Name: G-Quadruplexes에서 DNA 중합효소 역학의 단일 분자 형광 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: 배우세요 단일분자 형광현미경법을 이용하여 G-쿼드루플렉스 구조와 만날 때 DNA 중합효소 델타의 역학을 시각화하는 방법을. 이 기법은 중합효소 교환 경로를 밝혀 DNA 복제 메커니즘 이해에 기여합니다.

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<ol><li>Sutton, M. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+DNA+polymerases%3A+Coordinating+DNA+replication%2C+DNA+repair%2C+and+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Managing DNA polymerases: Coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (15), 8342-8349 (2001).</li>
<li>Burgers Garg, P., J, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+that+propagate+the+eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases that propagate the eukaryotic DNA replication fork.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 40 (2), 115-128 (2005).</li>
<li>Burgers, P. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+polymerases+in+DNA+replication+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA polymerases in DNA replication and DNA repair.</a> Chromosoma. 107 (4), 218-227 (1998).</li>
<li>Tsai, M. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+DNA+polymerases+catalyze+DNA+replication%2C+repair%2C+and+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">How DNA polymerases catalyze DNA replication, repair, and mutation.</a> Biochem. 53 (17), 2749-2751 (2014).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25 (2020).</li>
<li>Chilkova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eukaryotic+leading+and+lagging+strand+DNA+polymerases+are+loaded+onto+primer-ends+via+separate+mechanisms+but+have+comparable+processivity+in+the+presence+of+PCNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA.</a> Nucleic Acids Res. 35 (19), 6588-6597 (2007).</li>
<li>Sugino Kawasaki, Y., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+replicative+DNA+polymerases+and+their+role+at+the+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Yeast replicative DNA polymerases and their role at the replication fork.</a> Mol Cells. 12 (3), 277-285 (2001).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Shivji Wood, R. D., K, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+DNA+polymerases+are+used+for+DNA+repair+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Which DNA polymerases are used for DNA repair in eukaryotes.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 605-610 (1997).</li>
<li>Campbell Budd, M. E., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+the+eukaryotic+DNA+polymerases+in+DNA+repair+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The roles of the eukaryotic DNA polymerases in DNA repair synthesis.</a> Mutat Res DNA Repair. 384 (3), 157-167 (1997).</li>
<li>Gao Yang, W., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translesion+and+repair+DNA+polymerases%3A+Diverse+structure+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism.</a> Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).</li>
<li>Bridges, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair%3A+Polymerases+for+passing+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA repair: Polymerases for passing lesions.</a> Curr Biol. 9 (13), 475-477 (1999).</li>
<li>Wilkinson, E. M., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+protein+dynamics+during+DNA-lesion+bypass+by+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci.+9%22%5BJournal%5D)">Observing protein dynamics during DNA-lesion bypass by the replisome.</a> Front Mol Biosci. 9. 968424, (2022).</li>
<li>Mueller, S. H., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+proteins+play+tag%3A+The+dynamic+nature+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">When proteins play tag: The dynamic nature of the replisome.</a> Biophys Rev. 11 (4), 641-651 (2019).</li>
<li>Zybailov, B. L., Sherpa, M. D., Glazko, G. V., Raney, K. D., Glazko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4-quadruplexes%2C+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">G4-quadruplexes, and genome instability.</a> Mol Biol. 47 (2), 197-204 (2013).</li>
<li>Monnat Loeb, L. A., J, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases and human disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 594-604 (2008).</li>
<li>Bryan Oganesian, L., M, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+relevance+of+telomeric+G-quadruplex+formation%3A+A+potential+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Physiological relevance of telomeric G-quadruplex formation: A potential drug target.</a> Bioessays. 29 (2), 155-165 (2007).</li>
<li>Chambers, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+DNA+G-quadruplex+structures+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 877-881 (2015).</li>
