2008년 2월 15일
이 비디오 및 프로토콜은 설치류에 유리 커버 두개골 창을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이러한 준비는 생체내 개월 시간 단위 동안 네크로 텍스의 2 광자 이미징에서 만성 사용할 수 있습니다. 그것은 광학 내장 신호 이미징을 포함한 이미징의 다른 유형에도 사용할 수 있습니다.
이미징 기술은 뇌 기능 연구에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 그 중 두 개의 광자 레이저 현미경은 살아있는 anta 뇌를 연구하고 적절한 준비를 할 수 있기 때문에 매우 유용한 방법으로 부상했습니다. 이 기술을 사용하면 동일한 피질 영역을 몇 분에서 몇 달까지 만성적으로 관찰할 수 있습니다.
이 비디오에서는 두 개의 사진 현미경을 사용하여 뇌의 만성 생체 내 이미징을 준비하는 방법을 보여줍니다. Janelia Farm의 Howard Hughes Medical Institute 연구원인 Carl Voda 박사는 오늘 시연할 두개골 창 준비를 처음 개척했습니다. 안녕하세요 그리고 Ricardo는 로스 앤젤레스 캘리포니아 대학교 신경학과의 Carlos Porter Cayo 실험실에서 나와야합니다.
오늘 우리는 만성 생체 내 이미징을 위한 두개골 창을 만드는 절차를 보여 드리겠습니다. 이 제제는 광자 레이저 현미경을 사용하여 뇌 내부 깊숙한 곳에서 이미지를 얻을 수 있기 때문에 매우 유용합니다. 이제 시작하겠습니다.
수술을 시작하기 전에 생쥐는 불소로 마취됩니다. 유도의 경우 4%, 수술의 경우 1점 반에서 2%, I-A-C-U-C 승인 절차를 사용하여 동물이 완전히 진정되었는지 확인하기 위해 꼬리 및/또는 발가락 꼬집음을 사용하는 것이 중요합니다. 설치류 트리머를 사용하여 목 뒤에서 눈가까지의 수염을 면도합니다.
면도 후 마우스를 입체 프레임에 놓고 섭씨 37도에서 이어바를 사용하여 머리를 단단히 고정합니다. 그런 다음 동물의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 눈 연고를 바릅니다. 다음으로, 덱사메타손(kg당 0.2mg)과 카프로펜(kg당 5mg)을 피하로 투여합니다.
뇌의 부종 및 또는 염증 반응을 각각 예방하기 위해. 수술을 시작하기 전에 70% 알코올과 베타딘을 번갈아 가며 3개의 면봉으로 피부를 닦아 수술 부위를 소독해야 합니다. 모든 수술 기구는 에탄올이 분사된 가위를 사용하여 유리 구슬 살균기를 사용하여 사전 멸균되었습니다.
두개골 위쪽의 피부를 제거하는데, 머리 아랫부분을 따라 수평으로 자른 것부터 시작해서 눈꺼풀까지 거의 닿을 정도로 복부 방향으로 두 번 자릅니다. 그런 다음 정중선에서 수렴하는 두 개의 비스듬한 절단부. 이 시점에서 리도카인과 에피네프린 용액을 골막에 한 방울 떨어뜨려 과도한 출혈이나 통증을 피하고 메스로 골막을 두개골 가장자리로 후퇴시킵니다.
목 뒤쪽의 근육 조직도 가볍게 수축되어 있습니다. 그런 다음 두개골의 노출된 전체 부분을 메스로 부드럽게 긁어 건조한 표면을 만듭니다. 이것은 나중에 적용할 때 접착제가 더 잘 접착될 수 있도록 하기 때문에 매우 중요합니다.
이미징 사이트가 선택되면 먼저 두개골 창을 만들 준비가 된 것입니다. 직경 약 4mm의 원이 공압 치과 드릴로 부드럽게 그려집니다. 약간의 드릴링 후 리도카인 에피네프린 용액을 두개골 표면에 다시 도포합니다.
드릴링은 매우 얇은 뼈 층, 일반적으로 하나의 코가 남을 때 중단됩니다. 이 단계는 개두술의 중앙을 부드럽게 눌러 식염수 한 방울 아래에서 어떻게 무너지는지 느끼고 뼈 섬유주를 이용함으로써 도달합니다. 뼈의 해면질 구조.
개두술은 매우 얇은 팁 집게로 두개골에서 들어 올려집니다. 식염수는 두개골을 들어 올리고 경막의 출혈을 예방하는 데 도움이 되기 때문에 중요합니다. 다음으로, 이전에 식염수에 담근 젤 폼을 경막 물질에 도포하여 두개골을 제거할 때 때때로 발생하는 작은 출혈을 멈춥니다.
