Name: 살아있는 세포의 지질 교환 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 배우세요 살아있는 세포에서 사이클로덱스트린을 이용한 지질 교환 방법으로 수용체 티로신 키나아제와 막 단백질의 상호작용을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 막 역학 및 세포 신호전달 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%2C+detergent-resistant+membranes%2C+and+raft+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals.</a> Physiology. 21, 430-439 (2006).</li>
<li>Schroeder, R., London, E., Brown, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+saturated+acyl+chains+confer+detergent+resistance+on+lipids+and+glycosylphosphatidylinositol+%28GPI%29-anchored+proteins%3A+GPI-anchored+proteins+in+liposomes+and+cells+show+similar+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).</li>
<li>Suresh, P., Miller, W. T., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+exchange+shows+insulin+receptor+activity+is+supported+by+both+the+propensity+to+form+wide+bilayers+and+ordered+raft+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains.</a> J Biol Chem. 297 (3), 101010(2021).</li>
<li>Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol+structure+dependence+of+insulin+receptor+and+insulin-like+growth+factor+1+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).</li>
<li>Zidovetzki, R., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cyclodextrins+to+manipulate+plasma+membrane+cholesterol+content%3A+evidence%2C+misconceptions+and+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies.</a> Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).</li>
<li>Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+%CE%B1-%2C+%CE%B2-+and+%CE%B3-cyclodextrins+on+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes.</a> Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+cyclodextrin-induced+lipid+substitution+to+study+membrane+lipid+and+ordered+membrane+domain+%28raft%29+function+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774(2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+replacement+of+plasma+membrane+outer+leaflet+phospholipids+and+sphingolipids+in+cells+with+exogenous+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).</li>
<li>Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+amino+acid+replacements+within+the+tetrabasic+cleavage+site+on+the+processing+of+the+human+insulin+receptor+precursor+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).</li>
<li>Gaus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+lipid+structure+and+raft+domains+in+living+cells+with+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).</li>
<li>Klymchenko, S., Kreder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+lipid+rafts%3A+From+model+membranes+to+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells.</a> Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).</li>
<li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+receptors%2C+lipid+rafts+and+caveolae%3A+An+evolving+story%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+ActaMol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story.</a> Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+detergent-resistant+membrane+domains%3A+does+phase+separation+occur+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).</li>
<li>Lin, Q., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+artificial+plasma+membrane+mimicking+vesicles+with+lipid+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry.</a> PLoS One. 9 (1), e87903(2014).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li>
<li>Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipid+flippases+can+modulate+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">How lipid flippases can modulate membrane structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).</li>
<li>Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+externalization+of+phosphatidylserine+at+the+cell+surface%3A+implications+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis.</a> J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacing+plasma+membrane+outer+leaflet+lipids+with+exogenous+lipid+without+damaging+membrane+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity.</a> PLoS One. 14 (10), e0223572(2019).</li>
<li>Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transbilayer+%28flip-flop%29+lipid+motion+and+lipid+scrambling+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes.</a> FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%CE%B1CD-based+plasma+membrane+outer+leaflet+lipid+exchange+in+mammalian+cells+to+study+insulin+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Approach+Study+Memb+Struct+A+Exp%22%5BJournal%5D)">MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity.</a> Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850335</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td>850355</tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insulin receptor &beta; 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>CST3025</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pYpY1162/1163 인슐린 수용체 항체</td><td>R& 주식회사 디 시스템즈</td><td>AF2507</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 시험관(12 x 75mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>Brain sphingomyelin (bSM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860062</td><td></td></tr><tr><td>Egg sphingomyelin (eSM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum ( FBS)</td><td>Corning</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>G418 디설페이트 염</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 항생제-항진균 용액 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' s 변성 이글 배지 (DMEM, 4.5 g/L 포도당, L-글루타민, 피루브산 나트륨)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Gibco ham' s F12 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-글루타민</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM 비필수 아미노산 용액(100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 및 마그네슘 (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (무수))이 없는 Gibco 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td></td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>고성능 박막 크로마토그래피(HP-TLC)</td><td>Merck</td><td>HP-TLC 실리카 겔 60 플레이트</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Methotrexate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>454126</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&alpha;- 시클로덱스트린(M&alpha; CD)</td><td>AraChem</td><td>CDexA076/BR</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL 웨스턴 블로팅 기판</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>오르토바나데이트나트륨, 활성</td><td>시그마 Aldrich</td><td>5.08605</td><td></td></tr></tbody></table>

