Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System을 사용한 자동화된 High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking

이 연구는 미생물 분리, 배양 및 단클론 스크리닝을 강화하기 위해 자동 플랫폼을 사용하여 미생물 배양 오믹스를 탐구합니다. 목표는 인간의 장, 마이크로바이옴 및 그 응용 분야에 대한 이해를 향상시키는 것입니다. 마이크로바이옴 연구를 발전시키는 과학자들에게는 미세유체역학 방울, 자동 균주 분리 및 스크리닝 플랫폼, 머신 러닝 알고리즘, 고변형 배양 오믹스 및 마이크로바이옴 분석을 위한 단클론 디스펜서 등이 있습니다.

중간 세포 시스템은 microview, monoclonal isolation 및 coloration을 크게 향상시켜 기존 방법에 비해 거의 두 배의 클론을 생성함으로써 gut microview 배양 믹스의 연구 능력을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 저비용, 고지원, 고지원 미생물 스크리닝 플랫폼의 필요성을 해결하여 배양 혼합 연구를 위한 효율성 및 점수 능력에 대한 기존 방법의 한계를 극복합니다. 우리 연구실은 기술 응용 범위를 확장하기 위해 액적 분할 및 병합과 같은 추가 액적 조작 기술의 통합에 더욱 중점을 둘 것입니다.

시작하려면 MISS 세포의 액적 발생 및 배양실 문을 엽니다. 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩의 보호 커버를 수직으로 제거합니다. 일회용 주사기를 사용하여 챔버 내부의 가습기에 멸균 증류수 10ml를 넣고 보호 덮개를 다시 설치하십시오.

마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩의 멸균 포장을 열고 배양실 바로 위에 수직으로 놓습니다. 그런 다음 소프트웨어 인터페이스에서 설치를 클릭합니다. 확인 팝업 창이 나타나면 예를 클릭하여 설치를 시작합니다.

기포 제거제를 꺼내 챔버의 기포 제거제 위치에 거꾸로 고정합니다. 기포 제거기의 액적 배출 튜브를 그 아래의 클램핑 밸브에 부착합니다. 비말 감지 및 수집 챔버로 이어지는 전체를 안내합니다.

챔버의 도어를 연 후 감지 튜브를 감지 소켓에 수직으로 삽입합니다. 감지 튜브가 완전히 삽입되었는지 확인하십시오. 감지 튜브를 고정하는 나사를 시계 방향으로 조입니다.

완전 삽입 및 고정을 확인한 후 챔버의 문을 닫습니다. L1에서 L10까지 레이블이 지정된 미세유체 칩의 10개의 실리콘 튜브를 각각 해당 번호가 매겨진 클램프 밸브에 연결합니다. 그런 다음 적절한 연결에 따라 미세유체 칩의 퀵 커넥터를 오믹 시스템의 해당 포트에 연결합니다.

칩 설치가 완료되면 droplet tubing clamping valve is opened라는 메시지와 함께 팝업 창이 나타납니다. Micro Tubing 및 액적 생성 칩 설치가 완료되면 OK를 클릭합니다. 모든 튜브가 해당 클램프 밸브에 올바르게 부착되었는지 확인한 후 확인을 클릭합니다.

초기화를 수행하기 전에 설정 인터페이스를 클릭하여 선택 모드, 배양 온도, 배양 시간, 교반기 속도, OD 검출 파장, 형광 검출을 위한 여기 및 방출 파장과 같은 관련 매개변수를 구성합니다. 홈 인터페이스로 이동하여 초기화를 클릭합니다. 확인 팝업 창이 나타나면 예를 클릭하여 IC 시스템이 분사 펌프, 온도 설정, 폐액 배출 테스트, 스크리닝 모듈 및 액적 감지 모듈을 포함한 구성 요소에 대한 자체 점검을 수행할 수 있도록 합니다.

초기화가 완료되면 팝업 창에서 확인을 클릭합니다. 샘플을 준비하려면 미생물 샘플을 채취하고 해당 배지로 연속 희석을 수행하여 밀리리터당 약 50 세포의 농도를 달성하여 40 밀리리터 샘플 현탁액을 얻습니다. 그런 다음 샘플 병의 캡을 풀고 자기 교반 막대를 사용하여 희석된 배설물 현탁액을 샘플 추가 위치까지 병에 붓습니다.

캡을 조이고 단단히 조입니다. 그런 다음 퀵 커넥터 A를 퀵 커넥터 B에 삽입하여 샘플 로딩 프로세스를 완료합니다. 샘플 병을 지정된 위치에 놓은 후 샘플 병에서 퀵 커넥터 A와 B를 분리합니다.

