다양한 조직 미세환경에서 GPCR 매개 T 세포 국소화 연구를 위한 효율적인 레트로바이러스 형질도입 및 경쟁력 있는 호밍(Competitive Homing)

우리의 연구는 GPCR이 다양한 조직 미세 환경에서 면역 세포 트래피킹 및 위치 지정에 어떤 영향을 미치는지 탐구합니다. 이 프로토콜과 기타 보완 프로토콜을 사용하여 우리 연구실은 비장 점막 조직에서 장기 특이적 화학 유인 축을 확인했습니다. 이제 우리는 위, 폐, 기관 및 GU 관의 본거지인 림프구가 어떻게 존재하는지 알아냈습니다. 저는 개별 GPCR이 생체 내 T 세포 이동에 어떤 영향을 미치는지 테스트하는 효율적이고 개선된 방법을 제시하고 있습니다. 우리는 이러한 수용체를 T 세포에 도입하는 신뢰할 수 있는 방법을 개발했으며, 이제 경쟁 귀소 분석에서 직접 나란히 비교할 수 있습니다. 이제 GPCR이 생체 내에서 T 세포를 유도하는 방법을 알았으므로 연구자들은 수용체 발현을 면역 기능과 더 잘 연결할 수 있습니다. 이는 치료 연구뿐만 아니라 기초 면역학 연구자에게도 도움이 될 것입니다. 이 접근법을 통해 우리는 이제 덜 알려지거나 특성화되지 않은 GPCR이 T 세포를 특정 조직으로 안내하는 데 어떻게 관여하는지 물어볼 수 있습니다. 우리는 암이나 자가면역을 치료하기 위해 GPCR 신호 전달을 미세 조정할 수 있는 방법을 배울 수 있습니다. 우리는 T 세포가 치료 접근을 위해 적시에 적절한 장소에 도달하도록 도울 수 있습니다.

[해설자] 시작하려면 첫째 날에 멸균수에서 준비된 밀리리터당 50마이크로그램의 폴리-D-라이신 용액 5밀리리터로 10cm 조직 배양 플레이트를 코팅합니다. 플레이트를 실온에서 45분 동안 배양한 다음 칼슘과 마그네슘이 없는 멸균 PBS로 플레이트를 두 번 세척하여 잔류물이 남지 않도록 합니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 3분 동안 0.05% 트립신 2밀리리터와 0.5밀리몰 EDTA를 사용하여 Plat-E 세포를 분리합니다. 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 세포 생존율을 보장하려면 동일한 부피의 세포 현탁액을 트리판 블루 용액과 혼합합니다. 그런 다음 항생제가 없는 Plat-E 배지가 있는 10cm 조직 배양 페트리 접시에 300만 개의 살아있는 세포를 시드합니다. 2일째에 Plat-E 세포 배양의 배지를 6.5밀리리터의 환원 혈청 배지로 교체합니다. 제조업체의 지침에 따라 형질감염 혼합물을 준비합니다. 각 플레이트에 대해 45마이크로리터의 Lipofectamine 2000과 210마이크로리터의 환원 혈청 배지를, 15마이크로그램의 DNA와 235마이크로리터의 환원 혈청 배지를 다른 튜브에 혼합합니다. 3-4회 피펫팅하여 튜브의 내용물을 결합하고 실온에서 20분 동안 배양하여 복잡한 형성을 용이하게 합니다. 이제 혼합물을 플레이트에 적가하고 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양합니다. 다음으로, PBS 웰당 375마이크로리터에 항마우스 CD28 및 CD3로 T 세포 활성화를 위한 24웰 플레이트를 코팅합니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 배양하거나 섭씨 4도로 설정된 인큐베이터에서 3-4시간 동안 배양합니다. 3일째에 주사기 플런저를 사용하여 RPMI 배지가 들어 있는 6웰 플레이트에 놓인 100마이크로미터 나일론 메쉬 세포 여과기에서 분리된 마우스 비장을 부드럽게 으깨십시오. 40마이크로미터 나일론 메쉬 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 50밀리리터 원추형 튜브로 옮겨 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 용액을 섭씨 4도에서 5분 동안 450g으로 원심분리합니다. 