컨포칼 현미경을 사용한 살아있는 세포의 미토콘드리아 형태 측정
2025년 7월 3일
이 연구에서는 단계별 프로토콜을 설명하고 샘플 준비, 이미지 획득 및 데이터 분석을 포함하여 살아있는 세포에서 미토콘드리아의 형태학적 특성을 결정하기 위한 주요 세부 사항을 강조합니다. 이 방법은 다양한 조건을 연구하기 위해 미토콘드리아 형태를 검사하는 데 일반적으로 사용됩니다.
우리의 연구는 기초 신경약리학에 중점을 두고 있습니다. 특히 약물 분자가 어떻게 작용하는지 연구합니다. 우리는 파킨슨병에서 잠재적인 약물 화합물과 미토콘드리아 기능 사이의 관계를 이해하는 것을 목표로 합니다.
이전 연구에서는 제조업체 지침에도 불구하고 오랜 실험실 세포 분석 문제를 검토합니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 실험실 세포에서 미토콘드리아 형태를 평가하기 위한 자세한 단계별 프로토콜을 설명했습니다. 우리의 프로토콜은 간단한 미토콘드리아 염색, 형광 이미징 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용합니다.
이를 통해 비용이 절감되고 접근성이 향상되며 전자 현미경과 같은 복잡한 대안보다 사용하기 쉬워집니다. 시작하려면 10% FBS가 보충된 DMEM/F12를 함유한 플라스크에서 성장한 SH-SY5Y 세포의 배양물을 얻습니다. 0.05% 트립신 용액을 사용하여 1분 동안 세포를 분리합니다.
그런 다음 계대하기 전에 세포를 100G에서 3분 동안 원심분리합니다. 다음으로, SH-SY5Y 세포를 1% FBS가 보충된 DMEM/F12 배지에 현탁합니다. 그런 다음 세포를 유리 바닥이 있는 공초점 접시에 씨앗을 뿌리고 밤새 유지합니다.
MPP+자극의 경우, 배양 배지를 1-메틸-4-페닐피리디늄이 포함되거나 포함하지 않는 신선한 배지로 24시간 동안 교체합니다. MitoTracker 염색의 경우 MitoTracker 원액을 예열된 DMEM/F12 배지로 희석하여 50나노몰 작동 농도를 얻습니다. 시술 내내 염색액을 빛으로부터 보호하십시오.
공초점 접시에서 배양 배지를 제거합니다. 신선한 DMEM/F12로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 MitoTracker 작업 용액 1밀리리터를 접시에 피펫팅합니다.
어둠 속에서 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 이제 MitoTracker 작업 용액을 제거하고 DMEM/F12로 접시를 두 번 씻습니다. 마지막 세척 후 각 접시에 DMEM/F12 1밀리리터를 추가합니다.
이미징하기 전에 세포 인큐베이터에서 배양합니다. 이미징을 위해 공초점 현미경을 사전 평형화하려면 획득 패널 아래에서 여기 및 방출 파장을 설정하여 광 경로 매개변수를 조정합니다. 핀홀 크기를 1.2 에어리 단위로, 픽셀 스캔 크기를 1024 x 1024로, 픽셀 체류 시간을 2.4마이크로초로 설정하고 평균 2로 설정합니다.
이제 할로겐 광을 사용하여 개구수가 1.4인 평면 아포크로매틱 60X 대물 렌즈를 사용하여 세포에 초점을 맞추고 광독성을 최소화합니다. 레이저 출력과 고전압을 조정합니다.tage 포화 수준 바로 아래에서. 그런 다음 확대/축소 계수를 3으로 설정하고 이미지를 캡처합니다.
현미경으로 다른 세포에 초점을 맞추기 위해 관심 영역을 이동합니다. 그런 다음 설정을 변경하지 않고 이미지를 캡처합니다. 이진 변환 및 스켈레톤화 전에 이미지 품질을 향상시키려면 먼저 이미지를 엽니다.
ROI 도구를 사용하여 단일 셀의 영역을 선택합니다. 이제 프로세스, 필터, 언샵 마스크 기능을 순차적으로 클릭하여 선명도를 향상시킵니다. 그런 다음 프로세스를 사용하고 대비를 높여 노이즈 증폭을 줄입니다.
프로세스, 필터 및 중앙값 옵션을 클릭하여 소금과 후추 노이즈를 제거합니다. 이미지를 바이너리로 변환하려면 프로세스와 바이너리를 차례로 클릭하고 바이너리 만들기 옵션을 선택합니다. process, binary 및 skeletonize를 클릭하여 바이너리 이미지를 스켈레톤화합니다.
그런 다음 분석을 선택한 다음 스켈레톤 및 스켈레톤 2D 3D 함수 분석을 선택하여 모든 스켈레톤 픽셀을 그룹화합니다. MiNA 도구를 사용하여 골격화된 이미지에서 9개의 설명 매개변수를 계산하여 분석을 단순화합니다. 미토콘드리아 염색의 형광 강도는 MitoTracker 적색 CMXRos 농도가 25나노몰에서 200나노몰로 점진적으로 증가했습니다.
