Name: 두개골의 창문을 통해 네크로 텍스의 혈류의 2 광자 이미징을위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-25T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 배우세요 생쥐 신피질 혈류 역학을 2광자 현미경으로 실시간 이미징하는 방법을. 형광 덱스트란 염료와 두개골 창을 활용하여 뇌혈관을 시각화하고 뇌졸중 연구에 활용할 수 있습니다.

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형광 dextrans의 염료의 꼬리 정맥 주사 <ol><li> 이미지 대뇌 vasculature하기 위해 동물은 형광 색소를 정맥 주입해야합니다. dextran의 잔기가 뇌 혈액 장벽을 횡단하여 혈관 밖으로 누출에서 염료를 방지하기 때문에 우리는 dextran - 복합 염료를 사용합니다. </li><li> 마우스 (유도 4 %, 사출 중 1.5-2 %) isoflurane과 anesthetized 있습니다. </li><li> 꼬리는 70 % 알코올로 소독합니다. </li><li> 26 게이지 바늘로, 호수에 녹아있는 rhodamine dextran의 5 % V / V 솔루션의 75-100 μl는 꼬리의 축을 따라 꼬리 정맥을 통해 주입 도중입니다. </li><li> 염료는 약 2 시간 rhodamine의 염료를 사용하는 경우 분홍색으로 바뀔 것이다 소변에 배설 때까지 동물은 즉시 꼬리 정맥 주사 후 몇 군데있을 수 있습니다. </li></ol> 두 광자 현미경을 사용하여 혈액 흐름의 이미징 (몇 군데 선박의 수에 따라 총 소요 시간 30-60 분 세션 당) <ol><li> 형광 염료 dextran 사출 다음, 마우스 (유도 4 %, 영상에 대한 1-1.5 %) isoflurane과 anesthetized 있습니다. </li><li> 마우스는 단단히 동물 보온 온도 조절 난방 패드가 들어있는 현미경 단계에 티타늄 막대를 사용하여 첨부되어 있습니다. 일부 눈 연고는 눈을 촉촉한 유지에 적용됩니다. </li><li> 두개골 창의 커버 유리는 70 % 알코올로 세척합니다. </li><li> 창이 초점 평면에 평행하게 위치하고 4X 목표 아래보기의 분야에서 중심이다. </li><li> 디지털 카메라와 함께 뇌 표면 선박의 사진을하는 것이 좋습니다. 이 사진은 하루 하루에서 반복적으로 몇 군데 지역을 찾을 수 이미징 세션을 아래에있는 참조 이미지로 사용됩니다. </li><li> 4X 목적은 무대를 이동하지 않고 물이 침수 40X 목적으로 바뀝니다. 보기의 분야의 디지털 사진을 다시 촬영합니다. 무대 조작하는 사람의 좌표는 제로에 설정됩니다. </li><li> 우리는 이미지 수집 소프트웨어로 ScanImage를 사용합니다. 이것은 카렐 스보보다 (Pologruto 외., 2003)의 실험실에서 톰 Pologruto와 베르나르도 사바 티니에 의해 MatLab로 작성되었습니다. 레이저, 전원 측정기, 사진 배율 튜브, 증폭기 등 : 우리는 다음 다른 모든 장비 설정 </li><li> 몇 군데로 적합한 창의 면적은 간단히 최상의 영역을 찾기 위해 낮은 배율에서 스캔합니다. 일단 이들은 이미지가 촬영입니다 선택한 지역의 낮은 배율 스택을 확인하며, XY 좌표는 주석입니다. </li><li> 작은 혈관이나 모세 혈관의 혈액 흐름 역학을 기록하기 위해 우리의 관심 선박의 최소한 40 μm의 라인을 따라 스캔을 사용합니다. 이 싱글 &quot;소탕&quot;지속적인 일초가 작은 레이저 가능한 능력과 스캔의 좌표와 각도를 아래로 쓰기로 사용하시면됩니다. </li><li> 이미지 세션이 끝난 후, 동물의 그것은 마취에서 복구할 수 있습니다 따뜻한 실내로 이동합니다. </li></ol>

<ol><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Eng.+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).</li>
<li>Zhang, S., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+impact+of+cortical+microcirculation+on+synaptic+structure+and+sensory-evoked+hemodynamic+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo.</a> 5, (2007).</li>
<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).</li>
</ol>

대뇌 피질의 혈류 역학은 두 광자 현미경과 설치류 동물의 꼬리 정맥에 주입 이미징 형광 dextran의 염료에 의해 생체내에서 공부하실 수 있습니다. 이 비디오는 어떻게 유리 커버 두개골 윈도우 준비를 통해 마우스의 네크로 텍스의 이미지 혈류 역학에 대한 방법을 보여주었다.

