Name: 레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 배우세요 생체 내 2광자 칼슘 이미징을 통해 마우스 신피질 미세회로의 신경 활동을 동시에 기록하는 방법입니다. 이 기술은 단일 세포 해상도로 밀집된 신경망 역학을 연구하는 데 효과적입니다.

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우리는 칼슘 지표의 대량 로딩을 최적화에 도움이 토론에 대한 올가 Garaschuk을 인정하고 싶습니다.

<ol><li> 형광 칼슘 지표 솔루션을 준비합니다. 우리는 짧게 염료를 아세 톡시 메틸 에스테르 염료를 사용하거나, AM. 이들은 extracellularly 주입했을 때 세포에 의해 촬영 수있는 염료입니다. 우리는 일반적으로 1 ㎜의 농도에 오레곤 - 그린 BAPTA - 1 AM 또는 AM Fluo - 4를 사용합니다. AM의 염료 50 마이크로 그램의 튜브 안에 Invitrogen에서 얻을 수 있습니다. 우리가 먼저 DMSO에서 Pluronic F - 127의 20 % 솔루션을 준비합니다. 우리는 분명까지 매일 사용하기 전에 솔루션을 따뜻하게. 우리는 칼슘 표시 10 mm의 농도 15-20분에 대한 20 % Pluronic의 F-127/DMSO을 풀다. 150 NaCl, 2.5 KCl, 10 Hepes, 산도 7.4 : 우리는 다음 MM에 포함된 솔루션에서 1mM에 대한 해결책을 희석. 또한, 100 μm의 제품 Sulforhodamine 101은 일반적으로 레이블 astrocytes에 포함되어 있으며 사출 동안 피펫을 시각화. 우리는 0.49 미크론 원심 필터 (..; Garaschuk 외, 2006 Stosiek 외, 2003)로 사전에 주입에 대한 해결책을 필터링합니다. </li><li> 몇 군데로 그 지역에있는 두개의 창문을 이식. 우리는이 <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=680" target="_blank">목성에있는 일반적인 접근 방식을 설명</a> 하지만, 다음과 같은 수정은 칼슘 염료 주입을 위해 중요합니다 : 기본 두라 손상되지 극단적인 간병, 관심의 피질 영역 직경 2mm의 작은 craniotomy하십시오. craniotomy 이상의 장소에 coverslip을 확보하지만, 일부만 obliquely 피질을 입력 피펫을위한 공간을 허용하도록 craniotomy의 가장자리와 유리 coverslip 사이에 작은 간격을두고, craniotomy을 커버. 이전 주사로, craniotomy 주위에 치과 시멘트와 얕은 우물을합니다. 우물 방향으로 주동이의 확장 및 사출에 대한 micropipette 삽입을 허용하는 정도로 얕은해야합니다. </li><li> 현미경의 무대로 전송 마우스를 전송하고 우리와 같이, 머리를 고정 <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=678" target="_blank">혈액 흐름 이미징에서 비디오</a> . </li><li> 피펫 풀러를 사용하여 저항에서 2-4 메가 Ohms 저조한 팁 직경에 유리 microelectrode의 pipettes을 당기세요. microsyringe를 사용하여 유리 피펫에 칼슘 표시기 염료 믹스를로드합니다. micromanipulator를 사용하면 부드럽게 다음 잘게 40X 목표 아래에 위치하는 4X 목표를 사용하여 두뇌의 표면에 micropipette를 낮춥니다. 이미지를 보이지 않게하기 위해 거의 또는 전혀 overlying의 혈관이있다는 것을 같은 사출에 적합한 위치를 선택합니다. 두 광자 현미경을 사용하여, 피펫의 끝은 두라 아래 200 micrometers의 깊이, 시각 천천히 피질로 고급이다. 그런 다음, 압력 Picospritzer를 사용하여 1 분 10 PSI에서 염료 혼합물을 주입. 우리는 일반적으로 약 200-300 마이크론의 공간에서 구분된 오전 칼슘 색소 믹스의 2-4 주사를 제공합니다. 약간 중복되는 주사의 대량 로딩 방식은 600 x 600 마이크론 크기로 공간이 충분히 칼슘 이미징을위한 스테인드 것을 보장합니다. 확산과 뉴런에 의해 연결됩니다 염료 수 있도록, 오전 염료 혼합물의 주입 후에 이미지 1 시간 시작합니다. </li><li> - 생체내의 정의와 함께 두 광자 이미징은 카멜레온 티 - 사파이어 레이저 (800-880 nm의로 조정)과 캠브리지 기술 검류계 미러를 사용하여 두 광자 현미경을 만들어 수행합니다. 우리는 카렐 스보보다의 연구실 (Pologruto 외., 2003)에서 개발한 ScanImage 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득. 레이저 전원 잘 샘플 70 MW 아래 일반적이다. 전체 필드 이미지 중 초당 1.95-15.63 프레임 (256 X 64 픽셀 512 X 256 픽셀)에서 20X (NA 0.95) 또는 40X (NA 0.8) 올림푸스 목표를 사용을 찾았습니다. 라인 스캔 500 Hz에서에서 찾았습니다. 이미징 동안 동물은 빛의 isoflurane 마취 (0.6-0.9 %)에서 유지되며, 또한 37 ° C 보관 하버드 장치 온도 제어 장치를 사용하여. 치료는 가능한 한 가까운 100 호흡 / 분에 대해서 동물의 호흡 속도를 유지로 이동합니다. 마취의 사용 수준은 동물을 움직이게 낮은 수준이지만, 여전히 기록하는 자발적인 활동을 허용합니다. </li></ol>

