글라이칸 분석을 위한 Microglia의 미토콘드리아 제제

대체로 우리의 연구는 당 또는 글리칸의 기계론적 역할과 노화 및 뇌 장애에서 이러한 세포 및 세포 이하 글리코실화 경로를 활용할 수 있는 방법을 결정하는 데 중점을 두고 있습니다. 현재 뇌졸중 및 알츠하이머병과 같은 급성 및 만성 뇌 질환을 포함한 다양한 질병 병태생리학에서 세포내 글리칸의 역할과 조절에 대한 지식에는 격차가 있습니다. 이 프로토콜과 우리의 연구는 신경면역 상호 작용에서 글리칸의 역할과 해당 정보를 활용하여 더 좋고 효율적인 중추 신경계 치료법을 설계할 수 있는 방법에 대한 지식을 발전시키는 것을 목표로 합니다.

[해설자] 시작하려면 C57BL/6 마우스에서 유래한 BV-2 미세아교세포를 얻습니다. 10% FBS, 1% 페니실린 스트렙토마이신 및 1% 비필수 아미노산이 보충된 DMEM 저포도당 배지에 유지하십시오. T175 플라스크에서 세포가 70-80% 합류에 도달할 때까지 세포를 성장시킵니다. 플라스크에서 매체를 흡인합니다. 세포 펠릿을 1밀리리터의 성장 배지에 재현탁합니다. 트리판 블루를 사용하여 세포를 세십시오. 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브에서 500G에서 세포를 5분 동안 원심분리합니다. 조심스럽게 상청액을 흡인하고 버립니다. 800마이크로리터의 미토콘드리아 분리 시약 A를 넣고 중간 속도로 5초 동안 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에서 정확히 2분 동안 배양합니다. 10마이크로리터의 미토콘드리아 분리 시약 B를 넣고 최대 속도로 5초 동안 소용돌이치게 합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양하고 매분 최대 속도로 소용돌이칩니다. 이제 800마이크로리터의 미토콘드리아 분리 시약 C를 넣고 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 그리고 섭씨 4도에서 10분 동안 700G에서 원심분리합니다. 상청액을 새로운 2밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 15분 동안 3,000G에서 원심분리합니다. 세포질 부분을 포함하는 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿에는 분리된 미토콘드리아가 포함되어 있습니다. 500마이크로리터의 미토콘드리아 분리 시약 C를 펠릿에 첨가하고 12,000G에서 5분 동안 원심분리합니다. 분리된 미토콘드리아를 50마이크로리터의 단백질 분리 완충액에 재현탁합니다. 현탁액을 얼음 위에 20분 동안 그대로 두십시오. 3회 흡인 및 분배한 후 얼음 위에 20분 동안 그대로 두고 사용하기 전에 소용돌이치십시오. 완전히 가용화되지 않은 경우 50마이크로리터의 완충액을 더 추가하고 동일한 튜브에 모으십시오. 13,000 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 회수하고 동결한 후 진공 농축기를 사용하여 건조시킵니다. 방출된 글리칸을 검출하려면 건조 및 결합된 글리칸을 50마이크로리터의 LCMS 등급 물에 재현탁합니다. 5마이크로리터의 재현탁된 미토콘드리아 글리칸을 테프론 마이크로웰 슬라이드의 샘플 스팟에 피펫팅합니다. 60% 아세토니트릴과 1밀리몰 아세트산으로 구성된 전기 스프레이 용매를 분당 2마이크로리터의 유속과 3.2킬로볼트의 전압으로 사용하여 음이온화 모드에서 N-글리칸을 이온화하고 검출합니다. IR-MALDESI를 질량 대 전하 비율 200에서 절반 최대에서 최대 240,000 전체 폭의 분해능으로 설정된 HRAM 질량 분석기에 결합하여 음이온화 모드에서 502,000 질량 대 전하 비율 사이를 분석합니다. 단일 동위원소 질량을 검색하여 N-결합 글리칸을 수동으로 식별합니다. 질량 대 전하 간격을 사용하여 동위원소 분포를 확인하여 초당 1,000개의 최소 이온 플럭스 임계값으로 이중 및 삼중 전하 이온을 결정합니다. 질량 대 전하비에 대한 원시 질량 스펙트럼을 중성 단일 동위원소 질량으로 변환합니다. 그런 다음 단일 동위원소 질량을 온라인 올리고당 구조 예측 도구에 업로드하여 잠재적인 글리칸 구성을 결정합니다. 실험적으로 선별된 글리코 데이터베이스를 사용하여 주석을 확인합니다. 각 식별이 2.5ppm 질량 측정 정확도 마진 이내이고, 코어 및 연결된 글리칸 구조를 포함하고, 펜토스, 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로소닉산 또는 우론산 단당류를 제외하는지 확인합니다. 6개의 독립적인 제제에서 얻은 미토콘드리아 단백질 농도는 유의미한 변화를 나타내지 않아 높은 재현성을 확인했습니다. 서양 혈액 분석에서는 CoxIV가 미토콘드리아 분획에서만 발현되고 GAPDH는 세포질 분획에서만 발현되어 미토콘드리아 분리의 순도와 비미토콘드리아 오염이 없음을 확인했습니다. IR-MALDESI를 사용하여 미토콘드리아 추출물에서 뚜렷한 시알릴화, 인산화 및 황산화 N-글리칸 구조가 검출되었습니다. 적합도를 테스트한 높은 제곱 값은 1개 및 2개의 염소 부가물이 있는 N-결합 글리칸의 검출을 확인했으며, IR-MALDESI를 사용하여 이러한 글리칸 조성의 검출을 확인했습니다.