생닭고기 및 바로 조리할 수 있는 닭고기 제품에서 살모넬라균 을 정량화하기 위해 수정된 가장 가능성 있는 숫자 분석

당사의 연구는 식품 매개 병원체에 대한 신속한 검출, 정량화 및 특성화 기술을 개발하며, 실제 환경에서 오염을 식별하여 식품 안전을 개선할 수 있는 민감한 방법에 중점을 둡니다. 주요 과제는 빠르고 민감한 감지와 저렴하면서도 확장 가능한 솔루션으로 복잡한 매트릭스를 달성하는 것입니다. 또한 오탐을 줄이고 다양한 테스트 환경과의 호환성을 개선하는 데 어려움을 해결합니다.

식품 안전을 위해 이는 다양한 식품 매트릭스에서 낮은 농도의 병원균을 정확하게 검출하는 것을 의미합니다. 당사의 프로토콜은 살모넬라균의 유병률 감지와 정량화 사이의 격차를 해결하여 식품의 오염 수준에 대한 결정론적 값을 제공합니다. 이 프로세스는 FSIS 프로토콜에 사용되는 검증된 분석을 통합하고 추가 병원체 및 식품 매트릭스를 수용할 수 있을 만큼 유연하기 때문에 중단을 최소화합니다.

시작하려면 지역 소매점의 신선 육류 부서에서 구입한 갈은 닭고기를 작업 플랫폼에 놓습니다. 고기를 25g 샘플로 무균 처리합니다. 지역 소매점의 냉동 식품 섹션에서 바로 조리할 수 있는 닭고기 제품을 구입하여 25g 샘플로 무균 처리합니다.

뇌 심장 주입 오거 플레이트에 줄무늬 살모넬라 엔테리카 혈청 Typhimurium ATCC 14028. 섭씨 37도에서 밤새 접시를 배양합니다. 다음 날, 뇌 심장 주입 육수 25ml에 갓 재배한 살모넬라균 한 군체를 접종합니다.

섭씨 37도에서 하룻밤 동안 100RPM으로 흔들면서 배양을 유산소 방식으로 성장시킵니다. 일련의 10배 희석을 준비하려면 0.5ml의 배양액을 4.5ml의 완충 펩타이드 물 또는 BPW로 옮기고 철저히 혼합합니다. 그런 다음 준비된 희석액에서 0.5mL를 후속 희석할 때마다 4.5mL의 BPW로 옮깁니다.

다음으로, 방사선 조사된 다진 닭고기 25g을 무균 상태로 멸균 위장 백에 옮깁니다. 시료에 원하는 농도의 배양 희석액 1ml를 접종합니다. 멸균 세포 살포기를 사용하여 닭 표면에 접종물을 부드럽게 고르게 펴고 1시간 동안 섭씨 4도에서 방치합니다.

방사선 조사된 갈은 닭 샘플과 살모넬라 배양을 1시간 동안 배양한 후 각 샘플에 225ml의 BPW를 추가하여 원하는 샘플 대 배지 비율을 얻습니다. 120초 동안 정상 속도로 stomacher를 사용하여 닭고기 샘플을 균질화합니다. 50ml 피펫을 사용하여 기공의 여과된 쪽에서 액체를 조심스럽게 제거하고 두 개의 멸균 원심분리기 병으로 나눕니다.

10, 10 분 동안 000 G에 표본을 분리기하고 상등액을 버리십시오. 멸균 주걱을 사용하여 세포 펠릿을 BPW 3ml에 재현탁합니다. 재현탁된 펠릿에 12ml의 BPW를 첨가하고 멸균 주걱으로 저어 완전히 혼합합니다.

두 원심분리기 병의 내용물을 하나의 병에 결합합니다. 3ml의 재현탁 샘플을 48개의 웰 블록 중 1번 컬럼의 각 웰에 추가하여 8개의 반복실험을 생성합니다. 8채널 피펫을 사용하여 1열에서 6열까지 일련의 10배 희석을 준비하려면 각 웰의 시료 0.3ml를 다음 열의 BPW 2.7ml에 첨가하여 철저한 혼합을 보장합니다.

섭씨 37도에서 100RPM으로 흔들면서 밤새 블록을 배양합니다. 다음 날, 다중 채널 피펫을 사용하여 각 희석액에서 7마이크로리터의 배양액을 4x6 그리드의 뇌 심장 주입 오거 플레이트에 플레이트합니다. 접시를 10분 동안 건조시킨 후 섭씨 37도에서 18-24시간 동안 배양합니다.

배양 후 오거 플레이트를 검사하여 하나 이상의 식민지를 양성으로, 성장하지 않은 것을 음성으로 표시합니다. 워크시트에 dilution 및 dilution factor의 수를 입력합니다. 샘플의 적절한 부피 또는 무게를 입력합니다.

그런 다음 반복 횟수를 지정하고 양성 판정을 받은 샘플 수를 입력합니다. 결과 계산을 클릭하여 간단한 최대 확률 해결 방법을 사용하여 주석이 추가된 긍정 및 부정 결과를 분석합니다. 먼저 닭 샘플이 접종된 살모넬라 배양을 위해 48웰 MPN 블록을 설정합니다.

48웰 블록에서 위아래로 여러 번 피펫팅하여 배양물을 혼합합니다. 각 배양액 200마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트로 옮깁니다. 플레이트와 원심분리기를 6, 600G에서 10분 동안 밀봉합니다.

상층액을 제거하고 DNA 추출 키트 시약 20마이크로리터를 펠릿에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 혼합합니다. 다시 접시를 밀봉하고 섭씨 99도에서 10분 동안 가열한 다음 섭씨 20도까지 냉각합니다.

원심분리 후 2마이크로리터의 상등액을 사용하여 확립된 프로토콜에 따라 QPCR 혼합물을 준비합니다. 다음 조건을 사용하여 Real-Time PCR을 수행합니다. PCR 후 결과를 내보내고 주기 임계값이 30 이하인 웰을 양수로, 30보다 큰 웰을 음수로 간주합니다.

48웰 블록에서 위아래로 여러 번 피펫팅하여 배양물을 혼합합니다. 각 시료 20마이크로리터를 lysis tube에서 제공하는 분자 검출 분석 살모넬라 키트로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 100도에서 15분 동안 가열합니다.

그런 다음 실온에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 각 용해 튜브에서 20마이크로리터의 용해물을 시약 튜브로 옮기고 시약 튜브를 홀더에 로드합니다. 시약 튜브가 있는 홀더를 분자 검출 시스템 기기에 추가합니다.

분자 검출 시스템 분석을 위한 소프트웨어 설정을 구성합니다. 분석을 실행하고 분석을 위해 보고서를 내보냅니다. MDS 실행 보고서는 양수 또는 음수 중 자세한 출력 정보를 제공합니다.