살아있는 세포의 지질 교환 분석

Lipid Exchange Assay in Living Cells

교환 후 세포 지질 조성의 관찰 가능한 변화를 입증하기 위해 뇌 SM(bSM) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 교환 후 CHO IR 세포에 대해 HP-TLC를 수행했습니다(그림 1). bSM과 같은 스핑고미엘린이 교환에 사용되는 경우, SM 밴드 강도의 증가와 함께 처리되지 않은 대조군에 비해 PC 밴드 강도의 감소가 명백합니다. 반대로, DOPC와 같은 포스파티딜콜린을 교환할 때 PC 밴드는 더 강해지고 SM 밴드는 덜 강해집니다. 교환 효율은 ImageJ 소프트웨어로 교환된 지질 등급의 강도를 측정하고 처리되지 않은 샘플과 처리된 샘플의 비율을 취하여 결정할 수 있습니다. 시판되는 지질의 여러 희석액으로 만들어진 로딩 표준물질은 교환 전후의 지질 등급의 양을 추정하기 위한 옵션을 보여줍니다. SM 표준 밴드의 강도를 측정하고 표준 곡선을 생성함으로써 모든 샘플의 SM 강도를 지질 정량화를 위해 곡선에 맞출 수 있습니다.
<p class=...

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the ...

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리가 맥스와 Annexin V - 복합 자석 구슬과 대상 지질 및 Annexin V - 구속력 phosphatidylserine의 합성 지질 vesicles를 사용하여 자사의 목표 지질과 단백질의 상호 작용을 테스트하려면. 대상 지질에 바인딩 단백질은 공동 정화 및 비즈에서 용출 후 분석하고 있습니다.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

여기 HDL-지질 과산화의 결정에 대 한 fluorometric 셀 무료 생화학 분석 결과 설명합니다. 이 신속 하 고 재현성 분석 결과 대규모 연구에서 HDL 함수를 확인 하는 데 사용 수 고 인간의 질병에 HDL 함수에 대 한 우리의 이해에 기여할 수 있다.

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

이 프로토콜에는 라이브 셀 이미징 다양 한 셀 형식에 시스템을 사용 하 여 실시간으로 유입 속도와 LDL 콜레스테롤 흡수를 측정 하는 효율적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 세포 형태학 및 그러므로 잠재적인 세포 독성에 대 한 모니터링 하면서 LDL 유입에 영향을 미치는 화합물의 약리 활동 화면 플랫폼을 제공 합니다.

LDL 콜레스테롤 이해 분석 결과 라이브 셀 이미징 분석 셀을 사용 하 여 상태 모니터링

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

마이크로패턴 어레이를 사용하여 단일 세포로부터 형광 리포터 타임 코스를 취득하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 어레이의 준비, 라이브 셀 스캐닝 시간 경과 현미경 검사법의 설정 및 작동 및 접착 부위당 세포 통합 형광 시간 과정의 자동화된 사전 선택, 시각적 제어 및 추적을 위한 오픈 소스 이미지 분석 도구에 대해 설명합니다.

세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

지방파지(Lipophagy)는 지질 방울의 분해를 포함하는 선택적 형태의 자가포식입니다. 이 과정의 기능 장애는 암 발병과 관련이 있습니다. 그러나 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 이 프로토콜은 자가포식, 지질 대사 및 암 진행 간의 상호 작용을 더 잘 이해하기 위한 정량적 이미징 접근 방식을 설명합니다.

Lipophagy를 통한 지질 방울 이화작용의 조절 탐구

본원에서, 우리는 전체 인간 혈장 또는 혈청에 존재하는 고밀도 지단백질(HDL)에 의해 지질 공여자 입자로부터 특이적으로 제거된 형광 인지질의 양을 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 HDL 기능의 이 지표가 발생 심혈관 질환을 예측한다는 것을 보여주었습니다.

고밀도 지단백질 특이적 인지질 유출 분석

배우세요 살아있는 세포에서 사이클로덱스트린을 이용한 지질 교환 방법으로 수용체 티로신 키나아제와 막 단백질의 상호작용을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 막 역학 및 세포 신호전달 연구에 활용됩니다.

살아있는 세포의 지질 교환 분석

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