>실체 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>유전자 발현 관찰용</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>관찰 및 미세 주입용</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express 대규모 RNA 생산 시스템</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>sgRNA의 체외 전사, RNase-free</td></tr><tr><td>온도 제어 인큐베이터</td><td>모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>배아 배양</td></tr><tr><td>TIDE</td><td>TIDE</td><td>https://tide.nki.nl/</td> <td>sgRNA 효율 분석용&nbsp;</td></tr><tr><td>트리카인 메탄 설포 네이</td>트 <td>시그마</td><td>A5040</td><td>트리카인 용액 제제</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A600194</td><td>트리카인 용액, 용해 완충액 및 TAE 완충 제</td></tr> 트립<tr><td>톤</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td>LB 플레이트 용</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>모든 브랜드</td><td>N / A</td><td>주사 바늘 절단 용</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td>효소 용 소화</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td>LB 플레이트용</td></tr><tr><td>제브라피쉬 수족관 시스템</td><td>ESEN</td><td>ESEN-AW-S1</td><td>성체 물고기 사육용</td></tr><tr><td>제브라피쉬 짝짓기 탱크(칸막이 포함)</td><td>모든 브랜드</td><td>N/A</td><td>물고기 짝짓기용</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900+Airyscan2</td><td>ZEISS</td><td>LSM900</td><td>형광 표지 물고기의 컨포칼 이미징 및 데이터 분석용</td></tr><tr><td>ZFIN 웹 사이트</td><td>ZFIN</td><td>http://zfin.org/</td> <td>유전자 정보를 찾으려면</td></tr></tbody></table>

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

커넥신(connexin)이라고 하는 고분자 단백질로 구성된 간극연접(gap junction)은 접촉 세포 간의 저분자량 대사 산물과 이온의 교환에 필수적입니다. 위에서 설명한 형광 단백질 태깅 방법을 사용하여 각각 커넥신 39.9 (그림 5A) 및 커넥신 44.1 (그림 5B)을 라벨링했습니다. 올바른 KI는 접합 PCR에 의해 검증되었습니다(그림 6). 발표된 데이터16에 따라 모든 F1 자손의 근육에서 유전 가능한 특정 형광이 관찰되었으며, 이는 커넥신 39.9 의 성공적인 GFP 라벨링을 나타냅니다(그림 5A). 이전 보고서와 일치하게17, 모든F2</...

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

fluorescence-labeling-to-visualize-low-expressed-proteins-in-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

이 프로토콜은 uncaged 플루오레신에서 신호를 증폭하기 위해 immunolabeling 전체 산 뒤에 갇힌 플루오레신의 UV - uncaging를 사용하여 셀 zebrafish의 배아의 작은 그룹의 운명을 라벨 및 추적하는 방법을 delineates.

레이저 Uncagable 플루오레신 Dextran과 Zebrafish 세포의 리니지 라벨

죽어가는 세포는 장벽의 기능을 중단하지 않고 인접 세포의 수축에 의해 공동 상피 조직에서 압출하고 있습니다. 개발 zebrafish의 광학 선명도는 상피 조직을 생활에 압출을 시각화하는 뛰어난 시스템을 제공합니다. 여기 우리는 세포 해상도에서 애벌레 zebrafish의 표피의 유도 및 이미지 압출하는 방법을 설명합니다.

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

개별 세포에 지시된 스트레스나 사멸을 일으키는 표적 조작은 상대적으로 수행하기가 어려웠습니다. 여기에서는 세포 배양 및 살아있는 동물에서 개별 세포에 선택적으로 스트레스를 가하고 죽이는 단일 세포 해상도 절제 접근법을 표준 컨포칼 UV 레이저를 기반으로 설명합니다.

기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

이 프로토콜은 초기 단계 제브라피시 배아의 저온 절에 대한 순차적 면역 형광 및 면역 히스토화학을 입증하여 특정 세포 집단에서 정확한 동국화 분석을 가능하게합니다.

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

학습하세요 제브라피시에서 형광 단백질 태그를 이용한 저발현 단백질 시각화 방법을. 이 프로토콜은 donor 구축 과정을 단순화하여 단백질 위치와 발현 연구에 활용할 수 있습니다.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

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