<li>Cheng, Y., Zhang, Y., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+G-quadruplexes+folding%2Funfolding+dynamics+and+interactions+with+proteins+from+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol%22%5BJournal%5D)">Characterization of G-quadruplexes folding/unfolding dynamics and interactions with proteins from single-molecule force spectroscopy.</a> Biomol. 11 (11), (2021).</li>
<li>Tippana, R., Xiao, W., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplex+conformation+and+dynamics+are+determined+by+loop+length+and+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplex conformation and dynamics are determined by loop length and sequence.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8106-8114 (2014).</li>
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<li>Obi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+G-quadruplex+DNA+structures+in+Schizosaccharomyces+pombe+causes+single-strand+DNA+lesions+and+impedes+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stabilization of G-quadruplex DNA structures in Schizosaccharomyces pombe causes single-strand DNA lesions and impedes DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 48 (19), 10998-11015 (2020).</li>
<li>Kamath-Loeb, A. S., Loeb, L. A., Johansson, E., Burgers, P. M., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+Werner+syndrome+helicase+and+DNA+polymerase+delta+specifically+facilitate+copying+of+tetraplex+and+hairpin+structures+of+the+d%28CGG%29n+trinucleotide+repeat+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interactions between the Werner syndrome helicase and DNA polymerase delta specifically facilitate copying of tetraplex and hairpin structures of the d(CGG)n trinucleotide repeat sequence.</a> J Biol Chem. 276 (19), 16439-16446 (2001).</li>
<li>Clayton Kaguni, L. S., A, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+pausing+in+in+vitro+DNA+synthesis+by+DNA+polymerase+a+from+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Template-directed pausing in in vitro DNA synthesis by DNA polymerase a from Drosophila melanogaster embryos.</a> Proc Natl Acad Sci. 79 (4), 983-987 (1982).</li>
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<li>Castillo Bosch,, P,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FANCJ+promotes+DNA+synthesis+through+G-quadruplex+structures%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FANCJ promotes DNA synthesis through G-quadruplex structures.</a> EMBO J. 33 (21), 2521-2533 (2014).</li>
<li>Paeschke, K., Capra, J. ohnA., Zakian, V. irginiaA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+through+G-quadruplex+motifs+is+promoted+by+the+Saccharomyces+cerevisiae+Pif1+DNA+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA replication through G-quadruplex motifs is promoted by the Saccharomyces cerevisiae Pif1 DNA helicase.</a> Cell. 145 (5), 678-691 (2011).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+efforts+of+replicative+helicase+and+SSB+ensure+inherent+replicative+tolerance+of+G-quadruplex%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci.+%28Weinh%22%5BJournal%5D)">Joint efforts of replicative helicase and SSB ensure inherent replicative tolerance of G-quadruplex.</a> Adv Sci. (Weinh. 11 (9), (2024).</li>
<li>Pham, S. Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+quadruplex+DNA-binding+nickel+Schiff+base+complexes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Trans%22%5BJournal%5D)">A new class of quadruplex DNA-binding nickel Schiff base complexes).</a> Dalton Trans. 49 (15), 4843-4860 (2020).</li>
<li>Georgescu, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+asymmetric+polymerase+assembly+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of asymmetric polymerase assembly at the eukaryotic replication fork.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (8), 664-670 (2014).</li>
<li>Hansen, J. B., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+protein+concentration+determination+using+the+NanoDrop+2000c+spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume protein concentration determination using the NanoDrop 2000c spectrophotometer.</a> J Vis Exp. 33, (2009).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>Geertsema, H. J., Duderstadt, K. E., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeertsema%2C+HJ+%22in+DNA+Replication%3A+Methods+and+Protocols.%2C+eds+Vengrova%2C+S.%2C+Dalgaard%2C+J%22">in DNA Replication: Methods and Protocols., eds Vengrova, S., Dalgaard, J</a>. , Springer. New York, New York, NY. 219-238 (2015).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+visualization+of+fast+polymerase+turnover+in+the+bacterial+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule visualization of fast polymerase turnover in the bacterial replisome.</a> eLife. 6, 23932(2017).</li>