샘플 병의 퀵 커넥터 A를 오믹 시스템의 O3 포트에 연결합니다. 미세유체 칩의 C3 커넥터를 퀵 커넥터 B에 연결하고 챔버의 도어를 닫습니다. 소프트웨어의 홈 인터페이스에서 생성할 액적 튜빙의 원하는 수를 선택하고 produce를 클릭하여 단일 세포 액적 생성을 시작합니다.

드롭릿 생성이 완료되었음을 나타내는 팝업 창을 기다렸다가 확인을 클릭합니다. 3개의 커넥터에 클램프를 닫고 샘플 병을 제거합니다. 소프트웨어의 홈 인터페이스에서 액적 생성 중에 사용된 것과 동일한 액적 튜빙 번호를 선택합니다.

클릭 문화권을 클릭합니다. 재배 시간과 온도를 확인하고 과정을 시작하십시오. 액적 배양이 완료되었음을 나타내는 팝업 창을 기다립니다.

오믹스 시스템의 UV 버튼을 눌러 자외선을 켭니다. 비말 감지 및 수집 챔버를 끄기 전에 30분 동안 조사합니다. 매우 깨끗한 벤치에서 액적 포집에 사용되는 96개의 웰 플레이트를 모두 열고 뚜껑 없이 서로 겹쳐 쌓고 아래에서 위로 순차적으로 번호를 매깁니다.

상단 웰 플레이트가 뚜껑으로 덮여 있는지 확인하십시오. 액적 감지 및 수집 챔버의 도어를 열고 웰 플레이트를 지정된 위치에 놓습니다. 상단 웰 플레이트에서 뚜껑을 제거한 다음 챔버 도어를 닫습니다.

오믹 시스템의 UV 광선을 다시 30분 동안 켜서 2차 살균을 수행합니다. 그런 다음 배치 위치에서 기포 제거제를 제거합니다. 캡의 나사를 풀고 캡에서 나비 모양의 나사를 제거합니다.

기포 제거제에 기포 제거 오일 200ml를 붓습니다. 캡을 단단히 고정한 다음 기포 제거제를 지정된 위치에 거꾸로 고정합니다. 홈 인터페이스에서 정렬할 액적 튜브를 선택합니다.

정렬을 클릭합니다. 수집할 웰 플레이트의 수를 입력하고 분류 프로세스를 시작합니다. 액적 광학 밀도 또는 형광 값을 실시간으로 측정하기 위해 공정 표시 영역을 관찰합니다.

약 20-30개의 액적을 분석하여 OD 값을 확인합니다. 대부분의 액적의 OD가 약 0.2인 경우 낮은 OD 임계값을 0.5로 설정하고 상위 OD 임계값을 4로 설정합니다. 이 시스템은 이 범위 내의 액적을 자동으로 96개의 웰 플레이트로 수집합니다.

Droplet Sorting and Collection(방울 분류 및 수집)이 완료되었음을 나타내는 팝업 창을 기다린 후 OK(확인)를 클릭합니다. 비말 감지 및 수집 챔버의 문을 엽니다. 웰 플레이트 뚜껑을 상단 웰 플레이트에 놓고 플레이트를 함께 제거합니다.

Export data(데이터 내보내기)를 클릭하여 수집된 액적 신호 데이터를 저장합니다. 히트 맵을 클릭합니다. 액적 수집 데이터 선택 file 마이크로플레이트 형식으로 표시된 OD를 관찰합니다.

이러한 OD 값을 히트 맵으로 시각화하여 색상 강도가 웰 전체의 OD 분포에 해당하여 명확하고 직관적인 표현을 제공합니다. 오믹 시스템(omic system)에서 얻은 인간 장내 미생물총(human gut microbiota)의 종 다양성, 고체판 방법(solid plate method) 및 초기 대변 샘플은 가족 수준에서 비교되었습니다. 34개의 미생물 패밀리는 Solid Plate Method와 Proven Omics Method 모두에 의해 강화되었으며, OMIC 시스템은 4개의 패밀리를 추가로 강화했습니다.

오믹스 시스템은 또한 풍요가 낮은 가족 중 일부를 효과적으로 풍요롭게 했습니다. 속 수준에서는 두 방법 모두 74개의 미생물 속을 풍부하게 한 반면, MISS 세포 방법은 13개의 속을 추가로 강화했습니다. 더욱이, 초기에 낮은 농도로 존재했던 두 개의 속(屬)은 OMIC 시스템을 사용하여 효과적으로 농축되었습니다.

이러한 결과는 MISS 세포 배양 방법이 원래 미생물 현탁액에서 낮은 비율로 존재하거나 성장 성능이 좋지 않은 균주에 대해 더 나은 성장 조건을 제공한다는 것을 보여주었습니다.