시험관 내 및 생체 내 골수 세포와 CAR T 세포 간의 상호 작용 연구

우리의 연구는 맨틀 세포 림프종의 맥락에서 CA 19 항종양 활성에 대한 인간 면역억제 대식세포의 영향을 이해하기 위해 단순화된 시험관 내 및 생체 내 모델을 제공합니다. 생체 내에서 인간 대식세포와 단핵구를 연구하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 모델은 조혈모세포를 박멸된 면역결핍 마우스에 생착시키는 것입니다. 생쥐의 인간 골수 세포를 연구하기 위해 면역결핍 마우스에 인간 조혈 줄기 세포를 생착시키는 것은 시간과 비용이 많이 소요될 수 있습니다.

생착 효율도 제한될 수 있습니다. 우리는 인간 대식세포, CAR T 및 종양 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위해 보다 단순화된 시험관 내 및 생체 내 모델을 구축합니다. 다른 대식세포 표적 면역 요법을 테스트하는 데에도 사용할 수 있습니다.

시작하려면 분리된 1,000만 개의 인간 고전적 단핵구를 섭씨 4도에서 5분 동안 300g에서 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 세포를 배양 배지에 밀리리터당 100만 세포의 최종 농도로 재현탁합니다. 인간 재조합 GM-CSF를 현탁액에 첨가하여 밀리리터당 10나노그램의 최종 농도에 도달하고 완전히 혼합합니다.

단핵구를 T25 조직 배양 플라스크로 옮기고 섭씨 37도에서 7일 동안 배양합니다. 7일째에는 10분마다 얼음 위에서 세포를 세게 피펫팅하고 대부분의 대식세포가 분리될 때까지 현미경으로 확인합니다. 분리된 세포를 얼음 위의 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척하여 나머지 세포를 풀고 원추형 튜브에 결합합니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 섭씨 4도에서 5분 동안 300g에서 원심분리합니다. 상층액을 흡인한 다음 얼음처럼 차가운 PBS 5밀리리터로 펠릿을 세척하고 재현탁합니다.

튜브를 다시 원심분리하고 상청액을 흡인한 후, 최종 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁하여 밀리리터당 2천만 세포의 농도에 도달합니다. 용액을 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 옮기고 얼음 위에 보관합니다. 다음으로, 준비된 1,500만 개의 루시페라아제 양성 JeKo 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

JeKo 세포를 원심분리한 후 상청액을 흡인합니다. 펠릿을 얼음처럼 차가운 PBS에 밀리리터당 4천만 세포의 농도로 재현탁합니다. 이제 동일한 부피의 대식세포 현탁액과 종양 세포 현탁액을 신선한 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 혼합합니다.

동일한 부피의 가용화된 기저막 매트릭스를 첨가하고 얼음 위에서 완전히 혼합합니다. 대조군으로서, 나머지 JeKo 세포를 새로운 미세 원심분리기 튜브에서 동일한 부피의 PBS와 혼합합니다. 동일한 부피의 가용화된 기저막 매트릭스를 추가하고 얼음 위에서 혼합합니다.

쥐를 마취한 후 노즈콘이 있는 가열된 무대에 놓습니다. 각막 손상을 방지하기 위해 생쥐의 양쪽 눈에 안용 연고를 바르십시오. 각 마우스의 오른쪽 옆구리를 면도하여 피부를 노출시킵니다.

100마이크로리터의 JeKo 대식세포 혼합물을 0.5밀리리터 주사기에 넣고 기포를 제거합니다. 노출된 피부를 부드럽게 들어 올리고 돌출된 피부 부위에 바늘을 삽입하면서 손가락으로 해당 부위를 누릅니다. 세포를 피하층에 천천히 주입하고 바늘을 부드럽게 빼냅니다.

면역억제성 대식세포의 생체 내 영향을 평가하기 위해 JeKo 세포 단독 또는 분화된 대식세포와 함께 생착된 NSG 마우스에서 생물 발광 이미징에 의해 종양 부담 진행을 추적했습니다. 분화된 대식세포의 존재는 JeKo 단독에 비해 17일까지 공동 생착된 마우스에서 유의하게 더 큰 종양 부담으로 나타난 바와 같이 생체 내 종양 진행을 현저하게 가속화했습니다.