<ol><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, (2006).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.%26nbsp%3B%26nbsp%3B+Biomed+Eng+Online+2%3A13%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.&nbsp;&nbsp; Biomed Eng Online 2:13.</a> Biomed Eng Online. 2, (2003).</li>
</ol>

electrophysiological 녹음을 통해이 방법의 장점은 덜 침략하고 밀도의 연결의 연결을 네트워크에 활동의 기록을 허용한다는 것입니다. 이 절차를 수행할 때 그것은 두라을 손상하지 craniotomy를 수행할 때 극단적인 돌봐 기억하는 것이 중요 S. 과 경막하 출혈도 작은 금액은 크게 이미지를 흐릿하게.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green BAPTA1-AM</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>O-6807</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4- AM</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 내 Pluronic F-127</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>원심분리 필터 (0.45 micron)</td><td>시약</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC3 0HV 0S</td><td></td></tr></tbody></table>

레이어의 vivo에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다. 방법은 뉴런의 큰 숫자에 의해 촬영하고 마지막에 - 생체내 두 광자 현미경을 사용하여 시간 저속 칼슘 이미징과 뉴런의 활동을 기록 할 수있는 형광 칼슘 지표 염료를 주입, 두개골 이미지 창을 이온 주입으로 구성되어 있습니다. astrocyte 특정 염료의 공동 주사 하나 ast​​rocytes에서 뉴런을 차별화 할 수 있습니다. 기술은 더 나은 세포의 서로 다른 그룹의 네트워크 상호 작용을 이해하는 뉴런의 특정 subpopulations에 형광 분자를 표현 생쥐에서 수행할 수 있습니다.

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

신피질 내 마이크로회로의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 수많은 뉴런의 활동을 동시에 기록하는 것이 필수적입니다.

