Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

우리는 복잡한 발달 질환의 제브라피시 모델을 생성하여 환자 시퀀싱과 기능 유전체학을 연결하여 변이 해석과 전임상 약물 시험을 지원합니다. FRET 센서가 개선되었음에도 불구하고, 충분한 시공간적 민감도를 가진 Ras-MAPK 신호의 미묘한 병원성 변화를 감지하는 강력한 생체 내 분석은 여전히 부족하다. 먼저, E3 배지에 몰딩된 2%아가로스를 포함한 맞춤형 미세인젝션 플레이트를 작업 플랫폼 위에 올려놓습니다.

수정된 십대 제브라피시 알을 접시 내 적절한 경로에 배치하여 미세 주입 시 난자의 움직임을 제한하세요. 마이크로로더 피펫을 사용해 2마이크로리터의 주입 물질을 바늘에 역적재합니다. 마이크로인젝션 장치의 바늘과 배아 품질에 따라 압력과 시간 설정을 조정하여 각 주사를 보정하세요.

이 용액을 청소년 제브라피시 배아의 단일 세포 단계에 주입하세요. 통제된 사육 조건 하에서 미세 주입 청소년 배아를 키우세요. 퇴산 후 3시간 이내에 흐릿하거나 퇴화된 알을 제거하세요.

수정 후 약 4시간 후, 표준 형광 입체 현미경을 사용해 465나노미터에서 500나노미터 파장 범위로 설정했습니다. 배아를 형광 기자 발현을 검사합니다. 청소년 양성 물고기는 FRET 영상 검사를 위해 선택하고, 음성 형제자매는 면역조직화학적 평가를 위해 예약하세요.

6웰 플레이트의 여러 웰에 같은 수의 배아 풀을 배치합니다. 치료를 시작하기 위해, 배아를 DMSO나 희석된 MEK를 포함한 E3 배지 3밀리리터에 원하는 농도로 담가세요. 먼저, 1.5%에서 2%의 저녹 아가로스 알리코트를 50도 섭씨의 온도에서 ThermoMixer에 녹입니다.

녹은 후에는 온도를 약 30도까지 낮춥니다. 35mm 유리 바닥 접시 중앙에 단일 주입된 청소년 양성 배아를 배치하여 실시간 영상을 촬영합니다. 과도한 E3 배지를 제거하고, 저녹는 아가로스 한 방울을 넣어 배아를 고정시킵니다.

아가로스가 실온에서 중합되도록 하세요. 획득 최소 1시간 전에 인큐베이터 컨트롤러를 켜고, 배아 건강을 유지하기 위해 온도를 28도로 설정하세요. 인큐베이터가 안정되면 배아가 담긴 영상 접시를 샘플 홀더에 올려놓고 10배 건식 대물렌즈로 샘플을 시각화합니다.

아르곤 이온 레이저를 켜고 레이저 출력을 50%로 조정하세요. 하드웨어 설정에서 이미지를 획득하려면 8비트 깊이 해상도를 선택하세요. 다음으로 획득 패널에서 스펙트럼 검출 xy, gamma, lambda, z 스캐닝 모드를 선택하고, 포맷 이미지를 512 x 512 픽셀, 스캔 속도 400 Hz, 광학 줌 0.75로 설정하세요. 아르곤 이온 레이저의 458나노미터 레이저 라인을 활성화하고 강도 값을 8.5%로 설정한 후 하이브리드 검출기를 선택하고 감도를 500으로 설정하세요.

검출기 바의 드롭다운 메뉴를 열어 청록색 형광 단백질 또는 ECFP 방출 곡선을 선택하세요. YPET 방출 곡선을 표시하려면 두 번째 검출기를 작동시킵니다. 그 다음 노란색 형광 단백질 YFP 방출 곡선을 선택하세요.

실시간 획득을 시작하려면, 검출 커서를 가장 강한 YFP 신호 범위에 위치시켜 샘플을 시각화합니다. Z-Stack LASX 창에서 샘플 두께의 시작과 종료 위치를 설정하세요. 감마 스캔 범위 특성을 460나노미터에서 시작해 검출 범위의 570나노미터에서 끝나도록 설정하세요.

검출 대역폭을 5나노미터로 정의하고, 스캔 스텝 크기를 5나노미터로 정의합니다. Z-스택 획득을 시작하세요. 구성 창에 있는 염료 데이터베이스에 CFP와 YFP용 두 개의 적응된 참조 방출 스펙트럼을 삽입 및 저장하여 스펙트럼 번짐을 배제합니다.