그런 다음 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 세포를 세척합니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 마우스 T-세포 CD4 분리 키트를 사용하여 자기 음성 선택을 수행합니다. 세포 계수기를 사용하여 분리된 T-세포를 계산합니다. 1밀리리터의 RPMI 10 배지에서 웰당 1 내지 150만 개의 세포의 밀도로 코팅된 T-세포 활성화 웰에 T-세포를 플레이트합니다. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 가습 인큐베이터에서 24-48시간 동안 배양합니다. 4일째에 10cm 플레이트에서 약 12밀리리터의 바이러스 상청액을 원추형 튜브로 수집합니다. Plat-E 배양 플레이트의 배지를 항생제가 없는 Plat-E 배지 10밀리리터로 교체하여 다음날 두 번째 형질도입을 위해 더 많은 바이러스 상청액을 생성합니다. 수집된 바이러스 상청액을 여과하려면 0.45마이크로미터 주사기 필터에 통과시킵니다. 여과된 상청액에 폴리브렌 밀리리터당 8마이크로그램과 HEPES 완충액 1-100 희석액을 첨가합니다. 24웰 T-셀 플레이트를 950g에서 7분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 T 세포를 제거하지 않고 조심스럽게 상청액을 수집하고 저장합니다. 감염을 수행하려면 각 웰에 1밀리리터의 바이러스 상청액을 첨가하십시오. 접시를 플라스틱 랩으로 밀봉하고 접시를 섭씨 32도에서 4시간 동안 1,150g으로 회전시킵니다. 감염 후, 각 웰의 배지를 이전에 저장된 T 세포 상청액으로 조심스럽게 교체하십시오. 6일째에 플레이트에서 T 세포를 원추형 튜브와 원심분리기로 수집합니다. 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS로 펠릿을 세척합니다. 마우스 인터루킨-2 밀리리터당 130 단위와 마우스 인터루킨-7 밀리리터당 10나노그램을 포함하는 새로운 배양 플레이트로 세포를 옮깁니다. 최소 2일 동안 또는 주입에 필요한 세포 수에 따라 원하는 확장 수준에 도달할 때까지 세포를 배양합니다. 8일째에 섭씨 4도에서 5분 동안 450g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 15밀리리터 튜브에 5밀리리터의 히스토파크-1077을 추가합니다. 칼슘과 마그네슘을 함유한 PBS 5밀리리터에 T 세포 펠릿을 재현탁합니다. 원심분리기 튜브에 있는 5밀리리터의 Histopaque-1077 위에 세포 현탁액을 조심스럽게 겹겹이 쌓습니다. 샘플을 실온에서 20분 동안 400-500g으로 원심분리하여 원심분리기 파손 또는 가속도가 0으로 설정되도록 합니다. 원심분리 후 뚜렷한 세포층의 형성을 관찰하십시오. 피펫을 사용하여 원하는 세포가 포함된 계면 층을 조심스럽게 수집하여 다른 층과의 오염을 방지합니다. GPR25 형질도입된 T 세포는 스터퍼 형질도입 대조군에 비해 hCXCL17 및 mCXCL17로의 향상된 이동을 나타내어 기능적 수용체 발현을 검증했습니다. GPR25 형질도입 세포는 비뇨생식기, 위 및 기관과 같은 비장 점막 조직에 우선적으로 국한되었으며, 주사 후 7주에는 상당한 농축이 관찰되었지만 주사 후 1주에는 관찰되지 않았습니다. 단기 귀소 분석은 GPR25가 기관, 위, 혀, 담낭 및 자궁 점막과 같은 Cxcl17이 풍부한 기관에 우선적으로 집착하는 T 세포를 형질도입한 반면 Cxcl17 결핍 마우스에서는 축적되지 않는 것으로 나타났습니다. GPR25 형질도입 세포는 주로 기관지에 국한된 반면, 대조군 세포는 정맥 근처에서 더 자주 발견되었습니다.