<li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 12-18 (2009).</li>
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<li>Edwards, D. N., Machwe, A., Wang, Z., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+telomeric+G-quadruplexes+dramatically+inhibit+DNA+synthesis+by+replicative+and+translesion+polymerases%2C+revealing+their+potential+to+lead+to+genetic+change%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intramolecular telomeric G-quadruplexes dramatically inhibit DNA synthesis by replicative and translesion polymerases, revealing their potential to lead to genetic change.</a> PLoS One. 9 (1), 80664(2014).</li>
<li>Mueller, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-molecule+characterization+of+enzymes+involved+in+nucleic-acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid single-molecule characterization of enzymes involved in nucleic-acid metabolism.</a> Nucleic Acids Res. 51 (1), 5(2022).</li>
<li>Lewis, J. S., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+heterogeneity%3A+Challenging+the+paradigm+of+replisomes+as+deterministic+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Embracing heterogeneity: Challenging the paradigm of replisomes as deterministic machines.</a> Chem Rev. 123 (23), 13419-13440 (2023).</li>
<li>Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA-protein crosslink repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 563-573 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100 nt control DNA template</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>프라이머 확장 분석의 1차 제어 템플릿</td></tr><tr><td>100 nt G4 형성 DNA 템플릿</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>프라이머 확장 분석의 1차 G4 형성 템플릿</td></tr><tr><td>15% Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 12 well, 20 &micro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4566055</td><td>젤 전기 영동</td></tr><tr><td>20 nt 표지 / biotinylated 프라이머 올리고 뉴클레오티드</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>100 nt 템플릿의 프라이머 확장에 필요</td></tr><tr><td>22 nt 제어 DNA 템플릿</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>원형 이색성 분광학 실험에서 기본 제어 템플릿</td></tr><tr><td>22 nt G4 형성 DNA 템플릿</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>원형 이색성 분광법 실험에서 기본 G4 형성 템플릿</td></tr><tr><td>24 x 24 mm 커버슬립</td><td>Marienfeld Superior</td><td>100062</td><td>TIRF 현미경 검사에 필요</td></tr><tr><td>3-아미노프로필트리에톡시실란</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10668.22</td><td>커버슬립 기능화</td></tr><tr><td>647 nm 레이저</td><td>코히어런</td>트 <td>1196627</td><td>염색/염료에 해당하는 파장 선택 선택</td></tr><tr><td>670nm 방출 필터</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET655lp</td><td>관련 파장만 검출기로 통과하도록 합니다.</td></tr><tr><td>Amersham Typhoon 5 생체 분자 이미저</td><td>Cytiva</td><td>29187191</td><td>젤 분석</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-PEG-SVA-5K-100MG</td><td>Coverslip 기능화</td></tr><tr><td>Deoxynucleotides triphosphate 용액 혼합</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-1005L</td><td>복제 빌딩 블록</td></tr><tr><td>디지털 드라이 배스 (115V)</td> <td>Bio-Rad</td><td>1660571</td><td>가열 솔루션</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich 646563</td><td></td><td>Disulfide 결합 감소</td></tr><tr><td>EM-CCD 카메라</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>단일 분자 영화 캡처</td></tr><tr><td>포름 아미드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>F9037</td><td>DNA 변성 앙상블 DNA 복제 분석</td></tr><tr><td>가스 밀폐 주사기, 1 mL</td><td>SGE</td><td>21964</td><td>원형 이색성 분광법용 충전 큐벳</td></tr><tr><td>CFI Apo TIRF 100x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용한 도립 현미경</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse Ti-E</td>, <td>단분자 TIRF 현미경 촉진</td></tr>, <tr><td>J-810, 분광 광도계</td><td>Jasco</td><td>J-810</td>, <td>원형 이색성 분광법 측정</td></tr>, <tr><td>mPEG-SVA (MW, 5000),</td> <td>Laysan Bio</td>, <td>MPEG-SVA-5K-100MG</td>, <td>Coverslip 기능화,</td></tr><tr><td>NanoDrop One, 분광 광도계</td><td>, Thermofisher, Scientific</td><td>ND-ONE</td><td>,</td></tr> <tr><td>단백질 및 라벨 농도 측정NeutrAvidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>단일분자 실험 중 기능화된 커버슬립에 DNA 템플릿 테더링</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>Instech</td><td>BTPE-60</td><td>플로우 셀 구성에 필요</td></tr><tr><td>석영 큐벳, 10mm</td><td>Starna Scientific</td><td>1/Q/10/CD</td><td>원형 이색성 분광법용 샘플 보관</td></tr><tr><td>시린지 펌프</td><td>Adelab Scientific</td><td>NE-1002X</td><td>미세유체 플로우 셀을 통해 버퍼와 기질을 흐름시키는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Tris-EDTA 버퍼</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>93283</td><td>DNA 용액 버퍼</td></tr><tr><td>효모 중합효소 &델타;</td><td>Michael O'Donnell 연구실</td><td></td>, <td>DNA 템플릿 복제</td></tr><tr><td>Zeba 스핀 탈염 컬럼, 7K MWCO, 0.5mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td><td>중합효소 정제</td></tr></tbody></table>

