방사선 민감성 및 방사선 저항성 유전자 공개를 위한 게놈 와이드 CRISPR 스크리닝

이 연구는 게놈 전체 CRISPR 스크리닝 및 방사선 요법에 중점을 둡니다. 조사 후 폐암 세포에서 게놈 전체 CRISPR 스크리닝을 사용하여 방사선 민감성 및 방사선 내성 유전자를 볼 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 현재 실험 과제에는 게놈의 방대한 복잡성과 기본 메커니즘 탐색의 잠재적인 어려움으로 인해 발생하는 표적 이탈 효과가 포함됩니다. CRISPR은 기존 스크리닝 방법에 비해 영구적인 유전자 변형을 달성하고 뛰어난 정밀도를 보여주므로 기능적 게놈 연구 및 표적 발견에 특히 유용합니다. 앞으로 우리 팀은 이 연구가 남긴 문제를 해결하기 위해 생체 내 CRISPR 스크린 연구에 집중할 것이며 CRISPR 기술을 최적화하기 위해 최선을 다할 것입니다.

[해설자] 시작하려면 부착 세포 밀도를 밀리리터당 5개 세포의 5곱 10으로 조정합니다. 피펫을 사용하여 서로 다른 선량으로 방사선 치료를 위해 세포 현탁액 2밀리리터를 각 3.5센티미터 배양 접시에 분배합니다. 접시를 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 넣고 이산화탄소 5%를 넣고 밤새 배양합니다. 마커를 사용하여 각 3.5cm 배양 접시에 1에서 5까지 번호를 매깁니다. 방사선원을 사용하여 접시 2개에서 5개까지 각각 2, 4, 6 및 8회색의 방사선량을 투여합니다. 조사된 세포 밀도를 밀리리터당 5세포의 10배로 조정합니다. 웰당 10마이크로리터, 즉 100마이크로리터당 1000개의 세포를 방사선량당 3회 반복하는 6웰 플레이트에 시드합니다. 그런 다음 100마이크로리터당 3000개의 세포에 해당하는 웰당 30마이크로리터를 방사선량당 5회 반복하는 96웰 플레이트에 시드합니다. 이제 CCK-8 시약과 FBS가 없는 RPMI 1640 배지를 1:9 비율로 혼합합니다. 혼합물을 96웰 플레이트에 넣고 플레이트를 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 감염 과정을 시작하려면 렌티바이러스에 대한 대수 농도 구배를 밀리리터당 0에서 800 단위까지 설정합니다. 접시당 2마이크로리터의 폴리브렌에 해당 부피의 렌티바이러스를 첨가하고 실온에서 5분 동안 평형을 유지합니다. 렌티바이러스 폴리브렌 혼합물을 각 웰에 천천히 떨어뜨립니다. 부모 세포 밀도를 밀리리터당 5개 세포의 거듭제곱으로 10의 3배로 조정하고 12웰 플레이트의 각 웰에 1밀리리터를 접종합니다. 우물에 농도 구배로 퓨로마이신을 첨가합니다. 감염 72시간 후, 각 웰의 배지를 세포 사멸을 위한 최소 퓨로마이신 농도를 포함하는 완전 배지로 교체합니다. 생존 세포를 기반으로 각 웰에 대한 감염 다중도를 계산합니다. 부착 세포 밀도를 밀리리터당 7개 세포의 10배로 조정합니다. 0.3에 해당하는 감염 다수로 렌티바이러스를 폴리브렌 접시당 30마이크로리터에 넣고 실온에서 5분 동안 평형을 유지합니다. 렌티바이러스와 폴리브렌 혼합물을 15cm 배양 접시에 천천히 떨어뜨립니다. 잘 섞어 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 밤새 배양합니다. 감염 후 2일째에 배양 접시에서 배지를 흡인하고 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 완전 배지 15밀리리터로 교체합니다. 감염되지 않은 부모 세포에 대해 음성 대조군과 동일한 처리를 반복하고 72시간 동안 배양을 계속합니다. 이제 0.25% 트립신을 사용하여 15cm 배양 접시 하나에서 세포를 소화합니다. 10% PBS가 포함된 RPMI 1640 완전 배지에 세포를 재현탁하고 세포 수를 계산합니다. 0일째 게놈 DNA를 추출한 후 NanoDrop UV 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도와 순도를 측정합니다. 치료군의 세포에 적절한 선량의 방사선을 투여하고 대조군 세포는 처리하지 않은 상태로 두어 정상적으로 증식합니다. 치료 14일 후, 0.25% 트립신을 사용하여 치료군 세포와 대조군 세포를 모두 소화합니다. 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 완전 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포를 300G에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다. 펠릿을 PBS 1밀리리터에 재현탁합니다. 원심분리 단계를 반복한 후, 펠릿에서 14일째 게놈 DNA를 추출하고 DNA 농도를 결정합니다. 다음으로 필요한 프라이머를 준비하고 10마이크로몰로 희석합니다. 20마이크로리터 반응 시스템을 설정하기 위해 구성 요소를 추가한 후 튜브를 300G에서 5초 동안 잠시 원심분리합니다. 아가로스 겔 전기영동의 경우 겔을 준비하고 빗을 제거한 다음 전기영동 탱크에 겔을 덮을 수 있는 충분한 완충액을 채웁니다. DNA 샘플에 로딩 완충액을 첨가하고 잘 혼합합니다. 마지막으로, 혼합물을 우물에 로드하고 전기영동을 시작합니다. 14일 후에 콜로니 형성을 시작한 결과, 2개의 그레이 방사선에 노출되면 0개의 그레이에 비해 생존한 콜로니의 수가 크게 감소한 것으로 나타났습니다. CCKA 분석은 더 높은 방사선량에서 더 감소하는 2 Gray에서 세포 생존력이 크게 감소하는 것으로 나타났습니다. 72시간 동안 퓨로마이신 농도를 증가시켜 처리한 결과, 1마이크로몰이 A549 세포를 제거하는 데 필요한 최소 농도임을 보여주었습니다. PCR 검증은 231개의 염기쌍에서 뚜렷한 밴드를 보여 CRISPR 라이브러리에서 sgRNA 서열의 예상 길이를 확인했습니다. 시퀀싱 분석 결과 판독값의 약 60%가 참조 게놈에 성공적으로 매핑된 것으로 나타났습니다. sgRNA 판독 횟수는 푸아송 분포를 따랐으며, 이는 게놈 규모 스크리닝에 대한 이론적 기대치와 일치했습니다. PCA 및 히트 맵 분석은 높은 그룹 간 변동성과 낮은 그룹 간 변동성을 보여 실험적 일관성을 검증했습니다. 유전자 온톨로지 분석은 DNA 손상 반응이 상위 15개 결과 중 가장 풍부한 경로로 확인되었습니다.