이미징 세션에서 생성된 스펙트럼 이미지 파일을 선택한 후 프로세스 창을 엽니다. 다음으로 염료 분리 도구에서 스펙트럼 염료 분리를 선택하고 염료 분리 설정을 설정하세요. 대화 창 왼쪽의 드롭다운 목록에서 첫 번째에 새로운 CFP 방출 스펙트럼을, 스펙트럼 데이터베이스에서 새로운 YFP 방출 스펙트럼을 선택하세요.

감마 스캔에서 가장 강한 신호 강도를 가진 이미지를 식별합니다. 그 다음 z-스캔을 따라 이동해 마진 존에서 관심 영역을 강조하는 광학 단면을 선택하세요. 동물 극의 경계 구역에서 ROI 선택 모드를 활성화하여 최적의 스펙트럼을 가진 영역을 정의합니다.

디스플레이 창에서 ROI 십자선을 클릭하고 측정 영역에서 기준 ROI 크기를 40 복셀로 조정하세요. 두 개의 분리된 채널이 포함된 새로 생성된 파일을 열어보세요. 최대 강도 투영을 사용하여 3차원 이미지 시리즈에서 2차원 투영 이미지를 생성합니다.

프로세스 창에서 크롭을 선택해 채널을 두 개의 별도 파일, 즉 채널 1과 채널 2로 분리합니다. 프로세스 창에서 이미지를 결합한 후 채널 2 파일을 선택한 후 첫 번째 옵션에 삽입하세요. 그 다음 채널 1 파일을 선택하고 두 번째 옵션에 삽입하세요.

5인수로 리스케일을 설정하고 비율 연산을 선택하세요. 적용을 클릭하여 비율 메트릭 이미지가 포함된 새 파일을 생성합니다. 파일 저장해 두어 데이터 분석용으로 하세요.

분석을 위해 스펙트럼 영상 및 염료 분리 이미지 파일을 오픈 소스 피지 소프트웨어로 가져오세요. Analyze and Set Measurements를 사용하여 피지에서 측정 값을 측정할 매개변수를 설정하세요. 관심 있는 매개변수로 면적, 통합 밀도, 평균 회색 값을 선택하세요.

툴바의 폴리곤 선택 도구를 사용해 가스트룰라의 경계에 해당하는 관심 영역을 선택하세요. 순서대로 분석, 도구, ROI 관리자를 클릭하여 ROI xy 사양을 저장하세요. 선택한 ROI에서 측정을 수행하려면 분석 및 측정을 클릭하세요.

각 ROI별 FRET를 CFP 비율 값으로 워크시트에 정리하고, 실험 그룹은 열, 원시 값은 행에 배치합니다. 단일 생물학적 복제의 경우, 각 그룹이 하나의 열로 정의되는 그룹 변수가 있는 열 테이블을 만듭니다. 원리 형성 마지막에는 PBS에서 20분간 상온에서 4% 파랄데히드에 담가 배아를 고정합니다.

고정 후에는 배아를 PBS로 여러 번 세척하세요. 파스터 피펫을 사용해 신선한 PBS가 포함된 12웰 플레이트의 단일 웰 내에서 배아를 옆으로 정렬합니다. 2.7배 배율 대물렌즈에 0.63배 주사 대물렌즈, 8.6 줌 팩터를 가진 입체 현미경을 사용해 밝시야 모드로 이미지를 포착하여 타원형의 존재를 평가합니다.

캡처한 배아 이미지를 피지 소프트웨어로 가져오세요. 배아의 축 길이를 측정하려면 툴바에서 직선 도구를 선택하고 분석(Analysis)을 클릭한 뒤 측정(Measure)을 클릭하세요. 선택한 측정을 수행한 후 ROI 관리자 목록에 추가하고 ROI 파일을 저장하세요.

데이터를 워크시트로 내보내세요. 장축 길이를 단축 길이로 나누어 축 비율을 계산합니다. 평균, 평균의 표준편차, 또는 서로 다른 복제의 평균의 표준오차를 계산하세요.

제브라피시 내 라이브 FRET 파이프라인은 병원성 ERK 신호 활성화를 조기에 민감하게 감지하여 변이 해석 지원과 MEK 억제제 효율 시험을 지원합니다.