g-quadruplexes에서 dna 중합효소 역학의 단일 분자 형광 시각화

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

이 분석을 위해 형광 표지된 20-nt 프라이머가 있는 두 개의 DNA 기질이 설계되었는데, 하나는 G4 형성 서열을 포함하고(그림 1A, 왼쪽) 이 서열이 없는 기질(그림 1A, 오른쪽)을 포함합니다. G-quadruplex가 중합효소 활성에 효과적인 장애물임을 확인하기 위해 Pol δ에 의한 DNA 합성을 변성 PAGE 겔에서 모니터링했습니다. DNA 기질에 대한 정제된 표지된 Pol δ의 활성을 겔 전기영동에 의해 검사했습니다. 그림 1B (왼쪽)는 형광 표지된 Pol δ이 G-quadruplex를 지나 합성할 수 없음을 보여줍니다. 합성이 시작되기 전에(t = 0 min), 20 nt에 해당하는 밴드가 존재하며, 이는 템플릿 가닥에서 변성된 라벨링된 프라이머를 나타냅니다. 3분 후 이 20-nt 밴드는 60-nt 밴드로 변환되어 모든 DNA에서 합성이 발생했음을 나타내고 중합효소가 G-사중플렉스 구조에 의해 완전히 차단되었음을 확인했습니다. 이 차단은 중합효소가 구조를 펼치거나 우회할 수 없음을 의미합니다. 대조적으로, G-quadruplex-forming sequence(그림 1A, 오른쪽)를 포함하지 않는 control template의 합성은 3분 후에 100-nt band를 생성했습니다(그림 1B, 오른쪽).
템플릿에서 합성을 확인하고 G-quadruplex에 의한 효율적인 차단을 확인한 후, 이러한 측정을 단일 분자 형광 현미경에서 반복하여 중합효소 거동을 모니터링했습니다. DNA 템플릿은 미세유체 플로우 셀(microfluidic flow cell)에서 기능화된 커버슬립(coverslip)에 테더링되었으며, 각 기질의 위치는 형광 표지된 프라이머를 시각화하여 결정되었습니다. 그런 다음 Pol δ로 표시된 것을 dNTP가 있는 곳에 로드하여 합성을 시작했습니다. 일반적인 FOV 내에서 개별 스폿을 추적하여 Pol δ이 DNA에서 얼마나 자주 결합하고 해리되는지 정량화합니다(그림 2B, C). 각 DNA 기질에서 시간 함수로 강도를 측정함으로써 단일 분자 궤적을 생성할 수 있습니다(그림 2C, 보충 그림 3). 특징적인 "체류 시간" 또는 Pol δ이 템플릿에 바인딩된 상태로 유지되는 평균 지속 시간을 측정할 수 있습니다. G4 기판의 경우 체류 시간이 6초 ± 2초로 결정된 반면, 대조 기판의 경우 10초 ± 3초로 결정되었습니다(그림 2D, 보충 그림 4). 또한 각 궤적에 대해 Pol δ이 템플릿에 바인딩하는 횟수를 정량화할 수 있습니다. G4 기질에 대한 결합 이벤트의 수는 대조군 템플릿에 비해 훨씬 높습니다(그림 2E). 스콜라스틱 바인딩 및 바인딩 해제로 인해 컨트롤 템플릿에 둘 이상의 바인딩 이벤트 인스턴스가 있지만, G4 형성 템플릿에 대한 바인딩 이벤트의 수가 평균적으로 확실히 증가하고 있습니다. 이것은 합성이 G-quadruplex에 의해 중단된 후 결합된 중합효소가 DNA에서 해리되기 전에 용액의 새로운 중합효소가 결합과 해제의 연속적인 주기를 결합한다는 것을 시사합니다. 따라서 이 단일 분자 분석은 DNA 중합효소가 DNA 장애물에 어떻게 반응하는지에 대한 탁월한 통찰력을 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig01.jpg"> 
그림 1: 앙상블 프라이머 확장 분석. (A) DNA 기질의 개략적 표현. G4 기질(왼쪽)에는 G-4중플렉스 형성 서열이 포함되어 있지만 대조 기질(오른쪽)에는 포함되어 있지 않습니다. (B) 프라이밍된 G4 및 대조군 DNA 기질의 앙상블 DNA 프리마즈 확장 분석은 형광 표지된 효모 Pol δ이 G-사중플렉스에 의해 완전히 차단되었음을 보여줍니다. PAGE 겔은 시간 경과에 따른 DNA 템플릿의 복제를 보여주며, 그 결과 라벨링된 20 nt 프라이머가 G4 기질의 경우 60-nt 산물(왼쪽)로, 대조군 주형의 경우 100-nt 산물(오른쪽)로 이동했습니다. M은 라벨링된 20nt, 60nt 및 100nt 올리고를 포함하는 래더를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig02.jpg"> 
