March 7th, 2025
이 연구는 쥐 중간막 세포(MC)와 생체 외 세포 배양을 위한 최적화된 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 세포는 세포 성장이나 단백질 발현을 손상시키지 않고 여러 번 배양, 동결, 재생 및 배양할 수 있습니다.
본 연구의 중점 분야 중 하나는 다발성 골수종 관련 신장 장애에 관한 것입니다. 연구를 지원하기 위해 당사는 쥐 중간막 세포의 1차 배양을 위한 프로토콜을 개발하여 최적화했습니다. 절차에 필요한 장비에 쉽게 접근할 수 있으며 절차 단계가 간단합니다.
표적 세포를 획득하는 데는 2-3주밖에 걸리지 않습니다. 이 기술은 신장 연구를 촉진하고 질병 모델, 치료 개발 또는 신호 전달 연구에서 중간막 세포 기능을 조사하는 연구를 지원합니다. 적절하게 안락사된 동물에서 쥐 중간막 세포(MC)를 분리하기 시작하려면 가위와 핀셋을 사용하여 마우스에서 신장을 무균으로 제거하고 페트리 접시에 넣습니다.
Earle의 균형 잡힌 소금 용액으로 신장을 헹군 다음 핀셋을 사용하여 결합 조직과 신장 캡슐을 조심스럽게 제거합니다. 메스를 사용하여 신장을 수직으로 반으로 자릅니다. 페트리 접시에 3-4 밀리리터의 콜라겐 분해 효소 I 용액을 넣고 플라스틱 세포 유봉으로 조직을 철저히 분쇄합니다.
페트리 접시의 모든 조직과 용액을 15ml 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 완전한 조직 전달을 보장하기 위해 1-2ml의 콜라겐 분해 효소 I 용액으로 페트리 접시를 헹굽니다. 튜브를 섭씨 37도의 셰이커에 넣고 30분 동안 분당 120회전으로 흔듭니다.
그런 다음 혼합물에 동일한 부피의 정지 용액 또는 배양 배지를 추가합니다. 원심분리기 튜브에서 용액을 피펫으로 주입하고 100미크론 셀 스트레이너에 통과시킵니다. 50ml 원심분리기 튜브에 여과액을 수집합니다.
여과액을 40미크론 세포 여과기에 통과시켜 여과기의 세포만 유지합니다. 세포 수집을 최대화하기 위해 배양 배지 1로 스트레이너를 반복적으로 헹굽니다. 스트레이너에서 수집된 세포를 새로운 50ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
현탁액을 실온에서 600g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 원하는 세포 밀도에 따라 세포 배양 접시에 세포를 재현탁합니다. 섭씨 37도의 공기 95%와 이산화탄소 5%의 셀 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
배양 접시의 내부 가장자리를 따라 1-2ml의 PBS를 첨가하여 세포를 헹굽니다. 피펫을 사용하여 접시 바닥에서 PBS를 모두 제거한 다음 접시 안쪽 가장자리를 따라 10ml의 배양 배지를 추가합니다. 세포가 보통 7-10일 이내에 80% 합류점에 도달하면 멸균 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
접시에 0.25%트립신 용액을 첨가하여 세포를 트립신화합니다. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 대부분의 세포가 둥근 형태를 나타내고 표면에서 분리되면 동일한 부피의 배지 2를 추가하여 트립신화를 종료합니다.
세포를 600g에서 실온에서 5분 동안 원심분리한 다음 배지 2에 다시 현탁시킵니다. 이 연구에서 분리된 MC는 알파-SMA, 피브로넥틴 및 비멘틴의 발현이 상당히 높았습니다. 배지 2에서 10일 배양 후 수행된 정제 및 배양된 MC의 면역형광 염색은 세포의 95% 이상이 알파-SMA와 비멘틴을 모두 발현하는 것을 보여주었습니다.
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본 연구는 신장 연구에 중요한 쥐 중간막 세포(MCs)의 분리 및 배양을 위한 최적화된 프로토콜 개발에 중점을 둡니다. 이 방법은 세포 성장과 단백질 발현을 유지하면서 여러 번의 전달, 동결, 부활을 허용합니다.
Efficient isolation and purification of murine glomerular mesangial cells (MCs) directly supports early-stage nephrology research and disease modeling. This optimized protocol accelerates access to high-purity MCs, enabling robust target validation and mechanistic studies in renal pathobiology. The approach reduces cycle time and enhances reproducibility, strengthening predictive confidence for downstream therapeutic discovery.
This protocol positions MC isolation at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless progression from target validation to lead identification in renal disease programs.