DNA Microarray Chip Method에 의한 Mycobacterium 종 동정

[해설자] 이 연구는 임상 미생물학의 분자 진단에 중점을 둡니다. 기존 검출 방법에 비해 마이코박테리움 종을 식별하기 위한 DNA 마이크로어레이 칩 방법은 매우 민감하고 특이적이며 신속하여 임상 환자의 조기 진단에 중요한 도움을 제공할 수 있습니다. 현재 비결핵성 마이코박테리아에 대한 신속한 식별 방법은 많은 풀뿌리 실험실에서 제한되어 있으며 이는 환자의 임상 진단 및 치료에 직접적인 영향을 미칩니다. 시작하려면 항온 수조의 온도를 섭씨 50도로 설정하고 예열하십시오. 칩을 준비하려면 유전자 마이크로어레이 칩 혼성화 상자 바닥에 200마이크로리터의 증류수를 추가합니다. 상자 내부의 두 위치 기둥 사이에 브래킷을 놓습니다. 앞면이 위로 향하도록 칩을 브래킷에 조심스럽게 놓고 커버 슬립으로 덮어 4개의 보스가 아래를 향하도록 하여 커버 슬립의 끝이 칩 끝의 라벨과 정렬되도록 합니다. 다음으로, 샘플 수에 따라 200마이크로리터 원심분리기 튜브 또는 8개의 웰 스트립을 준비하고 적절하게 라벨을 붙입니다. 키트의 혼성화 완충액이 완전히 녹을 때까지 섭씨 50도에서 가열합니다. 완전히 혼합한 후 마이크로 원심분리기에서 빠르게 원심분리합니다. 9마이크로리터의 혼성화 완충액을 준비된 각 튜브 또는 스트립에 분취합니다. 각 튜브에 6마이크로리터의 해당 PCR 산물을 추가하여 반응 혼합물당 15마이크로리터의 최종 부피를 만듭니다. 혼성화 반응 혼합물을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열하여 PCR 기기 또는 수조를 사용하여 변성시킵니다. 변성 처리 후 즉시 혼합물을 얼음물 혼합물에 담그고 3분 동안 배양합니다. 얼음 수조에서 혼성화 반응 혼합물을 제거하고 위아래로 두 번 피펫팅하여 혼합합니다. 흰색 응집성 침전물이 남아 있지 않으면 커버 슬립의 로딩 구멍을 통해 13.5마이크로리터의 반응 혼합물을 추가합니다. 하이브리드화 상자를 빠르게 덮고 밀봉하고 칩 번호, 마이크로어레이 위치 및 샘플 번호를 기록합니다. 이제 밀봉된 하이브리드화 상자를 섭씨 50도로 예열된 항온 수조에 수평으로 놓습니다. 모든 상자를 안에 넣은 후 120분 동안 타이머를 시작합니다. 하이브리드화 반응이 완료되면 하이브리드화 상자를 수평으로 꺼내 분해한 후 칩을 회수합니다. 즉시 칩을 실온으로 평형화된 칩 세척액 I이 채워진 용기 안의 슬라이드 랙에 놓고 상온에서 3분 동안 항온 셰이커에서 80-100RPM으로 세척합니다. 실온에서 3분 동안 80-100RPM으로 설정된 셰이커에서 칩 세척액 II로 칩을 다시 세척합니다. 이제 칩을 원심분리기에 넣고 실온에서 5분 동안 100g으로 회전시킵니다. 스캐너를 켭니다. 그런 다음 해당 소프트웨어를 엽니다. 레이저 제어 버튼을 클릭하여 10분 동안 예열합니다. 샘플 관련 정보를 소프트웨어에 입력합니다. 스캐너 예열이 완료되면 꺼내기 버튼을 클릭합니다. 마른 칩을 작은 브래킷 조각에 꾸준히 놓습니다. 칩을 스캐너 칸에 부드럽게 수평으로 밀어 넣고 로드 버튼을 클릭합니다. 이제 칩 번호를 소프트웨어에 입력하고 클릭하여 감지 영역 마이크로어레이 1에서 4를 선택합니다. Select Sample(샘플 선택)을 클릭하여 각 마이크로어레이에 해당하는 샘플을 선택합니다. 그런 다음 감지 시작을 클릭하여 칩 스캔을 시작합니다. 스캔 결과가 화면에 표시되고 자동으로 저장됩니다. 데이터 쿼리 페이지를 사용하여 데이터 쿼리 및 인쇄 작업을 수행합니다. 모든 작업을 완료한 후 레이저를 끄고 소프트웨어를 종료한 다음 마지막으로 스캐너를 끕니다. 실험 결과의 타당성은 양성 대조군은 마이코박테리움 결핵 복합체의 검출 결과를 산출하고 음성 대조군은 마이코박테리움을 산출하지 않는 품질 관리에 의해 확인됩니다. 테스트 샘플의 해석은 신호 값이 가장 높은 프로브를 포함하여 모든 프로브가 음성인 경우 마이코박테리움이 없다는 보고를 받는 경우부터 시작됩니다. 마이코박테리움 결핵 복합체 프로브만 강한 신호를 보이는 샘플에서 결과는 해당 종 그룹에 대해 양성으로 식별됩니다. 마이코박테리움 아비움에 해당하는 프로브가 강한 신호를 가진 유일한 프로브인 경우 샘플은 마이코박테리움 아비움에 대해 양성으로 식별됩니다. 내부 대조군 프로브만 양성이고 나머지는 모두 음성인 경우 결과는 불확실한 것으로 보고되어 검출 키트에서 다루지 않는 마이코박테리움 종의 존재를 나타냅니다.