그러나 200나노몰에서는 상당한 세포질 배경 염색이 관찰되었습니다. 미토콘드리아 형태는 염색 후 1시간에 PBS에 비해 DMEM/F12 배지에서 더 잘 보존되었지만 DMEM/F12도 더 높은 배경 형광을 나타냈습니다. 듀얼 프레임 평균화는 단일 스캔 모드에 비해 미토콘드리아 이미징의 신호 대 잡음비를 크게 개선했습니다.
그리고 픽셀 체류 시간을 2.4마이크로초에서 10.8마이크로초로 늘리면 이미지가 더 밝아졌지만 광표백이 발생했습니다. 고전압이 증가하면 배경 소음이 강화되고 레이저 출력이 증가하면 광표백이 발생했습니다. MiNA 도구는 희미한 이미지와 밝은 이미지 모두에 대해 일관된 골격화 출력을 생성했으며, 이는 다양한 형광 강도에 걸쳐 강력한 분할을 나타내며, 밝은 이미지는 희미한 이미지보다 5.5배 더 높은 강도를 나타냅니다.
500마이크로몰에서의 MPP+치료는 처리되지 않은 대조군에 비해 SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아 형태를 파괴하여 미토콘드리아 발자국을 크게 감소시켰습니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
본 연구는 약리학 연구, 특히 파킨슨 병에 관련된 생쥐 SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아 형태를 평가하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 MitoTracker 염색을 사용한 형광 이미징을 통해 접근성과 저렴한 비용을 강조하며, 전자 현미경과 같은 복잡한 기술을 피합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경 약리학
- 미토콘드리아 기능
- 세포 이미징 기술
배경
- 제조업체의 지침에도 불구하고 실험실 세포 분석에서 어려움이 지속됩니다.
- 본 연구는 미토콘드리아 형태 평가를 위한 단계별 프로토콜을 설명하여 이를 해결합니다.
- 연구자들의 비용 절감과 접근성 향상에 중점을 둡니다.
연구 목적
- 생 세포에서 미토콘드리아 형태를 분석하기 위한 재현 가능한 방법을 개발합니다.
- 신경퇴행성 질환에서 약물 화합물과 미토콘드리아 기능 간의 관계를 이해하는 데 도움을 줍니다.
- 간단한 염색 방법과 더 복잡한 이미징 기술의 효과를 비교합니다.
사용된 방법
- 주요 플랫폼으로는 생 세포 배양이 사용됩니다.
- SH-SY5Y 신경모세포종 세포는 약리학적 물질에 대한 미토콘드리아 반응을 검사하기 위한 생물학적 모델로 사용됩니다.
- 이미지 획득에는 형광 현미경 및 데이터 분석을 위한 오픈 소스 소프트웨어가 사용됩니다.
- 주요 단계에는 세포 분리, MitoTracker 염색 및 골격화와 같은 이미지 처리 기술이 포함됩니다.
주요 결과
- 개발된 프로토콜을 통해 미토콘드리아 형태의 시각화 및 분석이 개선되었습니다.
- MPP+ 처리는 대조군과 비교하여 처리된 세포에서 미토콘드리아 구조를 상당히 파괴하는 것으로 나타났습니다.
- 형광 강도와 배경 노이즈는 이미징 품질의 주요 요소입니다.
결론
- 본 연구는 생 뉴런에서 미토콘드리아 형태를 이미징하기 위한 신뢰성 있고 비용 효율적인 접근 방식을 확립합니다.
- 이 방법은 약물 반응, 특히 신경퇴행성 질환 모델에서 미토콘드리아 역학에 대한 이해를 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial morphology in live cells is critical for mechanistic de-risking and target validation in neurodegenerative disease research. This confocal microscopy protocol enables reproducible, cost-effective evaluation of mitochondrial dynamics, supporting predictive confidence in early discovery and translational workflows. The approach facilitates robust comparison of compound effects on mitochondrial structure, directly informing portfolio triage and advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial dynamics as a functional readout for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying morphological changes under pharmacological stress.
- Provides reproducible, quantitative data to inform predictive confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live-cell systems for downstream phenotypic screening of mitochondrial modulators.
- Standardizes imaging and analysis parameters to ensure assay reproducibility and comparability.
- Generates quantitative morphological outputs suitable for compound evaluation and triage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology metrics with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by linking in vitro findings to preclinical endpoints.
- Facilitates biomarker development through robust morphological quantification.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation, supporting iterative hypothesis testing and data-driven decision-making.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial morphology to clarify pathway effects and biological risk.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging outputs for compound screening workflows.
- Analytics: Provides robust, quantitative morphological parameters for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mitochondrial dynamics to disease-relevant phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse cell models and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and confocal microscopy operation.
- Needs access to fluorescence microscopes and open-source image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis parameters.
- Adaptable to various cell models with protocol optimization for each system.
- Careful calibration is necessary to minimize photobleaching and background fluorescence.