<table><tbody><tr><td>Fluorescein isothiocyanate-dextran</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD500S</td><td>분자량 500,000</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate-dextran</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>분자량 ~70,000</td></tr></tbody></table>

두개골의 창문을 통해 네크로 텍스의 혈류의 2 광자 이미징을위한 방법

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

생활 설치류의 손상 두뇌에 이미지 대뇌 vasculature (모세 혈관에 대형 선박에서)와 기록 혈류 역학을하는 기능은 강력한 기술입니다. 두개골 창문을 통해 생체내에서 2 광자 현미경을 사용하여 정맥 주사 이미지를 형광 염료 수 있습니다. 이것은 혈액 흐름 측정을 얻기 위해 또한 이미지 외피 vasculature을 한을 허용합니다. 이 기술은 원래 데이비드 Kleinfeld 및 Winfried Denk에 의해 개발되었다. 방법은 neurodegenerative 장애로, 뇌 종양, 또는 정상적인 뇌 생리학에 뇌성 국소 빈혈 동안 또는 후에 혈류 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들면, 그것은 경색과 주변 적혈구 세포 속도 또는 유동적 방법 뇌졸중 원인은 혈액의 흐름 방향으로 교대와 변화 연구에 사용되고 있습니다. 여기서 우리는 꼬리 정맥에 주입 형광 염료를 사용하여 생활 생쥐의 네크로 텍스의 이미지 혈류 역학에 2 광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다.

대뇌 피질의 혈류 역학은 2 광자 현미경과 설치류 동물의 꼬리 정맥에 주입 이미징 형광 dextran의 염료에 의해 생체내에서 공부하실 수 있습니다. 이 비디오는 어떻게 유리 커버 두개골 윈도우 준비를 통해 마우스의 네크로 텍스의 이미지 혈류 역학을 보여줍니다.

살아있는 설치류의 온전한 뇌에서 (대혈관부터 모세혈관에 이르는) 뇌혈관을 영상화하고 혈류 역학을 기록할 수 있는 능력은 ...

살아있는 설치류의 온전한 뇌에서 뇌혈관을 영상화하고 혈류 역학을 기록하는 능력은 뇌허혈 또는 정상적인 뇌 생리학 연구에 적용될 수 있는 강력한 기술입니다. 본 영상에서는 꼬리 정맥에 주입된 형광 염료를 사용하여 살아있는 마우스의 신피질 내 혈류 역학을 영상화하기 위한 이광자 현미경 사용법을 시연하겠습니다. 이 기술은 원래 David Kleinfeld와 Winfred Dank에 의해 개발되었습니다.안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 신경과 Carlos Porter Cayo 연구실의 Ricardo Mota입니다. 이전 영상에서는 생체 내(in vivo) 만성 이미징 실험을 위한 두개창(cranial window) 이식 방법을 보여드렸습니다. 오늘은 두개창을 통해 대뇌 피질의 혈류 역학을 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다.이 표본 제작법은 이광자 레이저 현미경을 사용하여 뇌 심부를 이미지화할 수 있어 매우 유용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 뇌혈관을 이미지화하려면 동물에게 형광 염료를 정맥 주사해야 합니다.덱스트란 모이어티(dextran moiety)가 염료의 혈뇌장벽(blood-brain barrier) 통과 및 혈관 외부 누출을 방지하기 때문에 Dexter 결합 염료를 사용합니다. 마우스는 이소플루란(isoflurane)을 사용하여 마취하며, 도입 시에는 4%, 주입 중에는 1.5~2% 농도를 유지합니다. 그다음, 70% 알코올을 묻힌 솜으로 꼬리를 세 번 닦아 소독한 후, 26 gauge 바늘을 사용하여 생리식염수에 용해된 5% Rhodamine Dextran 용액 75~100 µL를 꼬리 정맥을 통해 주입합니다.꼬리 정맥 주사 직후부터 염료가 소변으로 배출될 때까지 꼬리 축의 중간 지점에서 동물을 이미징할 수 있으며, ERO domine 염료를 사용하는 경우 소변 색이 분홍색으로 변합니다. 형광 Dexter 염료 주사 후 약 2시간이 지나면, 마우스에 isof fluorine을 투여하여 마취시킵니다. 유도 시에는 4%, 이미징 시에는 1~1.5%를 사용합니다. 마우스는 티타늄 바를 사용하여 현미경 스테이지에 단단히 고정하며, 스테이지에는 동물의 체온을 유지하기 위한 온도 조절 가열 패드가 포함되어 있습니다.안구를 촉촉하게 유지하기 위해 안연고를 도포합니다. 두개창(cranial window)의 커버 글라스를 70% 알코올로 세척합니다. 윈도우를 초점 평면과 평행하게 배치하고 시야의 중심에 맞춥니다.4x 대물렌즈 하에서 디지털 카메라를 사용하여 뇌 표면 혈관의 사진을 촬영하는 것이 가장 좋습니다. 이 사진은 이후의 영상 촬영 세션에서 매일 동일한 영상 영역을 반복적으로 찾기 위한 참조 이미지로 사용됩니다. 그 다음 4x 대물렌즈를 수침식 40x 대물렌즈로 교체합니다.스테이지를 이동하지 않은 상태에서 시야의 디지털 이미지를 촬영합니다. 다시 스테이지 조작기의 좌표를 0으로 설정합니다. 이미지 획득 소프트웨어로는 scan image를 사용합니다.본 프로그램은 Carls Voto 연구실의 Tom Paul Rudo와 Bernardo Sabatini가 MATLAB으로 작성하였습니다. 다음으로 레이저, 파워 미터, 광전증배관, 증폭기 등 나머지 모든 장비를 켭니다. 이미지 촬영에 적합한 윈도우 영역을 저배율로 간단히 스캔하여 최적의 영역을 찾습니다.해당 영역들이 식별되면, 촬영할 선택 영역의 저배율 스택을 획득하고 XY 좌표를 기록하여 소혈관 또는 모세혈관의 혈류 역학을 기록합니다. 관심 혈관을 따라 최소 40 µm 구간에 대해 라인 스캔을 수행합니다. 1초 동안 지속되는 이러한 단일 스윕은 가능한 한 낮은 레이저 출력을 사용하여 수행하며, 스캔 좌표와 각도를 기록합니다.이미징 세션이 끝나면, 동물은 마취에서 회복할 수 있도록 온열 챔버로 이동됩니다. 여기서는 꼬리 정맥을 통해 r Domine dextran을 주입한 5개월령 마우스의 체성감각 피질 위에 설치된 두개창을 통해, 이광자 현미경으로 5 µm 간격으로 촬영한 100장의 이미지 스택을 보여줍니다. 이 일련의 이미지들은 모세혈관을 포함하여 크고 작은 혈관들의 복잡한 네트워크를 보여줍니다.지금까지 두개창을 통해 생체 내 혈류 역학을 시각화하는 방법을 살펴보았습니다. 이는 피질 혈관의 뇌혈류 역학을 이미징하는 매우 강력한 방법으로, 예를 들어 뇌졸중 후 혈류 변화를 조사하는 데 활용될 수 있습니다. 형광 염료를 꼬리 정맥에 반복적으로 주입함으로써 다양한 시간대의 BUL에서 여러 차례 이미징을 수행할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 가능한 한 가장 깨끗하고 멸균된 환경에서 작업하고, 손을 매우 안정적으로 유지하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마쳤습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오 및 프로토콜은 설치류에 유리 커버 두개골 창을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이러한 준비는 생체내 개월 시간 단위 동안 네크로 텍스의 2 광자 이미징에서 만성 사용할 수 있습니다. 그것은 광학 내장 신호 이미징을 포함한 이미징의 다른 유형에도 사용할 수 있습니다.