경막 물질 표면을 건조시키고 출혈이 없는지 확인한 후, 멸균 5mm 유리 커버 슬립을 경막 물질 위에 부드럽게 놓습니다. 시아노아크릴레이트 기반 접착제 한 방울을 두개골의 반대쪽 반구에 바릅니다. 바늘의 도움으로 접착제를 유리 아래에 두지 않도록주의하면서 창문 주위에 부드럽게 도포합니다.
이제 접착제를 두개골 표면 전체에 얇은 층으로 바를 수 있습니다. 접착제가 마르면 치과용 아크릴을 혼합하여 두개골 표면 전체에 바르고 커버 슬립의 작은 테두리도 덮어 고정합니다. 커버 슬립을 고정한 후 치과용 아크릴로 창 주위에 작은 우물을 만듭니다.
티타늄 바는 또한 치과용 아크릴에 내장되어 있습니다. 이 막대는 나중에 마우스를 현미경의 스테이지에 단단히 부착하는 데 사용됩니다. 이미징의 경우 막대가 두개골 창과 평행이 되도록 수평을 유지하는 것이 중요합니다.
바 아래에 종이 한 장을 놓으면 아크릴이 굳어지는 동안 바가 수평을 유지할 수 있으며, 치과 용 아크릴은 10 분 동안 경화 또는 경화 될 수 있으며, 이때 티타늄 바가 제자리에 고정됩니다. 그런 다음 동물이 회복될 때까지 따뜻한 우리에 넣습니다. 마취에서 회복 된 후 동물은 같은 날에 이미지화 할 수 있습니다.
이 동영상은 3개월 된 GFPM 마우스의 체감각 피질 위에 놓인 두개골 창을 통해 맞춤형 빌드 2광자 현미경으로 5미크론 간격으로 촬영한 160개의 이미지 스택을 보여줍니다. 이 형질전환 마우스 계통은 parmal neuron의 작은 하위 집합에서 GFP를 발현합니다. 레이어 5와 레이어 2 3에서 이미지는 910 나노미터의 여기 파장을 사용하여 0.8 개구수의 40 x 침수 대물렌즈로 촬영되었습니다.
더 피상적 인 이미지에서는 parametal cell의 정점 수상돌기의 수지상 arbors를 쉽게 인식 할 수 있습니다. 각 뉴런의 수상돌기의 정점 다발은 하나의 큰 정점 수상석으로 수렴합니다. 더 작은 비스듬한 수상돌기도 이 주요 정점 수상돌기
축삭돌기에서 나오는 것을 볼 수 있습니다.이것은 더 높은 배율에서 동일한 40 x 대물렌즈를 사용하여 1.5 미크론마다 12개의 이미지 스택이며, 표면 수상돌기는 개별 수지상 가시를 분해할 수 있을 만큼 충분히 고해상도로 표시됩니다. 우리는 방금 사진 현미경을 사용하여 뇌의 만성 이미징을 위한 두개골 창 준비를 수행하는 방법을 보여 드렸습니다. 이것은 살아있는 뇌의 구조와 기능을 하나의 상상뿐만 아니라 몇 달에 걸친 여러 상상을 통해 연대순으로 연구할 수 있기 때문에 뇌 연구를 위한 매우 강력한 방법입니다.
두개골 창 준비의 또 다른 장점은 넓은 시야를 이미지화할 수 있다는 것인데, 이를 통해 전체 동작이나 인리 아버와 같은 대형 구조물을 밀리미터 단위에 걸쳐 이미지화할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 가능한 가장 깨끗하고 멸균된 조건에서 작업하고 매우 안정적인 손을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 좋아요, 그게 다입니다.
시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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이 비디오는 설치류에서 뇌를 덮은 유리로 된 두개골 창의 이식을 시연하여, 장기간에 걸친 신피질의 만성 생체 내 이광자 이미징을 가능하게 합니다. 이 기술은 뇌 기능을 관찰하는 데 매우 중요하며 다양한 이미징 방법에 적용될 수 있습니다.
Chronic in vivo imaging enables longitudinal assessment of target engagement and pathway modulation in disease-relevant systems, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides predictive confidence by linking structural and functional readouts over time, informing go/no-go decisions in target validation and lead identification workflows. The method enhances translational continuity from discovery through preclinical stages by establishing reproducible, quantitative outputs for portfolio triage.
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical work by providing chronic, quantitative imaging outputs that support hypothesis testing and pathway clarification.