신피질 내 미세회로의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 수많은 뉴런의 활동을 동시에 기록하는 것이 필수적입니다. 생체 내(In vivo)에서, 칼슘 이미징은 단일 세포 해상도로 밀집된 뉴런 집단의 활동을 기록할 수 있는 유일한 방법입니다.이 방법은 두개골 영상 창을 이식하고, 수많은 뉴런에 흡수될 수 있는 형광 칼슘 염료를 주입한 후, 타임랩스 칼슘 이미징을 통해 뉴런의 활동을 기록하는 과정으로 구성됩니다. 안녕하세요, 저는 UCLA David Geffen 의과대학 신경과 Carlos Porter Cayo 교수님 연구실의 Payman go입니다. 이전 영상에서 저희 연구실은 생쥐의 개두술 및 혈류의 이광자 이미징을 수행하는 절차를 시연하였습니다.오늘은 생쥐를 대상으로 한 생체 내(in vivo) 두 광자 칼슘 이미징 수행 절차를 보여드리겠습니다. 시작하기에 앞서, 염료 주입 용액을 준비해야 합니다.먼저, 형광 칼슘 지시약 용액을 준비합니다. 여기서는 에틸 에스테르 염료 또는 줄여서 AM 염료를 사용합니다. 이는 세포 외부에 주입되었을 때 세포 내로 흡수될 수 있는 염료로, 일반적으로 1 mM 농도의 organ green BAFTA 1:00 AM 또는 flu oh 4:00 AM을 사용합니다.먼저 20% onic F1 27 용액을 준비합니다. DMSO 내의 이 용액은 매일 사용 전 투명해질 때까지 가온합니다. 칼슘 지시약을 20% onic F1 27 DMSO에 15~20분 동안 용해시켜 10 millimolar 농도로 만듭니다.그 후, 50 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.4를 포함하는 용액에서 해당 용액을 1 mM로 희석하고 10~20분 동안 추가로 볼텍싱합니다. 성상교세포를 선택적으로 라벨링하기 위해 100 µM Sulforhodamine 101을 첨가하며, 염료 주입 중 피펫의 위치를 시각화하기 위해 다음으로 이미징할 영역 위에 두개창을 이식합니다. 이 수술의 일반적인 접근 방식은 이전에 발표한 JoVE 비디오 논문에 설명되어 있으나, 칼슘 염료 주입을 위해서는 다음과 같은 수정 사항이 중요합니다.관심 있는 피질 부위 위에 직경 2mm의 작은 두개골 절개창을 만들며, 이때 하층의 경막이 손상되지 않도록 각별히 주의합니다. 커버 슬립을 절개창 위에 고정하되, 주입 전 피펫이 피질에 비스듬히 진입할 수 있도록 절개창 가장자리와 유리 커버 슬립 사이에 작은 틈을 남겨 부분적으로

in-vivo-2-photon-calcium-imaging-in-layer-23-of-mice

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

여기에서 우리는 가상 현실 환경에서 동작하는 동안 마우스 피질의 두 광자 영상에 포함 된 실험 절차에 대해 설명합니다.

가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

여기서는 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 피질 층에 걸쳐 세포 - 해상도로 대규모 Ca 2+ 영상을 수행하는 절차를 제시합니다. 이식 프리즘 프로브와 결합 된 소형 헤드 장착 현미경을 사용하여 수백 개의 활성 세포를 동시에 관찰 할 수 있습니다.

다층 피질 칼슘<sup&gt; 2+</sup&gt; 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징

우리는 현재 vivo에서 2 광자 영상 이미징 신생아 쥐의 대뇌 피 질에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 대뇌 피 질의 뉴런, 신경 역학 및 질병 모델에서 신경 역학에 변화를 제어 하는 분자 메커니즘의 발달 역학 분석에 적합 합니다.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

이 논문은 정밀하게 제어된 수술과 이광자 현미경을 사용하여 마우스 해마 CA1에서 휴식 미세아교세포를 만성적으로 생체 내에서 관찰하는 방법을 설명합니다.

생체 내 마우스 해마에서 미세아교세포의 만성 이광자 이미징

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

본 프로토콜은 식품 랩, 투명 실리콘 및 커버 유리를 사용하여 큰(6 x 3 mm2) 두개골 창을 만드는 방법을 설명합니다. 이 두개골 창은 동일한 마우스에서 생체 내 광시야 및 2광자 칼슘 이미징 실험을 허용합니다.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

배우세요 생체 내 2광자 칼슘 이미징을 통해 마우스 신피질 미세회로의 신경 활동을 동시에 기록하는 방법입니다. 이 기술은 단일 세포 해상도로 밀집된 신경망 역학을 연구하는 데 효과적입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

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