만성 뇌 영상에 대한 Craniotomy 외과 절차

이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을...

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

출처: Bisht, K., et al. 생쥐의 신경 면역 역학에 대한 반복적인 생체 내 이미징을 수행하기 위한 정밀한 뇌 매핑. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 두개골 임플란트가 있는 형질전환 마우스의 신경 면역 역학의 형광 이미징을 보여줍니다. 혈관 및 신경 안정성은 신경 활동에 대한 면역 반응을 반영하는 동적 미세아교세포 변화와 함께 이미지화됩니다.

두개골 임플란트를 사용한 신경 면역 역학의 형광 이미징

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

양국 주 somatosensory corticies (S1) Thy1에서 위의 듀얼 광 창을 통해 신경 활동을 측정 하기 위한 실험 절차 설명-GCaMP6s 유전자 변형 쥐 2 광자 (2 P) 현미경에서 vivo에서를 사용 하 여.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

우리는 현재 vivo에서 2 광자 영상 이미징 신생아 쥐의 대뇌 피 질에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 대뇌 피 질의 뉴런, 신경 역학 및 질병 모델에서 신경 역학에 변화를 제어 하는 분자 메커니즘의 발달 역학 분석에 적합 합니다.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

이 연구는 이광자 현미경을 사용하여 뉴런 발현 EGFP의 후속 생체 내 이미징을 위해 마우스에 반복적인 외상성 뇌 손상을 전달하고 두개골 창을 동시에 이식하는 방법을 보여줍니다.

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징)

우리는 마우스 모델에서 형광 표지된 산화철 나노입자를 교모세포종에 전달하는 종양 전달에 대한 이광자 현미경에 대한 새로운 접근 방식을 제시합니다.

쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

배우세요 생쥐 신피질 혈류 역학을 2광자 현미경으로 실시간 이미징하는 방법을. 형광 덱스트란 염료와 두개골 창을 활용하여 뇌혈관을 시각화하고 뇌졸중 연구에 활용할 수 있습니다.

두개골의 창문을 통해 네크로 텍스의 혈류의 2 광자 이미징을위한 방법

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