그림 2: 단일분자 형광 현미경 검사. (A) AF647 표지 효모 Pol δ을 사용한 단일분자 프라이머 확장 분석의 개략도. (B) 단일분자 분석에서 얻은 일반적인 FOV. 각 반점은 DNA 주형에 결합하는 형광 표지된 Pol δ를 나타냅니다. 스케일 바: 10μm. (C) (상단) Pol δ 교환에 따른 on/off 결합을 보여주는 단일 분자 분석의 예시 분자. (아래) 실험의 시간 경과에 따른 강도를 보여주는 동일한 분자의 단일 분자 궤적. 검은색 선은 데이터에 맞는 HMM(Hidden Markov Model)을 나타냅니다. (D) G4 기판(자주색)과 대조 기판(회색)에 대한 Pol δ의 체류 시간. 선은 지수 적합을 나타내며 G4 기판에서 6초 ± 2초, 대조 기판에서 10초 ± 3초의 수명을 제공합니다. (E) 단일 DNA 기질에 대한 Pol δ 결합 이벤트의 수. G4 기질(보라색)의 결합 이벤트 중앙값은 대조군 기질 1(회색)과 비교하여 3.5입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1 : CD 분광법. 25°C에서 200mM의 KCl을 포함하는 TE 완충액의 G4 형성(보라색) 및 제어 순서(회색)의 CD 스펙트럼. 260nm에서 특징적인 피크와 240nm에서 음의 피크가 이어지는 것은 병렬 분자 내 GQ의 특징입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%201%20(CD).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 플로우 셀 구조. (A) 플로우 셀(flow cell)의 개별 조각에 대한 개략도. 사각형 PDMS 블록은 현미경 커버슬립 위에 있습니다. 그런 다음 이 조각들을 플로우 셀 홀더의 뚜껑과 바닥 내부에 함께 끼웁니다. (B) 완전한 플로우 셀. 튜브를 PDMS 블록의 각 측면에 삽입하여 미세유체역학을 통해 장치를 통해 버퍼가 흐를 수 있는 채널을 형성할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%202%20(Flow%20Cell).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: 단일 분자 궤적. (A) 실험의 10분 기간 동안 단일 결합 이벤트를 겪는 분자의 궤적 예. (B) 실험의 10분 기간 동안 0 결합 이벤트를 겪는 분자의 궤적 예. (A)와 (B)의 검은색 선은 데이터에 대한 HMM(Hidden Markov Model)을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%203%20(Extra%20Traces).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4: 체류 시간. (A) G4 기판에 δ Pol의 체류 시간. 선은 지수 적합도를 나타내며 6초 ± 2초의 수명을 제공합니다.(B) 제어 기판에 대한 Pol δ의 체류 시간. 지수 맞춤은 10초 ± 3초의 수명을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%204%20(Split%20Lifetimes).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 5: 광표백 대조군. 이 플롯은 개별 AF647 표지 효모 Pol δ 효소가 647nm 레이저에 의해 광표백되는 평균 시간을 보여줍니다. 선은 지수 적합도를 나타내며 39 ± 6초의 수명을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%205%20(Photobleaching%20Control).pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

