전처리된 종양 세포의 동종 공동 배양 환경에서의 인간 T 세포 활성 분석

종양 세포는 치료 중에 면역 표현형을 변화시켜 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 우리 연구의 목적은 T 세포와 종양 세포 사이의 상호 작용을 조사하여 이러한 상호 작용을 더 잘 이해하는 것입니다.

방사선 요법과 키나아제 억제제를 결합하여 특히 방사선 저항성 종양에서 방사선 민감도를 향상시킵니다. DNA 손상 반응을 표적으로 삼는 것은 현재 최근 개발의 핵심 부분입니다. 현재 방사선생물학 분야에서는 시험관 내 데이터와 생체 내 데이터 간의 비교 가능성을 높이기 위해 3차원 세포 배양 모델과 공동 배양 모델이 확립되고 있습니다.

[해설자] 시작하려면 적절한 부피의 D10 배지에서 HSC4 종양 세포를 얻습니다. 조건당 최소 3개의 웰을 시드하며, 각 웰은 96웰 플레이트의 200마이크로리터 배지에 15,000개의 세포를 포함합니다. 종양 세포 전용 및 T 세포 전용 대조군을 위한 웰과 공동 배양일에 각 처리에 대한 세포 계수용 웰을 포함하여 샘플 처리를 위해 하나의 플레이트를 지정합니다. 둘째 날에 필요한 농도의 키나아제 억제제로 종양 세포를 치료합니다. 3-4시간 후에 플레이트 1개를 조사하고 저분할 조사를 위해 배양 24시간 후에 5개의 회색으로 동일한 플레이트를 조사합니다. 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC 분리의 경우 건강한 기증자로부터 수집한 EDTA 혼합 혈액을 2개의 50밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 두 원심분리 튜브에 최대 50밀리리터의 PBS와 2% FBS를 채웁니다. 다음으로, PBMC 분리를 위해 플라스틱 인레이가 있는 6개의 원심분리 튜브를 준비합니다. 각각 15밀리리터의 저가운 밀도 구배 배지를 채웁니다. 밀도 구배 배지에 희석된 혈액 12-15밀리리터를 조심스럽게 오버레이합니다. 튜브를 1,200G에서 감속 없이 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 4개의 새로운 50밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 사용한 튜브는 폐기하십시오. 새 원심분리 튜브에 PBS 및 2% FBS를 최대 50밀리리터까지 채우고 실온에서 120G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 2% FBS를 함유한 PBS 1밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁하고 두 펠릿을 하나의 매 튜브에 결합합니다. 원심분리 튜브를 50 밀리리터까지 다시 2 % FBS를 함유 한 PBS로 채웁니다. PBMC를 300G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 세포 펠릿을 80마이크로리터의 MACS와 10당 완충액에 7개의 세포의 거듭제곱으로 재현탁합니다. 10개당 20마이크로리터의 CD8 마이크로비드를 세포 7개의 거듭제곱에 추가하고 위아래로 피펫팅하여 조심스럽게 혼합합니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 2밀리리터의 MACS와 10당 완충액을 7개의 세포의 거듭제곱으로 세포를 세척합니다. 튜브를 실온에서 10분 동안 300G에서 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 세포를 1000마이크로리터의 MACS와 완충액에 재현탁합니다. 자석에 두 개의 MS 컬럼을 놓고 그 아래에 두 개의 15밀리리터 원심분리 튜브를 놓습니다. 500마이크로리터의 MACS와 완충액으로 컬럼을 평형화합니다. 그런 다음 동일한 부피의 세포 현탁액을 준비된 MS 컬럼에 로드합니다. 500마이크로리터의 MACS와 완충액으로 컬럼을 3회 헹굽니다. 최종 수집된 세포를 통과 또는 CD8 음성으로 라벨을 붙이고 하나의 원심분리 튜브에 결합합니다. 그런 다음 CD8 양성 T 세포로 표지된 새로운 15밀리리터 원심분리 튜브를 사용합니다. 자기 표지된 CD8 양성 T 세포가 포함된 두 컬럼을 각각 1000마이크로리터의 MACS와 완충액으로 세척합니다. T 세포를 염색하기 전에 300G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 1000마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. 현탁액을 300G에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 세포 펠릿을 2000마이크로리터의 1마이크로몰 CFSE 염색 용액에 재현탁합니다. 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 염색된 세포를 300G에서 5분 동안 원심분리합니다. PBS로 세포를 세척한 후 T 세포 배지에 재현탁합니다. 세포를 CD3 및 CD28 코팅된 6웰 플레이트에 시드하고 배양합니다. 4일째에 T 세포를 수확하여 각각의 배지에 재현탁합니다. 지정된 웰을 계산한 후 원하는 수의 T 세포를 종양 세포 웰에 1:1의 비율로 추가합니다. 7일째에 T 세포 증식의 정량화를 위해 인큐베이터에서 배양 플레이트를 제거합니다. 세포를 세척한 후 원하는 항체로 염색하고 유세포 분석을 수행하여 T 세포를 평가합니다. 순방향 산란 면적 대 전방 산란 높이를 기준으로 이중항 모집단을 제외하여 일중항을 얻습니다. 단일항을 플로팅하여 전방 산란 영역과 측면 산란 영역을 기반으로 T 세포를 식별합니다. T 세포를 구별하기 위해 측면 산란 영역에 대해 CD3 발현을 플로팅합니다. 또한, 측면 산란 영역에 대해 CD8 신호를 플로팅한 후 CD8 양성 T 세포를 식별합니다. 모든 T 세포는 CD3 및 CD8을 발현해야 합니다. 모든 CD8 양성 T 세포의 CFSE 신호를 히스토그램으로 플로팅합니다. 게이팅 단계를 완료한 후, CD8 양성 T 세포를 입력으로 선택하고 측면 산란 영역에 대해 각각의 표면 마커 형광을 플로팅하여 CD25 또는 HLA-DR 이소형 발현을 분석합니다. 증식성 T 세포의 비율은 조사된 HSC4 종양 세포와 공동 배양했을 때 증가했습니다. 방사선 요법 또는 RT 및 RT와 ATR 억제는 RT와 ATM 억제에 비해 T 세포 증식을 유의하게 향상시켰습니다. 증식성이 높은 T 세포 중에서 RT와 ATR 억제가 증식 자극에 가장 효과적이었습니다. T 세포에서 CD25의 발현은 RT 처리된 HSC4 종양 세포와 공동 배양 후 하향 조절되었습니다. ATM 억제제 단독으로 종양 세포를 전처리하면 ATR 억제제에 비해 CD25 발현이 유의하게 감소했습니다. RT와 ATM 억제제의 조합은 RT와 ATR 억제제에 비해 CD25 발현을 증가시켰습니다. T 세포에서의 HLA-DR 발현은 일반적으로 RT에 의해 상향 조절되었습니다. RT와 ATR 억제제로 전처리된 HSC4 세포와의 공동 배양은 RT 단독 또는 RT와 ATM 억제제에 비해 HLA-DR 발현을 더욱 증가시켰습니다.