G-Quadruplexes에서 DNA 중합효소 역학의 단일 분자 형광 시각화

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 미래의 핵산 기반 치료제를위한 균일한 및 사용자 정의 polyplexes보다 제어하고 합성을 제공하는 것으로 예상된다 고분자 전해질의 polyplexes의 형성을 조사하기 위해 nanophotonics (QD - 걱정)와 microfluidics의 소설과 강력한 통합을 제시한다.

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

이 프로토콜은 실시간으로 개인 replisomes하여 DNA 복제를 시각화하기위한 간단한 단일 분자 형광 현미경 기술을 보여줍니다.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다.

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

이 연구 결과는 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 이중 가닥 DNA의 반복 역학을 측정하는 상세한 실험 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 J 인자라는 반복 확률 밀도를 추출하는 방법에 대해 설명합니다.

단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

단일 분자 자석 족집게 플랫폼 G-quadruplexes를 조작 하는 보고, G4 안정성과 규제의 연구에 대 한 수 있는 다양 한 단백질에 의해.

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

여기, 선물이 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) site-specifically 수정된 λ DNA 기판 및 양자 점 단백질 분류를 사용 하 여 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜.

Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

quantum-dot-labeled DNA와 total internal reflection fluorescence microcopy를 사용하여 unlabeled protein을 사용하면서 restriction endonucleases의 반응 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 이 단일 분자 기법을 사용하면 개별 단백질-DNA 상호 작용을 대규모로 다중화하여 관찰할 수 있으며, 데이터를 풀링하여 잘 채워진 체류 시간 분포를 생성할 수 있습니다.

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

미세 유체 챔버를 통해 연구 된 시각적 단일 분자 생화학은 유리 배럴, 기밀 주사기, 튜브와 플로우 셀의 안정적인 연결 및 주사기와 튜브 사이에 스위칭 밸브를 배치하여 기포 제거를 사용하여 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 DNA 거래 및 분자간 상호 작용의 시각화를 가능하게 하는 이중 광학 트랩을 설명합니다.

단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

Bis-3-chloropiperidines(B-CeP)는 in vitro에서 DNA 템플릿의 G-quadruplex 구조를 식별하고 특성화하는 데 유용한 화학 프로브입니다. 이 프로토콜은 B-CeP를 사용하여 프로빙 반응을 수행하고 고분해능 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 반응 생성물을 분해하는 절차를 자세히 설명합니다.

In Vitro (시험관) Bis-3-Chloropiperidines에 의한 G-Quadruplex DNA 구조의 화학적 매핑

당사는 광학 트랩에 고정된 선형 DNA 분자에서 형광 라벨링되고 완전히 재구성된 Cdc45/Mcm2-7/GINS(CMG) 헬리카제의 움직임을 직접 이미지화하고 정량화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석을 보고합니다.

완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석

이 프로토콜은 CMG helicase에 의한 DNA 풀림의 실시간 시각화를 위한 단일 분자 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. (1) DNA 기질 준비, (2) 형광 표지된 Drosophila melanogaster CMG helicase를 정제하는 방법, (3) 전반사 형광(TIRF) 현미경 검사를 위한 미세유체 플로우 셀을 준비하는 방법, (4) 단일 분자 DNA 풀기 분석에 대해 설명합니다.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

배우세요 단일분자 형광현미경법을 이용하여 G-쿼드루플렉스 구조와 만날 때 DNA 중합효소 델타의 역학을 시각화하는 방법을. 이 기법은 중합효소 교환 경로를 밝혀 DNA 복제 메커니즘 이해에 기여합니다.

G-Quadruplexes에서 DNA 중합효소 역학의 단일 분자 형광 시각화

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